李占鴻，宋子昂，廖德芳，楊振興，謝佳芮，高 翔，胡忠燕，李卓然，李華春*，楊 恒*

(1.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室，昆明 650224；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，昆明 650201；3.云南省景洪市動物疫病預(yù)防控制中心，景洪 666100)

動物藍舌病(bluetongue,BT)是反芻動物的一種烈性傳染病，其病原藍舌病病毒(bluetongue virus,BTV)主要通過庫蠓(Culicoidesspp.)傳播，可感染牛、羊、鹿和駱駝等多種家養(yǎng)與野生反芻動物。BT的暴發(fā)、流行嚴(yán)重危害牛羊養(yǎng)殖業(yè)，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失的同時，還會制約牛、羊出口貿(mào)易，影響畜產(chǎn)品國際貿(mào)易[1]。2006年，非洲來源的BTV-8型毒株侵入歐洲，給歐洲各國的牛、羊養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失[2-3]。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將BT列為法定報告的動物疫病，我國也將其列為一類動物疫病。

BTV屬呼腸孤病毒科(Reoviridae)環(huán)狀病毒屬(Orbivirus)，其基因組為雙鏈RNA(dsRNA)，由Seg-1到Seg-10 10個基因節(jié)段構(gòu)成，約20 kb，可編碼VP1～VP7等7種結(jié)構(gòu)蛋白以及NS1、NS2、NS3、NS3a與NS4等5種非結(jié)構(gòu)蛋白[4-5]。BTV病毒粒子由內(nèi)部核心、內(nèi)層衣殼與外層衣殼3個部分構(gòu)成：內(nèi)部核心由Seg-1編碼的RNA依賴RNA聚合酶(VP1蛋白)、Seg-4編碼的加帽酶(VP4蛋白)、Seg-9編碼的解旋酶(VP6蛋白)與基因組dsRNA組成；內(nèi)層衣殼由Seg-3與Seg-7編碼的VP3與VP7蛋白共同構(gòu)成，其氨基酸序列高度保守，VP7蛋白是誘導(dǎo)產(chǎn)生BTV群特異性抗體的主要蛋白；外層衣殼由Seg-2與Seg-6編碼的VP2與VP5蛋白構(gòu)成，該部分氨基酸序列高度變異，其中VP2是誘導(dǎo)中和抗體的主要蛋白，決定BTV的血清型，VP5可通過影響VP2蛋白的構(gòu)象間接影響中和抗體的產(chǎn)生[4-5]。BTV各個基因節(jié)段構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹顯示，不同國家/地區(qū)的分離的BTV毒株分為東方型 (Eastern)與西方型 (Western)兩種地域型[6]。

目前，世界范圍已報道了28種血清型的BTV(BTV-1至BTV-28)[7-8]，不同血清型BTV的分布范圍不同，對動物的致病性也存在較大差異。BTV-7型主要流行于非洲與澳大利亞，目前，對該血清型毒株在易感動物上的致病性尚不完全清楚。我國BTV-7型毒株于2014年首次分離于廣東省汕頭市設(shè)置的哨兵牛中[9]，全基因組測序結(jié)果顯示，該毒株的Seg-1、-2、-3、-4與-6屬Western型，與非洲BTV毒株具有最近的親緣關(guān)系；而Seg-5、-7、-8、-9與-10屬Eastern型，與中國流行BTV毒株序列相似度最高，表明非洲來源的BTV侵入了我國，在其傳播過程中與中國流行毒株通過基因重配(reassortment)產(chǎn)生了變異毒株[10]。

目前GenBank中僅公布了3株BTV-7型毒株的全基因組序列，分別來自中國(GDST008毒株)[10]、非洲(1504毒株)與澳大利亞(v6963毒株)[11]。分離我國流行的BTV-7型毒株，掌握其全基因組序列與感染特性，不僅可豐富世界范圍對BTV-7型毒株的了解，也有助于追溯我國BTV-7型毒株的來源，加深對BTV基因重配多樣性的認(rèn)知，為BTV診斷與疫苗研究提供基礎(chǔ)。因此，作者擬報道于2020年在我國云南省哨兵牛血液中分離到的1株BTV-7型毒株，并分析其全基因組序列及其感染特征。

