陳夢(mèng)月，張羽晨，婁江城，羅傳真，趙紅利，劉曉麗，胡薛英

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，武漢 430070)

在臨床腫瘤病例中，毛囊腫瘤較為常見(jiàn)。毛囊腫瘤的分類(lèi)主要依據(jù)瘤細(xì)胞的分化模式，毛囊腫瘤可來(lái)源于成熟毛囊的上皮細(xì)胞及毛囊發(fā)育過(guò)程中的毛胚芽細(xì)胞[1]。毛囊腫瘤種類(lèi)多、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，有多種組織學(xué)亞型，而且有些腫瘤病例呈現(xiàn)多種分化方向，僅通過(guò)組織學(xué)難以快速、準(zhǔn)確地作出診斷[2]。免疫組化技術(shù)(immunohistochemistry，IHC)作為病理組織學(xué)診斷最常用的輔助手段，對(duì)犬毛囊腫瘤的診斷具有重要意義[3-4]。

本研究通過(guò)免疫標(biāo)記物CK5/6、CK8/18、CK19及P63、CD34、CD10、Vimentin在犬毛囊腫瘤中的應(yīng)用，建立犬毛囊腫瘤的IHC表達(dá)譜，為犬毛囊腫瘤的分級(jí)診斷提供最優(yōu)的免疫標(biāo)記物，同時(shí)，為組織學(xué)結(jié)構(gòu)相似的腫瘤提供有效的鑒別診斷標(biāo)記物，從而提高腫瘤診斷的準(zhǔn)確性，縮短腫瘤的病理學(xué)診斷時(shí)間，為犬腫瘤疾病的臨床精準(zhǔn)治療提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究共收集犬毛囊腫瘤26例。大部分腫瘤病例來(lái)自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)院2017—2019年的臨床病例，少量病例來(lái)自李恒寵物醫(yī)院等其他武漢寵物醫(yī)院。

1.2 方法

通過(guò)對(duì)病犬的臨床檢查，了解發(fā)病過(guò)程和疑似腫瘤的位置，初步診斷后，經(jīng)主人同意切除腫瘤。并對(duì)切除腫瘤進(jìn)行病理特征觀察。參照文獻(xiàn)[2]進(jìn)行組織病理學(xué)診斷。

將切除的腫塊置于10%的福爾馬林溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，切片厚度4 μm。一部分進(jìn)行HE染色，觀察病理變化；另一部分進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，免疫組織化學(xué)染色所用抗體的工作濃度見(jiàn)表1。運(yùn)用Nikon80i生物光學(xué)顯微鏡及NIS-Elements高清晰度彩色圖文分析系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)果觀察與記錄。

表1 免疫組織化學(xué)染色的一抗工作濃度及修復(fù)方法Table 1 Immunohistochemical staining of the first antibody working concentration and repair method

2 結(jié) 果

共收集毛囊腫瘤26例，其中，角化棘皮瘤7例、毛母細(xì)胞瘤7例、毛上皮瘤3例、惡性毛上皮瘤2例、外毛根鞘瘤1例、毛母質(zhì)瘤4例、毛囊瘤1例、復(fù)合型毛囊腫瘤1例。表2概括了毛囊腫瘤的IHC特征。

表2 犬毛囊腫瘤的IHC特征Table 2 Immunohistochemical features of follicular neoplasms in dogs

HE染色結(jié)果顯示，7例角化棘皮瘤均為囊狀結(jié)構(gòu)，囊腔內(nèi)充滿層狀角蛋白；囊壁由角質(zhì)形成細(xì)胞構(gòu)成，囊壁細(xì)胞由外向內(nèi)由立方形變扁平(圖1A)。IHC結(jié)果顯示，CK5/6、CK19、P63、CD34角質(zhì)形成細(xì)胞均為陽(yáng)性，CD34陽(yáng)性信號(hào)位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中(圖1B、C)；Vimentin、CK8/18、CD10瘤細(xì)胞陰性。

A.角質(zhì)形成細(xì)胞從外到內(nèi)由立方形變扁平；B.CD34角質(zhì)形成細(xì)胞陽(yáng)性；C.CK19囊壁各層細(xì)胞均為陽(yáng)性A.From outside to inside,the keratinocytes vary from cuboid to flat;B.Keratinocytes are positive for CD34;C.Keratinocytes are positive for CK19圖1 角化棘皮瘤病理變化Fig.1 Pathological changes of keratinizing acanthoma

