劉冰賢，曾綺雯，陳漢明，龐聰穎，劉瑩煒，楊必婧，易江南，黎遠亮，黎揚威，唐兆新，李 英，張 輝

(華南農業(yè)大學獸醫(yī)學院，廣州 510642)

氟是存在于人和動物體內的一種重要微量元素，主要分布于骨骼和牙齒[1]。長期接觸暴露在空氣、食物、水中的氟會導致氟中毒[1-2]，引起氟斑牙和氟斑骨癥[3]，甚至腎、肝、腸、腦、肺的炎癥和變性[4]。肝毒性是氟化物主要的毒性作用之一，可導致肝廣泛的退行性病變，最終降低肝的解毒功能。Wang等[5]發(fā)現(xiàn)NaF誘導了線粒體損傷，體內活性氧(reactive oxygen species,ROS)急劇升高進一步促進了肝毒性和細胞損傷。

氧化應激(oxidative stress,OS)所致的氧化-抗氧化狀態(tài)失衡，是氟化物誘導肝毒性的首要因素[6]。細胞氧化還原狀態(tài)的異常失衡會產生過氧化物和自由基，進而導致細胞的蛋白質、脂質和核酸被破壞。氟化物可以直接干擾氧代謝，導致細胞活性氧增加。ROS蓄積導致線粒體中的細胞色素C(cytochrome C,Cytc)釋放到細胞質，Cytc激活凋亡通路相關蛋白的表達[7-8]。

抗氧化系統(tǒng)的存在維持著ROS的平衡，谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)是體內重要的抗自由基的酶，保護生物膜免受氧化損傷[9-10]，硒是GSH-Px的重要組成成分和活性中心，決定著該酶的活性，即清除自由基的能力。氟化物進入體內會抑制GSH-Px的活性，硒可通過糾正自由基平衡、脂質代謝紊亂以及抑制氟誘導的脂質過氧化，拮抗氟中毒引起的細胞損傷。納米硒顆粒由于其獨特的生物活性和低毒性，在不同的小鼠試驗模型中被用作保護劑。但關于納米硒減輕氟毒性作用的研究相對較少，其與自噬和凋亡相關的機制和生物學功能也有待進一步研究。因此，本研究旨在探討肝細胞凋亡以及納米硒對氟致肝細胞損傷的作用，以闡明硒抑制慢性氟中毒致肝細胞凋亡機制。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

本研究所使用的40只28日齡健康昆明小鼠(雌雄各半，25 g±2 g)，由南方醫(yī)科大學(廣州)實驗動物中心提供。

1.2 主要試劑與儀器

納米硒(Nano-Se)購自上海Macklin生化有限公司(純度≥99%，平均粒徑40 nm)。氟化鈉(NaF)(麥克林，上海，AR,99%)。小鼠單克隆抗體Active Caspase-3(RLM3431，睿瀛生物)、Cyt-C(382867，正能生物)和多克隆抗體GAPDH購自正能生物，2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix和BCA蛋白檢測試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司;PAGE凝膠快速制備試劑盒(12.5%)購自上海雅酶生物科技有限公司。

LightCycler480型熒光定量PCR儀,購自美國Bio-Rad公司；DM1000型光學顯微鏡,購自廣州德真科學儀器有限公司。

1.3 試驗設計與動物飼養(yǎng)管理

40只昆明小鼠適應性飼養(yǎng)7 d后，被隨機分為4組(n=10)，對照組(Control)，氟化鈉組(NaF)，納米硒組(Nano-Se)，納米硒治療組(NaF+Nano-Se)。通過灌胃的方式每天每組分別給予24 mg·kg-1氟化鈉，1 mg·kg-1納米硒以及 24 mg·kg-1氟化鈉和1 mg·kg-1納米硒。此外，對照組小鼠灌胃等量的生理鹽水。

動物試驗在華南農業(yè)大學實驗動物中心進行，動物房溫度為23 ℃±2 ℃，相對濕度50%～60%，每天光照12 h。整個試驗周期為28 d，期間所有小鼠均自由采食、飲水。每天記錄小鼠的精神狀態(tài)，精神沉郁、死亡等現(xiàn)象均判定為非正?，F(xiàn)象。

