姜 敏，姚大偉，田 睿，毛 立，史超穎，李文良，張紋紋，李基棕，楊蕾蕾，孫 敏，楊德吉*，劉茂軍*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，南京 210095；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所/農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210019；3.南京艾貝爾動(dòng)物醫(yī)學(xué)中心，南京 210046)

綿羊肺炎支原體(Mycoplasmaovipneumoniae，Mo)可引起綿羊和山羊間質(zhì)性肺炎，主要表現(xiàn)為咳嗽、流鼻涕、發(fā)熱、漸進(jìn)性消廋[1-2]。該病一年四季均可發(fā)生，以秋冬季為主，應(yīng)激等其他誘因使羊免疫力下降，Mo可趁機(jī)感染機(jī)體[3]，目前，該病已經(jīng)成為嚴(yán)重危害全球養(yǎng)羊業(yè)的重要疾病之一。臨床上許多疾病的臨床癥狀及病理表現(xiàn)都與羊支原體肺炎相似，對(duì)于該病的診斷主要依據(jù)臨床癥狀和分子生物學(xué)及免疫學(xué)的檢測(cè)[4]，但是這些診斷方法耗時(shí)較長(zhǎng)，而且對(duì)于判斷病程轉(zhuǎn)歸、指導(dǎo)臨床治療的價(jià)值有限。計(jì)算機(jī)斷層掃描(computed tomography，CT)被認(rèn)為是評(píng)估人肺部疾病的金標(biāo)準(zhǔn)[5]，有較高的密度分辨力，可以更好地顯示病變的位置、大小、范圍及性質(zhì)，另外更有利于判斷病程的轉(zhuǎn)歸，在早期發(fā)現(xiàn)、診斷過(guò)程及治療都存在著重大的意義。近年來(lái)，CT在小動(dòng)物肺部疾病的診斷中越來(lái)越廣泛[6-7]，國(guó)外早在2005、2007年就有了關(guān)于CT在反芻動(dòng)物肺部疾病中應(yīng)用的相關(guān)報(bào)道[8-9]。迄今為止，國(guó)內(nèi)鮮有關(guān)于羊肺部疾病的CT影像診斷研究。本研究人工感染山羊肺炎支原體，誘發(fā)山羊支原體肺炎，結(jié)合病理解剖學(xué)和組織病理學(xué)變化研究山羊支原體肺炎的CT影像學(xué)特征，以期為臨床上羊肺部疾病的影像學(xué)診斷提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 支原體

綿羊肺炎支原體IK3-3株(CVCC380)，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心。

1.2 主要儀器設(shè)備和試劑

聯(lián)影醫(yī)療uCT510立體等像素16層螺旋CT掃描儀(聯(lián)影)，速眠新、蘇醒靈(拜特醫(yī)藥)，異氟烷(河北一品制藥)，綿羊肺炎支原體間接血凝診斷試劑盒(中國(guó)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)所)，KM2液體培養(yǎng)基：MEM培養(yǎng)基(Gibco，Thermo Fisher Scientific)55 mL，1.7%水解乳蛋白Hank’s緩沖液35 mL，25%酵母浸液2 mL，健康馬血清10 mL，1%醋酸鉈溶液1 mL，青霉素200 IU·mL-1，0.4%酚紅0.18 mL，調(diào)整pH至7.4～7.8。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

20只山羊購(gòu)自江蘇句容某養(yǎng)殖場(chǎng)，體重在30～40 kg，臨床及影像學(xué)檢查均無(wú)異常，經(jīng)綿羊肺炎支原體間接血凝診斷試劑盒檢測(cè)陰性。

1.4 綿羊肺炎支原體的制備

將綿羊肺炎支原體IK3-3株按1∶10比例接種KM2液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)，待培養(yǎng)物變黃后，傳代擴(kuò)大培養(yǎng)，待培養(yǎng)物變黃后，按顏色變化單位(cell culture unit,CCU)測(cè)定支原體含量，收獲備用。

1.5 人工感染綿羊肺炎支原體

20只羊隨機(jī)分為兩組，對(duì)照組C(n=5)和試驗(yàn)組E(n=15)。試驗(yàn)組每只羊氣管內(nèi)注射接種5 mL綿羊肺炎支原體IK3-3株(107CCU·mL-1)，對(duì)照組接種5 mL的無(wú)菌生理鹽水。接種完畢后肌注與速眠新等劑量蘇醒靈使羊蘇醒。兩組羊隔離飼養(yǎng)，每日早上09:00觀察兩組羊臨床癥狀，測(cè)量直腸體溫。