毛母細(xì)胞瘤分為水母型和小葉型，腫瘤細(xì)胞體積較小，細(xì)胞質(zhì)染色淺，核仁清晰，核分裂象較多(圖2A、B)。IHC染色結(jié)果顯示，CK5/6、CK19、P63瘤細(xì)胞廣泛陽(yáng)性，CK19陽(yáng)性強(qiáng)度較弱(圖2C)；7例毛母細(xì)胞瘤中5例為CD34陽(yáng)性，陽(yáng)性弱；CD10瘤細(xì)胞陰性，局部間質(zhì)細(xì)胞陽(yáng)性，陽(yáng)性信號(hào)主要位于腫瘤周邊間質(zhì)；Vimentin、CK8/18瘤細(xì)胞陰性。

毛上皮瘤呈小葉型或囊狀，瘤細(xì)胞向3種方向分化，部分瘤細(xì)胞胞質(zhì)淡染，泡狀核，類(lèi)似毛囊外根鞘細(xì)胞；部分瘤細(xì)胞較小，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核深染，類(lèi)似未分化的毛球細(xì)胞；部分位于中央囊腔附近的瘤細(xì)胞，呈扁平狀，類(lèi)似毛囊內(nèi)根鞘細(xì)胞(圖3A、B)。IHC結(jié)果為P63、CK5/6瘤細(xì)胞陽(yáng)性；CK19在類(lèi)外根鞘細(xì)胞和類(lèi)內(nèi)根鞘細(xì)胞中表現(xiàn)為陽(yáng)性，類(lèi)毛球細(xì)胞陰性(圖3C)；CD34類(lèi)外根鞘細(xì)胞膜陽(yáng)性(圖3D)；CD10部分瘤細(xì)胞陽(yáng)性，間質(zhì)廣泛陽(yáng)性(圖3E)；在3例毛上皮瘤中，2例為CK8/18陽(yáng)性(圖3F)；Vimentin瘤細(xì)胞陰性。

A.水母型，瘤細(xì)胞體積小，細(xì)胞質(zhì)略嗜堿性；B.小葉型；C.CK19廣泛陽(yáng)性A.Medusoid type,the tumor cells are small with little slightly basophilic cytoplasm;B.Lobular type; C.Tumor cells are widely positive for CK19圖2 毛母細(xì)胞瘤病理變化Fig.2 Pathological changes of trichoblastoma

A.瘤細(xì)胞向3種方向分化；B.囊狀；C.CK19類(lèi)外根鞘和類(lèi)內(nèi)根鞘陽(yáng)性；D.CD34類(lèi)外根鞘細(xì)胞陽(yáng)性；E.CD10部分瘤細(xì)胞陽(yáng)性；F.CK8/18部分類(lèi)內(nèi)根鞘細(xì)胞陽(yáng)性A.The tumor cells differentiate into three directions;B.Cystic variant;C.Tumor cells resembling the external root sheath and the inner root sheath are positive for CK19;D.Tumor cells resembling the external root sheath are positive for CD34;E.Partial tumor cells are positive for CD10;F.Tumor cells resembling the inner root sheath are positive for CK8/18圖3 毛上皮瘤病理變化Fig.3 Pathological changes of trichoepithelioma

惡性毛上皮瘤小葉中央囊腔中有角化不全的碎片；瘤細(xì)胞主要向類(lèi)毛球的小細(xì)胞和類(lèi)內(nèi)根鞘細(xì)胞分化，小細(xì)胞數(shù)量居多，小細(xì)胞呈橢圓形、梭形或多邊形，核質(zhì)比大，核分裂象較多(20+/10HPF)；瘤組織中有淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞浸潤(rùn)(圖4A)。IHC結(jié)果顯示，P63瘤細(xì)胞廣泛核陽(yáng)性；CD10小葉中央陽(yáng)性，間質(zhì)陽(yáng)性；CK5/6、CK19小葉周邊陽(yáng)性(圖4B)；CD34小葉周邊少量細(xì)胞呈弱陽(yáng)性(圖4C)；Vimentin、CK8/18瘤細(xì)胞陰性。

外毛根鞘瘤小梁狀，腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)嗜酸性強(qiáng)，細(xì)胞界限不清，有中央角化結(jié)構(gòu)形成(圖5A)。IHC結(jié)果顯示，CK5/6、CK19、P63、CD34瘤細(xì)胞廣泛陽(yáng)性(圖5B、5C)；Vimentin、CK8/18、CD10瘤細(xì)胞陰性，CD10腫瘤小葉之間的間質(zhì)細(xì)胞陽(yáng)性。