1.4 病理切片

試驗進行的第28天，將所有小鼠脫頸致死并取其肝。將一部分肝組織置于4%多聚甲醛中固定48 h，乙醇梯度脫水，石蠟包埋，切片，進行HE染色。37 ℃干燥12 h，蘇木精/伊紅染色，封片后在光鏡下觀察。其余肝樣本-80 ℃保存，用于后續(xù)分析。

1.5 TUNEL染色檢測肝細胞凋亡

石蠟切片用二甲苯和乙醇脫蠟，37 ℃下用蛋白酶K(20 μg·mL-1)消化15～30 min。37 ℃下用TdT和dUTP(1∶9)孵育1 h，PBS洗滌3次。DAPI(4’,6-二脒基-2-苯基吲哚)染色，熒光顯微鏡下觀察。使用Image-Pro?Plus 6.0計算陽性細胞核的值。

1.6 RT-PCR檢測凋亡相關基因表達水平

提取肝組織總RNA并測定其純度與濃度，再根據(jù)PrimeScript?RT試劑盒說明將RNA反轉錄成cDNA，最后參考SYBR?PrimeScriptTMRT-PCR試劑盒說明測定凋亡相關基因mRNA表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Reference sequences

1.7 Western blot檢測凋亡相關蛋白表達水平

提取肝組織蛋白，BCA試劑盒測定總蛋白濃度，用SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳) Loading Buffer將其稀釋至同一濃度，并煮沸。SDS-PAGE電泳分離蛋白樣品，轉膜，5%脫脂奶粉封閉。一抗于4 ℃搖床孵育過夜，用TBST洗滌3次后，二抗孵育1 h，TBST洗凈二抗，ECL顯色。用Image J (National Institutes of Health,America)計算蛋白條帶的灰度值。

1.8 免疫熒光

肝組織石蠟切片脫蠟至水，再將切片置于盛滿檸檬酸抗原修復液的修復盒中，于微波爐內進行抗原修復。BSA封閉后，一抗4 ℃孵育過夜、二抗孵育1 h，DAPI避光孵育，PBS洗滌3次后，樹脂封片，熒光顯微鏡觀察。

1.9 數(shù)據(jù)分析

2 結 果

2.1 納米硒改善氟化鈉的毒性作用及其誘導的細胞凋亡

氟化鈉處理7 d 后，小鼠臨床表現(xiàn)為精神沉郁，食欲不佳，飲水量減少，不喜活動。納米硒處理組小鼠精神狀態(tài)良好，部分表現(xiàn)活躍。結果表明，納米硒在一定程度上能改善氟化鈉引起的臨床癥狀。

如圖1A所示，對照組和納米硒組小鼠肝細胞排列緊密而整齊，無明顯結構損傷。相比之下，氟化鈉處理組小鼠肝細胞排列紊亂并且出現(xiàn)腫脹、顆粒變性、空泡變性，甚至核碎裂、溶解的現(xiàn)象。然而，經過納米硒治療后，氟化鈉誘導的肝細胞凋亡現(xiàn)象有所改善。

如圖1B、D所示，對照組和納米硒組肝細胞未見明顯凋亡，Tunel陽性細胞極少。相反，氟化鈉處理組肝細胞凋亡明顯增加。由圖1C可知，氟化鈉處理后小鼠肝細胞Tunel陽性比例顯著高于對照組(P<0.01)，而添加納米硒后細胞凋亡率降低，并且可以看出納米硒處理對氟化鈉誘導的細胞凋亡有一定的緩解作用，兩組之間具有差異顯著性(P<0.05)。