1.6 CT檢查

對(duì)照組與試驗(yàn)組分別于人工接種前和接種后第7、14、21、28天進(jìn)行CT掃查。檢查前所有羊禁食24 h，禁水2 h。肌內(nèi)注射速眠新(0.1 mg·kg-1)進(jìn)行誘導(dǎo)麻醉，采用面罩進(jìn)行異氟烷維持麻醉，于掃描床上俯臥位保定，頭朝向掃描機(jī)架，進(jìn)床掃描。使用聯(lián)影醫(yī)療uCT510立體等像素16層螺旋CT掃描儀進(jìn)行胸部掃查，掃查參數(shù)為電壓140 kV，電流20 mA，螺旋掃描方式，層厚1.2 mm，層距0.6 mm，矩陣512 × 512。檢查結(jié)束后，肌注與速眠新等劑量蘇醒靈使羊蘇醒。應(yīng)用HOROS軟件對(duì)掃描獲得的CT影像進(jìn)行讀片、分析。圖像重建肺窗(WW 1400，窗位WL- 500)，縱膈窗(WW 350，窗位WL 40)，

1.7 病理學(xué)檢查

感染后第29天切斷頸動(dòng)脈處死，剖檢觀察病理解剖學(xué)變化。選擇病變明顯的肺葉，手術(shù)刀切取小塊病變和健康交界處的肺組織，置于4%甲醛溶液進(jìn)行固定，制備常規(guī)石蠟切片，HE染色，顯微鏡下觀察組織病理學(xué)變化。

1.8 病料中支原體分離、鑒定

羊剖殺后，參考孫喜安[10]的方法，分離培養(yǎng)并鑒定支原體。取肺病健交接部位，至少選擇3個(gè)取樣點(diǎn)，在研缽中加入2 mL KM2培養(yǎng)基；將病料剪碎研磨，過(guò)濾，將濾液按1∶5比例接種培養(yǎng)基，37 ℃ 培養(yǎng)3～4 d。分離培養(yǎng)物用細(xì)菌基因提取試劑盒提總基因組DNA。根據(jù)HSP70基因設(shè)計(jì)PCR鑒定引物MoHSP70-F：5′-ATGAAAGGAAAACATAATATGGC-3′，Mo HSP70-R：5′-TTAGTT- TTGTTTGATTTCAGCAT- 3′，目的片段1 815 bp。PCR反應(yīng)體系：2 × T5 Super PCR Mix 10 μL，上下游引物各1 μL，基因組DNA 1 μL，補(bǔ)水至20 μL。PCR條件：94 ℃ 4 min；94 ℃ 20 s，50 ℃ 20 s，72 ℃ 90 s，30循環(huán)，72 ℃ 7 min；4 ℃保存。PCR產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

2 結(jié) 果

2.1 肺炎支原體感染后臨床癥狀觀察

對(duì)照組羊感染后未見(jiàn)咳嗽、噴嚏及眼鼻分泌物等臨床癥狀。試驗(yàn)組羊接種綿羊肺炎支原體后，按照臨床癥狀可分為重癥、中癥和輕癥。重癥羊4只，在感染后第3～4天普遍出現(xiàn)食欲減退的表現(xiàn)，體溫升高(41～42 ℃)，感染后7 d出現(xiàn)噴嚏及咳嗽等癥狀，第14天出現(xiàn)打噴嚏、咳嗽，眼鼻分泌物增多等較為嚴(yán)重的呼吸道癥狀，并持續(xù)到第21天，之后逐漸減輕。中癥羊感染7 d后，體溫一過(guò)性升高(40～41 ℃) 之后正常，并有輕微咳嗽、流漿液性鼻液和腹瀉等癥狀，21 d后無(wú)異常臨床癥狀。輕癥羊感染后體溫正?；蛞灾械蜏貫橹?，偶爾略微升高，僅表現(xiàn)流漿液性鼻液或膿性鼻液。另5只無(wú)癥狀，鼻拭子經(jīng)綿羊肺炎支原體間接血凝診斷試劑盒檢測(cè)，判為未感染。