毛母質(zhì)瘤呈囊狀，囊腔中聚集有大量影子細(xì)胞；囊壁細(xì)胞向兩種方向分化，一種瘤細(xì)胞表現(xiàn)為胞質(zhì)少、細(xì)胞核小而深染，另一種細(xì)胞體積大，細(xì)胞核大而淺染(圖6A)。毛母質(zhì)瘤CK5/6、CK19細(xì)胞核大而淺染的細(xì)胞陽(yáng)性(圖6B)；P63瘤細(xì)胞廣泛核陽(yáng)性(圖6C)；CD34瘤細(xì)胞廣泛弱陽(yáng)性；Vimentin、CK8/18、CD10瘤細(xì)胞陰性，CD10間質(zhì)陰性。

毛囊瘤呈小葉狀，每個(gè)小葉中有多個(gè)分化良好的毛囊，囊腔中角化的碎屑，毛囊周?chē)植加衅ぶ?圖7A)。IHC結(jié)果為CK5/6、CK19毛囊分化部分陽(yáng)性，皮脂腺分化部分儲(chǔ)備細(xì)胞陽(yáng)性(圖7B)；P63小葉外周細(xì)胞陽(yáng)性(圖7C)；Vimentin、CK8/18、CD34、CD10瘤細(xì)胞陰性，CD10間質(zhì)陰性。

A.小葉中央囊腔中有角化不全的碎片，小細(xì)胞數(shù)量較多；B.CK19腫瘤小葉周邊陽(yáng)性；C.CD34小葉周邊弱陽(yáng)性A.There are fragments of dyskeratosis in the center of tumor lobule,with a large number of small cells;B.Tumor cells around the lobule are positive for CK19;C.Tumor cells around the lobule are weakly positive for CD34圖4 惡性毛上皮瘤病理變化Fig.4 Pathological changes of malignant trichoepithelioma

A.瘤細(xì)胞小，胞質(zhì)嗜酸性，有中央角化結(jié)構(gòu)；B.CD34瘤細(xì)胞廣泛陽(yáng)性；C.CK19廣泛陽(yáng)性A.Tumor cells are small with eosinophilic cytoplasm and central keratinized structure;B.Tumor cells are widely positive for CD34;C.Tumor cells are widely positive for CK19圖5 外毛根鞘瘤病理變化Fig.5 Pathological changes of tricholemmoma

本研究有1例復(fù)合型毛囊腫瘤，腫塊中包含外毛根鞘瘤、毛母細(xì)胞瘤、角化棘皮瘤3種腫瘤(圖8A)。復(fù)合型毛囊腫瘤中3種腫瘤的IHC染色結(jié)果與其單獨(dú)出現(xiàn)的IHC特征一致，CD34在外毛根鞘瘤中陽(yáng)性最強(qiáng)(圖8B)，CK5/6、CK19、P63在3種腫瘤中都表現(xiàn)為廣泛陽(yáng)性(圖8C)。

A.腫瘤向毛囊和皮脂腺分化；B.CK5/6毛囊分化部分陽(yáng)性；C.P63小葉外周陽(yáng)性A.The tumor differentiates into hair follicles and sebaceous glands;B.Tumor cells differentiated into hair follicles are positive for CK5/6;C.Cells around the lobule are positive for P63圖7 毛囊瘤病理變化Fig.7 Pathological changes of trichofolliculoma

A.★指示外毛根鞘瘤，▲指示毛母細(xì)胞瘤，指示角化棘皮瘤；B.CD34外毛根鞘瘤強(qiáng)陽(yáng)性；C.CK19 3種腫瘤均為陽(yáng)性A.★ indicating tricholemmomas,▲ indicating trichoblastomas, indicating keratinizing acanthomas;B.Tumor cells of tricholemmomas are strongly positive for CD34;C.The three kinds of neoplasm are all positive for CK19圖8 復(fù)合型毛囊腫瘤病理變化Fig.8 Pathological changes of complex follicular tumors

3 討 論

7例角化棘皮瘤中CK5/6、CK19、P63、CD34均為瘤細(xì)胞陽(yáng)性，Kok等[6]的研究結(jié)果顯示，CK19在角化棘皮瘤中為陰性，與本研究結(jié)果不一致，不推薦CK19作為角化棘皮瘤的標(biāo)記物；Vimentin、CK8/18、CD10均為瘤細(xì)胞陰性。因此，CK5/6、P63、CD34可用作角化棘皮瘤的瘤細(xì)胞陽(yáng)性標(biāo)記物，Vimentin、CK8/18、CD10可用作瘤細(xì)胞的陰性標(biāo)記物。