A.小鼠肝組織病理切片(HE染色)；B.TUNEL染色觀察凋亡細胞(400×)，使用Image Pro plus 6.0計算TUNEL陽性值，TUNEL陽性(綠色，見OSID開放科學數(shù)據(jù)與內容)，DAPI核染色(藍色，見OSID開放科學數(shù)據(jù)與內容)；C.TUNEL陽性的百分比，對照組(Control)，氟化鈉組(NaF,納米硒組(Nano-Se)，納米硒治療組(NaF+Nano-Se)，*.P ≤ 0.05,**.P ≤ 0.01；D.高倍鏡下的凋亡細胞，40×A.Histopathological sections of mouse liver (HE staining);B.liver apoptosis was done by TUNEL assay(400×),TUNEL positive (green，see color pictures in open scientific data by scaning OSID code) and DAPI core staining (blue，see color pictures in open scientific data by scaning OSID code);C.Percentage of TUNEL positive calculated by Image Pro plus 6.0,*.P ≤ 0.05,**.P ≤ 0.01;D.Apoptotic cells under high magnification,40×圖1 納米硒改善氟化鈉誘導的細胞凋亡Fig.1 Nano selenium improves sodium fluoride induced apoptosis

2.2 細胞凋亡線粒體途徑的關鍵因子Cyt-C的表達

如圖2A、B免疫染色顯示，氟化鈉組Cyt-C蛋白表達顯著高于對照組和納米硒處理組(P<0.01)，且納米硒治療組抑制了Cyt-C表達的升高。此外，RT-qPCR和Western blot 結果顯示，與對照組相比氟化鈉組Cyt-C表達升高，而納米硒治療組肝細胞Cyt-C表達量低于氟化鈉組(圖2C、D)。

A、B.免疫熒光評估Cyt-C的表達量(400×)；C.Western blot定量蛋白Cyt-C的表達量；D.RT-qPCR評估凋亡相關基因的轉錄情況A,B.Cyt-C expression evaluated by immunofluorescence was evaluated (400×);C.Cyt-C protein expression evaluated Western blot;D.Transcription of apoptosis-related genes evaluated by RT-qPCR圖2 免疫熒光、Western blot及RT-qPCR方法評估Cyt-C的表達情況Fig.2 Cyt-C expression evaluated by immunofluorescence，Western blot and RT-qPCR

2.3 凋亡相關蛋白、基因的表達情況

凋亡相關基因的表達情況如圖3所示，與對照組相比，氟化鈉處理組Caspase-3、Caspase-9以及P53基因的表達上調，但差異不顯著(P>0.05)，加入納米硒治療后，其表達量下降。如圖4所示，P53蛋白和Caspase-3在氟化鈉處理組中表達量較高，加入納米硒治療后其表達量減少。Bcl-2和Bax分別是Bcl-2家族中最主要的抑制凋亡和促凋亡蛋白，Bcl-2/Bax表達比例與凋亡發(fā)生發(fā)展密切相關。氟化鈉處理組Bcl-2/Bax的表達水平較對照組下降，說明氟化鈉可以誘導肝細胞凋亡的增加，而加入納米硒治療后，其比值有所回升。

圖3 凋亡相關基因的相對轉錄水平Fig.3 Relative transcription levels of apoptosis-related genes

圖4 凋亡相關蛋白的表達水平Fig.4 Expression levels of apoptosis-related proteins

3 討 論

氟化物在自然環(huán)境中廣泛存在，長期暴露于氟環(huán)境下會對機體產生一定的毒性作用，表現(xiàn)為慢性氟化骨癥和氟化牙[11]以及非骨相器官的損傷[12]，并可引起明顯的肝病理損傷[13]并伴隨細胞凋亡現(xiàn)象[14]。本研究結果表明，氟化鈉處理1周后小鼠的精神狀態(tài)明顯下降，精神萎靡，不喜活動，而納米硒則有效改善了小鼠的精神狀態(tài)。同時，作者通過肝病理切片發(fā)現(xiàn)氟化鈉處理小鼠的肝細胞排列紊亂，并出現(xiàn)腫脹、空泡變性，甚至核碎裂、溶解的現(xiàn)象，而納米硒治療能在一定程度上緩解氟化鈉所致的肝損傷。為了進一步探究氟化鈉的肝毒性作用，作者利用TUNEL染色評估肝細胞凋亡水平，發(fā)現(xiàn)氟化鈉處理組小鼠肝細胞TUNEL陽性率相較于對照組顯著升高(P<0.01)，而添加納米硒治療后凋亡陽性率呈現(xiàn)下降趨勢。