表1 羊支原體肺炎臨床癥狀Table 1 Clinical manifestations of sheep mycoplasma pneumonia

2.2 CT檢查表現(xiàn)

對(duì)照組羊CT影像如圖1所示(圖像的左側(cè)為身體的右側(cè)，上方為身體的背側(cè))。在接種前、感染后第7、14、21、28天對(duì)照組CT影像均未發(fā)現(xiàn)異常。雙側(cè)肺紋理清晰，未見(jiàn)異常密度影，氣管、支氣管通暢，支氣管周圍未見(jiàn)異常密度影。肺門(mén)、縱隔未見(jiàn)腫大淋巴結(jié)影。雙側(cè)胸膜平滑，無(wú)增厚，胸膜腔未見(jiàn)積液征。

圖像的左側(cè)為身體的右側(cè)，上方為身體的背側(cè)The left side of the image is the right side of the body,and the top is the back side of the body圖1 對(duì)照組羊第7、14、21和28天胸部CT影像Fig.1 CT images of sheep in control group at day 7,14,21 and 28 during the experiment

重癥組羊CT影像如圖2所示，感染初期(第7天)多見(jiàn)各肺葉呈現(xiàn)片狀的磨玻璃密度影(白色箭號(hào))，肺紋理紊亂增粗，部分肺葉出現(xiàn)大片實(shí)變影(白色箭頭)；中后期(第14～21天)整體肺野密度增高，支氣管血管周圍間質(zhì)增厚，出現(xiàn)邊緣模糊的高密度“鞘”狀結(jié)構(gòu)(黑色箭號(hào))；有的羊可見(jiàn)大片炎癥滲出所致的空氣支氣管征(黑色箭頭)；胸膜滲出，表現(xiàn)條帶狀的增厚影(白色三角形)。第28天胸部影像較第21天無(wú)明顯變化。

中癥組羊CT影像如圖3所示，感染初期(第7天)整體肺葉密度變化不大，右側(cè)中葉支氣管周圍、右側(cè)肺葉出現(xiàn)部分小片狀的磨玻璃密度影(白色箭號(hào))。感染中期(第14天)右肺中葉支氣管出現(xiàn)相平行的兩條線狀高密度“軌道征”及“印戒征”(白色箭頭)，提示支氣管壁增厚；雙側(cè)后葉前部小葉間間質(zhì)增厚，呈現(xiàn)網(wǎng)狀/線狀的不透明影(黑色箭號(hào))，右后葉出現(xiàn)平行于胸壁的胸膜下線(黑色箭頭)。感染后期(第21天)病灶基本吸收，肺野密度大體恢復(fù)正常。第28天影像已無(wú)異常。

輕癥組羊CT影像如圖4所示，感染初期(第7天)可見(jiàn)部分肺葉出現(xiàn)小片狀的磨玻璃密度影(白色箭號(hào))，雙肺后葉出現(xiàn)由于細(xì)支氣管擴(kuò)張導(dǎo)致的“樹(shù)芽征”(白色箭頭)，右側(cè)后葉后段出現(xiàn)沿著胸壁的線狀紊亂影像(黑色箭號(hào))。感染中期(第14天)磨玻璃密度影和“樹(shù)芽征”基本消失，感染第7天掃描所見(jiàn)的右側(cè)后葉后段的線狀紊亂影已發(fā)展為胸膜下線(黑色箭頭)。感染后期(第21天)影像已無(wú)異常。

2.3 CT影像數(shù)據(jù)分析

羊支原體肺炎CT影像分析結(jié)果如表2所示，試驗(yàn)組中10只羊肺部出現(xiàn)異常影像，其中，單側(cè)肺葉病變3只，雙側(cè)肺葉病變7只，右前葉病變10只，右中葉病變5只，右后葉病變8只，左前葉病變5只，左后葉病變6只，副葉病變4只。主要以磨玻璃影為主，多表現(xiàn)為間質(zhì)性肺炎，好發(fā)于右前葉，重癥組多見(jiàn)支氣管壁增厚，空氣支氣管征和網(wǎng)格狀影。