1 材料與方法

1.1 細胞與毒株

C6/36細胞(白紋伊蚊細胞)、BHK-21細胞(倉鼠腎細胞)均由云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室保存，以含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基分別培養(yǎng)于27 與37 ℃；BTV-7型毒株(GDST008)于2014年分離自廣東省汕頭市設(shè)立的哨兵牛血液中[9-10]，由云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室保存。

1.2 主要試劑

細胞培養(yǎng)用材料(胎牛血清、MEM與DMEM培養(yǎng)基)購自美國Gbico公司；RNA提取試劑RNAiso Plus、逆轉(zhuǎn)錄酶、高保真DNA聚合酶、DNA純化試劑盒、一步法RT-PCR試劑盒、實時熒光定量qRT-PCR試劑盒均為大連寶生物公司產(chǎn)品；RNA純化試劑盒、T4 RNA Ligase I均為北京NEB公司產(chǎn)品；磁珠法病毒RNA抽提試劑盒為美國Thermo Fisher公司產(chǎn)品；DNA文庫構(gòu)建試劑盒購至美國Illumina公司；低熔點瓊脂糖與結(jié)晶紫購自杭州碧云天公司；BTV抗體C-ELISA檢測試劑盒[12]由云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室制備并保存。

1.3 哨兵動物的設(shè)立與血樣采集

2020年5月，在云南省景洪市勐罕鎮(zhèn)(經(jīng)緯度：E100°59′53″，N21°54′58″，海拔550 m)選擇3頭1周歲 云南黃牛作為蟲媒病毒監(jiān)測的哨兵動物。哨兵牛BTV與動物流行型出血病病毒(EHDV)血清學(xué)檢測為陰性，采用放牧的方式單獨飼養(yǎng)，期間不使用任何疫苗與驅(qū)蟲劑。從5月初開始，每周定時采集肝素鈉抗凝血、EDTA抗凝血與全血等三種血液樣本，進行蟲媒病毒的檢測與分離。

1.4 血液樣本中BTV的檢測與病毒分離

取采自哨兵牛的全血分離血清，以BTV抗體C-ELISA檢測試劑盒[12]進行檢測；取采集的EDTA抗凝血提核酸，使用BTV群特異性qRT-PCR[13]檢測病毒核酸。取BTV感染動物的肝素鈉抗凝血，離心收集紅細胞(red blood cells,RBCs)。以PBS洗滌RBCs一次，加入滅菌水裂解RBCs。取RBCs裂解液接種C6/36細胞培養(yǎng)1代，隨后在BHK-21細胞上連續(xù)盲傳3～5代，當(dāng)觀察到細胞病變(cytopathic effect,CPE)時，收獲細胞培養(yǎng)上清鑒定分離的病毒。

1.5 分離病毒的RT-PCR鑒定

使用病毒RNA/DNA提取試劑盒按說明書操作提取待鑒定病毒的核酸，使用一步法RT-PCR試劑盒，以針對BTV、EHDV與帕利亞姆病毒(PALV)的特異性引物進行一步法RT-PCR擴增檢測[14-16]；若待鑒定毒株為BTV，使用云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室建立的BTV血清型特異性RT-PCR[17]進行分離BTV毒株的血清型鑒定。

1.6 病毒基因組dsRNA的提取及檢測

將所分離的BTV毒株接種BHK-21細胞，待開始出現(xiàn)CPE時，刮取病變細胞，8 000 r·min-1離心20 min，收集細胞，加入RNAiso Plus，按說明書操作提取細胞的總RNA。按照文獻[18]報道的方法純化病毒基因組dsRNA。取5 μL純化后病毒核酸，進行2%的高分辨率瓊脂糖凝膠電泳，檢測dsRNA的質(zhì)量與完整性。

1.7 病毒基因組cDNA的合成與PCR擴增

取純化后的BTV毒株基因組dsRNA作為模板，參照Maan等[19]報道的全長cDNA擴增(full-length amplification of cDNAs,FLAC)技術(shù)合成病毒基因組cDNA，使用GXL高保真DNA聚合酶擴增病毒基因組，按說明書推薦方法配制PCR反應(yīng)體系，擴增程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，60 ℃復(fù)性30 s，68 ℃延伸4 min，35個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，取PCR擴增產(chǎn)物進行電泳，檢測擴增產(chǎn)物的完整性。