氟誘導的病理損傷機制與自由基水平升高有關，主要表現(xiàn)為自由基代謝紊亂、抗氧化能力下降和氧化應激水平升高[15]。氟不僅可以直接攻擊氧，產生氧自由基，還可以攻擊抗氧化酶，抑制其活性，增加氧自由基的含量，進一步導致脂質過氧化和細胞死亡[16-17]。線粒體是ROS產生的主要場所，也是氧化應激誘導損傷的重要靶點[18]；ROS積累會導致線粒體呼吸鏈受損[19]，主要表現(xiàn)為DNA損傷和ATP生成減少[20]。除此之外，線粒體功能的維持也取決于Bcl-2/Bax的比例，它在保持線粒體膜的完整性方面起著重要作用[21-22]，調控線粒體外膜各種通道的開放程度，是細胞凋亡調控的中心[23]。作者發(fā)現(xiàn)氟化鈉處理后Bcl-2/Bax的比值較對照組下降，這暗示凋亡的發(fā)生以及線粒體功能受損，線粒體膜的完整性遭到破壞，膜電位下降，線粒體外膜通透性改變使得Cyt-C釋放至細胞質[24-25]。作者通過免疫熒光、Western blot以及RT-qPCR均檢測到Cyt-C的表達水平顯著升高。Cyt-C是細胞凋亡線粒體調控途徑的關鍵因子，與細胞凋亡激活因子Apaf-1結合激活Caspase-9前體并激活Caspase-3引起級聯(lián)反應最終發(fā)生細胞凋亡。從作者的研究結果來看，氟化鈉處理后Caspase-9及Casepase-3基因的表達水平顯著升高，Western blot結果也表明其蛋白水平也在氟化鈉處理后上調。以上結果表明氟化鈉誘導的肝損傷作用是通過線粒體途徑調控肝細胞的凋亡實現(xiàn)。

圖5 納米硒調控NaF誘導肝細胞凋亡模型Fig.5 Nano-selenium regulates NaF induced hepatocyte apoptosis model

硒是一種抗氧化劑，是谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)的重要組成部分，而納米硒由于其獨特的生物活性被廣泛用于臨床試驗。硒可以緩解氟中毒引起的抗氧化能力下降并且通過清除氧自由基緩解氟暴露引起的細胞損傷[26]。氟中毒引起的肝損傷以抗氧化能力異常導致的肝細胞凋亡為特征，這可能是由于氟暴露增加了氧自由基水平，導致脂質過氧化，抗氧化酶的活性下降，促進肝細胞凋亡。

細胞凋亡和氧化途徑是氟致肝、腎損傷的重要細胞分子機制。硒緩解氟誘導的細胞損傷與其抗氧化能力密切相關[5，27-28]。作者發(fā)現(xiàn)，納米硒處理提高了肝細胞的抗氧化能力，減輕氟誘導的氧化應激，抑制細胞凋亡信號通路轉導以及調控凋亡相關基因的表達，如Caspase-3、Caspase-9等，減輕了細胞凋亡的程度。此外，作者比較Cyt-C在不同處理組的表達情況發(fā)現(xiàn)納米硒處理組小鼠Cyt-C的表達水平下降，且凋亡通路相關蛋白的表達也呈下降趨勢。因此，推測納米硒通過調控線粒體凋亡途徑關鍵因子Cyt-C來調節(jié)細胞凋亡進程從而保護肝細胞免受氟化鈉誘導的細胞損傷。硒通過促進氟化物的去除、修復脂質過氧化和增強自氧化作用來誘發(fā)氟中毒的拮抗作用[5]。特別是硒對氟化物產生抗氧化作用，減輕氟化物對肝的毒性作用，以此來抑制細胞凋亡[29]。

4 結 論

氟化鈉通過調控線粒體途徑誘導細胞凋亡所致的小鼠肝細胞損傷，1 mg·kg-1納米硒則通過調控Cyt-C緩解細胞凋亡進程，減輕氟化鈉的毒性作用，提示線粒體途徑可能是納米硒對氟中毒干預作用的方式之一。