7例毛母細(xì)胞瘤中CK5/6、CK19、P63、CD34均表現(xiàn)為瘤細(xì)胞陽(yáng)性，CD34陽(yáng)性較弱[6]，Sengul等[7]詳細(xì)探討了CD10在毛母細(xì)胞瘤中的表達(dá)特點(diǎn)，結(jié)果表明，CD10的陽(yáng)性信號(hào)主要在毛母細(xì)胞瘤周邊間質(zhì)中，本研究7例毛母細(xì)胞瘤的CD10陽(yáng)性與Sengul等的結(jié)果一致；Vimentin、CK8/18表現(xiàn)為瘤細(xì)胞陰性。綜上，CK5/6、CK19、P63可用作毛母細(xì)胞瘤的陽(yáng)性標(biāo)記物；CK8/18、Vimentin可用作瘤細(xì)胞陰性標(biāo)記物；當(dāng)瘤細(xì)胞標(biāo)記物難以進(jìn)行診斷時(shí)，可考慮利用CD10在腫瘤周邊間質(zhì)中呈陽(yáng)性表達(dá)的特點(diǎn)進(jìn)行診斷。

本研究中，良性毛上皮瘤3例，惡性腫瘤2例，CK5/6、P63、CK19、CD34、CD10、CK8/18在5例腫瘤中均表現(xiàn)為瘤細(xì)胞陽(yáng)性[8]；有文獻(xiàn)顯示，CK19和CD34陽(yáng)性率的降低可用于毛上皮瘤的良惡性診斷，本研究中CK19在良性和惡性毛上皮瘤中分別為強(qiáng)陽(yáng)性和中陽(yáng)性，CD34在良性和惡性毛上皮瘤中分別為中陽(yáng)性和弱陽(yáng)性，與文獻(xiàn)描述一致[5]；Vimentin瘤細(xì)胞陰性。綜上，CK5/6、P63、CK19、CD34、CD10、CK8/18可用作毛上皮瘤的瘤細(xì)胞陽(yáng)性標(biāo)記物，Vimentin可用作瘤細(xì)胞陰性標(biāo)記物，CK19和CD34共同使用可用于區(qū)分毛上皮瘤的良惡性。

1例外毛根鞘瘤CK5/6、CK19、P63、CD34呈瘤細(xì)胞強(qiáng)陽(yáng)性，與Kok等[5]的研究結(jié)果一致；CK8/18、Vimentin呈瘤細(xì)胞陰性。因此，CK5/6、CK19、P63、CD34可用作外毛根鞘瘤的瘤細(xì)胞陽(yáng)性標(biāo)記物，CK8/18、Vimentin可用作瘤細(xì)胞陰性標(biāo)記物。

4例毛母質(zhì)瘤CK5/6、CK19、P63、CD34呈瘤細(xì)胞陽(yáng)性，在Kok等[5]的研究中，CD34為陰性，與本研究結(jié)果不一致；CK8/18、Vimentin呈瘤細(xì)胞陰性。因此，CK5/6、P63、CK19可用作毛母質(zhì)瘤的瘤細(xì)胞陽(yáng)性標(biāo)記物，CK8/18、Vimentin可用作瘤細(xì)胞陰性標(biāo)記物。

1例毛囊瘤CK5/6、CK19、P63呈小葉外周陽(yáng)性；Vimentin為瘤細(xì)胞陰性?？蛇x用CK5/6、CK19、P63毛囊瘤的瘤細(xì)胞陽(yáng)性標(biāo)記物，Vimentin可用作瘤細(xì)胞陰性標(biāo)記物。毛囊瘤在犬中發(fā)生率低[9]，關(guān)于毛囊瘤的IHC研究報(bào)道很少，本研究的1個(gè) 病例可供參考。

本研究CD34在角化棘皮瘤、毛母細(xì)胞瘤、毛上皮瘤、外毛根鞘瘤共20例毛囊腫瘤中為陽(yáng)性，占所有毛囊腫瘤的86.9%，因此，CD34也可用作除毛母質(zhì)瘤和毛囊瘤外的毛囊腫瘤的標(biāo)記物[6，10]。

4 結(jié) 論

在犬毛囊腫瘤診斷中，CK5/6、P63可用作本研究中所有毛囊腫瘤的陽(yáng)性標(biāo)記物；CD34可用作除毛母質(zhì)瘤、毛囊瘤外的其他毛囊腫瘤的陽(yáng)性標(biāo)記物；CD10、CK8/18可用作毛上皮瘤的陽(yáng)性標(biāo)記物；CK19和CD34可用作區(qū)分毛上皮瘤良惡性的標(biāo)記物；CD10可用作毛母細(xì)胞瘤周邊間質(zhì)陽(yáng)性標(biāo)記物；Vimentin可用作瘤細(xì)胞陰性標(biāo)記物。