表2 羊支原體肺炎CT影像數(shù)據(jù)分析Table 2 CT data analysis of sheep mycoplasma pneumonia

2.4 病理剖檢

試驗(yàn)組羊剖檢如圖5所見(jiàn)。打開(kāi)胸腔可見(jiàn)部分肺與胸膜發(fā)生粘連(白色三角形)。肺有不同程度的粉色肉變(黑色箭號(hào))和肝變(白色箭號(hào))，肺與胸壁發(fā)生粘連。局部有明顯的結(jié)節(jié)(白色箭頭)出血點(diǎn)和出血斑，病變區(qū)域突出于肺表面，質(zhì)地堅(jiān)硬，用手觸摸有粗糙感，顏色呈暗紅色或粉紅色。肺間質(zhì)明顯增寬，表面呈大理石紋路病變(黑色箭頭)，病變區(qū)域和健康區(qū)域有明顯界限。

2.5 病理組織學(xué)檢查

試驗(yàn)組羊病理組織學(xué)檢查結(jié)果如圖6所示?？梢?jiàn)不同程度的支氣管肺炎及間質(zhì)性肺炎，與CT影像表現(xiàn)一致。細(xì)支氣管黏膜上皮增生，周圍巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，管腔內(nèi)有漿液性滲出，混有大量的中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和脫落的上皮細(xì)胞(圖6A)；肺局部見(jiàn)膿腫病灶(圖6B)，肺泡腔及間質(zhì)內(nèi)見(jiàn)大量壞死的中性粒細(xì)胞；肺泡結(jié)構(gòu)部分破壞(圖6C)；肺泡壁與間隔有中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)(圖6D)。小血管周圍淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，毛細(xì)血管充血、淤血。

白色箭號(hào).磨玻璃密度影；黑色箭號(hào).“鞘”狀影；白色箭頭.實(shí)變影；黑色箭頭.空氣支氣管征；白色三角形.胸膜增厚影White arrow.Ground-glass opacity；Black arrow.“Sheath”shape；White arrowhead.Consolidation shadows；Black arrowhead.Air bronchogram；White triangle.Thickening of the pleura圖2 支原體肺炎重癥組羊第7、14、21和28天胸部CT影像Fig.2 CT images of sheep mycoplasma pneumonia in severe group at day 7,14,21 and 28 during the experiment

2.6 支原體分離、鑒定

從試驗(yàn)組感染成功羊的肺部采集的病料，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)及PCR檢測(cè)，擴(kuò)增到1 815 bp目的片段(圖7)，與預(yù)期理論大小一致，說(shuō)明試驗(yàn)組羊感染了綿羊肺炎支原體。

白色箭號(hào).磨玻璃密度影；黑色箭號(hào).線狀影；白色箭頭.樹(shù)芽征；黑色箭頭.胸膜下線White arrow.Ground-glass opacity；Black arrow.Linear disorder；White arrowhead.Tree-in-bud；Black arrowhead.Subpleural line圖4 支原體肺炎輕癥組羊第7、14天CT影像Fig.4 CT images of sheep mycoplasma pneumonia in mild group at day 7,14 during the experiment

3 討 論

支原體感染動(dòng)物機(jī)體后常引起慢性或潛伏感染，造成慢性消耗性疾病，并且常引起其他繼發(fā)性疾病，發(fā)病率和死亡率增加[11-12]。Mo感染后細(xì)胞因子能夠激活內(nèi)皮細(xì)胞和粒細(xì)胞，導(dǎo)致炎癥的發(fā)生[13]。在臨床上表現(xiàn)為非典型肺炎癥狀，危害嚴(yán)重。CT具有較高的密度分辨力，對(duì)病變的部位、形態(tài)、密度、臨近支氣管、血管束及胸膜、縱隔狀況均有較好的顯現(xiàn)，是診斷肺部疾病的最佳影像檢查方法?？梢园l(fā)現(xiàn)X線片難以發(fā)現(xiàn)的病變影像和肺炎早期的影像變化，有助于與其他疾病進(jìn)行鑒別診斷[14]。

本研究人工感染綿羊肺炎支原體，通過(guò)臨床癥狀、病理學(xué)變化、病原學(xué)檢測(cè)確定支原體肺炎造模成功。由于機(jī)體免疫力不同，感染的病羊表現(xiàn)出不同程度的臨床癥狀。病羊剖檢可見(jiàn)氣管有大量的黏液滲出，多見(jiàn)雙側(cè)肺葉發(fā)生病變，好發(fā)于右前葉。肺有明顯的出血點(diǎn)和出血斑，不同程度的肉變，能明顯看到健康和病變的交界處，切面呈大理石樣。病變肺組織病理檢查可見(jiàn)肺間質(zhì)增寬，支氣管上皮細(xì)胞增生，支氣管內(nèi)炎性滲出，血管和細(xì)支氣管周圍也存在大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)[15]。

本研究對(duì)成功誘發(fā)支原體肺炎羊進(jìn)行CT掃描，由獲得影像可知羊支原體肺炎影像主要以間質(zhì)性肺炎伴發(fā)支氣管肺炎為主。CT影像上以片狀的磨玻璃密度影為主要特征，同時(shí)也會(huì)出現(xiàn)小葉間間隔增厚的網(wǎng)格狀影像，符合間質(zhì)性肺炎的影像表現(xiàn)，病理組織學(xué)檢查也顯示間質(zhì)增厚，符合間質(zhì)性肺炎的病理表現(xiàn)。支氣管黏膜增厚、出現(xiàn)雙軌征是支氣管肺炎的主要CT影像表現(xiàn)，病理上表現(xiàn)為支氣管黏膜增厚，管腔內(nèi)大量的炎性滲出。CT影像上的實(shí)變影，與病理解剖上表現(xiàn)的肉變和肝變的變化一致。

白色三角形.粘連;黑色箭號(hào).肉變;白色箭號(hào).肝變；黑色箭頭.大理石紋路病變；白色箭頭.結(jié)節(jié)White triangle.Adhesion；Black arrow.Carnification；White arrow.Hepatization；Black arrowhead.Marbling lesions；White arrowhead.Nodule圖5 肺病理變化Fig.5 Pathological anatomy of lung

A～C.40×;D.100×。a.細(xì)支氣管；b.肺泡；c.滲出物；d.肺泡隔增厚；e.支氣管周圍炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；f.出血；g.中性粒細(xì)胞；h.巨噬細(xì)胞；i.單核細(xì)胞；j.淋巴細(xì)胞A-C.40×;D.100×.a.Bronchiole；b.Alveoli；c.Transudation；d.Thickening of alveolar septa；e.Inflammatory cells infiltration around the bronchi；f.Hemorrhage；g.Neutrophilic leukocytes；h.Macrophagocyte；i.Monocyte；j.Lymphocyte圖6 試驗(yàn)組羊肺組織病理學(xué)檢查(HE染色)Fig.6 Histopathological examination of lung in experimental group(HE staining)

M.DNA 相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.IK3-3株；2.空白對(duì)照；3.分離株-1；4.分離株-2M.DNA marker；1.IK3-3 strain；2.Blank control；3.Isolate strain-1；4.Isolate strain-2圖7 Mo HSP70 PCR鑒定結(jié)果Fig.7 PCR identification results of Mo HSP70

隨著支原體肺炎病程的發(fā)展，CT影像表現(xiàn)也在不斷的變化。重癥組羊初期以磨玻璃密度影為主，肺紋理增粗，部分肺葉實(shí)變。隨著病情的發(fā)展，肺野整體的密度升高，直至試驗(yàn)結(jié)束后也無(wú)明顯的變化，這些均與臨床表現(xiàn)相符。中癥組病情相對(duì)重癥組輕，CT影像上也沒(méi)有表現(xiàn)出大面積的實(shí)變影，且在21 d內(nèi)影像表現(xiàn)大部分消失。輕癥組僅出現(xiàn)小片狀的磨玻璃密度影，且第14 天后已經(jīng)無(wú)明顯的影像表現(xiàn)。

4 結(jié) 論

山羊支原體肺炎多見(jiàn)雙側(cè)肺葉病變，好發(fā)于右前葉，以間質(zhì)性肺炎伴發(fā)支氣管肺炎為主，胸部CT影像主要表現(xiàn)為片狀磨玻璃密度影，網(wǎng)格狀陰影，其中重癥羊多見(jiàn)空氣支氣管征，個(gè)別羊見(jiàn)胸膜增厚影。支原體肺炎的影像表現(xiàn)與臨床癥狀、病程發(fā)展一致，影像上的表現(xiàn)與病理解剖學(xué)、病理組織學(xué)變化也具有一致性，說(shuō)明CT可以準(zhǔn)確地評(píng)估羊支原體肺炎的發(fā)展，對(duì)羊支原體肺炎的診斷具有重要的參考價(jià)值。