1.8 高通量測序獲取病毒的全基因組序列

取“1.7”病毒全基因組PCR擴增產(chǎn)物，純化，然后使用Illumina公司的TruSeq DNA Sample Prep Kit DNA文庫構(gòu)建試劑盒構(gòu)建文庫。將所構(gòu)建的文庫在高通量測序平臺Illumina Novaseq 6000上進行高通量測序。使用Trimmomatic軟件[20]對獲取的原始reads數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制與濾過處理，濾過后的reads使用Edena(v3.131028)[21]、SOAPdenovo(v2.04)軟件[22]進行病毒基因組的denove組裝。

1.9 序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載相關(guān)BTV毒株序列，使用Mafft-win序列比對軟件[23]與本研究中獲取的基因組序列進行比對，使用BioEdit軟件計算核酸(nt)與氨基酸(aa)序列的相似度；使用MEGA X軟件[24]構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，模型選擇鄰近法(Neighbor-join)，參數(shù)選擇P-distance，將自舉檢驗值(bootstraps)取值設(shè)為1 000。

1.10 病毒在細胞上的感染特性比較

將適當(dāng)稀釋的病毒液接種BHK-21細胞，37 ℃吸附1 h，棄病毒液，并覆蓋含2%胎牛血清和1%低熔點瓊脂糖的DMEM培養(yǎng)基。在感染后第5天，用含0.03%的結(jié)晶紫染液對細胞進行染色，鏡下觀察病毒形成的蝕斑形態(tài)，并進行蝕斑計數(shù)。

1.11 病毒在動物上的感染回溯分析

取5—8月份采集的哨兵牛EDTA抗凝血50 μL，使用磁珠法病毒RNA抽提試劑盒提取病毒核酸。使用本實驗室建立的BTV-7型血清型特異性實時熒光定量(qRT-PCR)檢測方法對感染動物血液中BTV-7型毒株的核酸(靶基因Seg-2)進行檢測，按說明書推薦方法配制反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：45 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個循環(huán)。待檢血液中病毒的核酸含量以qRT-PCR反應(yīng)產(chǎn)生熒光信號的循環(huán)閾值數(shù)(cycle threshold，Ct)表示采用Karber法[25]測定分離毒株的TCID50；將采集的動物血清56 ℃滅活處理30 min，倍比稀釋后備用。取100 TICD50的病毒懸液與稀釋的動物血清作用2 h，在96孔板上采用“固定病毒-稀釋血清”的方法測定梯度稀釋的血清對細胞CPE的抑制作用。通過Karber法計算血清中和抗體的效價，分析感染哨兵牛血清中和抗體水平的動態(tài)變化。

2 結(jié) 果

2.1 病毒的分離與鑒定

3頭哨兵牛，每周定時采血，持續(xù)監(jiān)測血樣中的BTV抗體和核酸。1號哨兵牛5月19日采集的血液樣本經(jīng)qRT-PCR檢測為BTV核酸陽性，5月25日 采集的血清樣本經(jīng)C-ELISA檢測為陽性，從哨兵牛的血液樣本中檢測到BTV的核酸與群特異性抗體的存在，表明該哨兵動物感染了BTV。

取5月19日自1號哨兵牛采集的肝素鈉血液樣本，接種C6/36與BHK-21細胞進行BTV分離。在BHK-21細胞上盲傳至第3代，接種細胞出現(xiàn)明顯的CPE，表現(xiàn)為細胞皺縮、脫落與裂解(圖1)。提取病變細胞的核酸，分別進行BTV、EHDV和PALV的RT-PCR鑒定，BTV群特異性RT-PCR可擴增出預(yù)期的約1 kbSeg-7片段；BTV血清型RT-PCR鑒定結(jié)果顯示，僅BTV-7型引物可擴增約1 kb的Seg-2片段，測序結(jié)果BLAST比對顯示與BTV-7型毒株的序列相似度為92.7%～98.8%。以上結(jié)果表明在感染BTV的哨兵牛血液中分離出1株BTV-7型毒株，將其命名為V303/YNJH/2020。

圖1 V303/YNJH/2020感染BHK-21細胞引起的細胞病變(100×)Fig.1 Cytopathic effect (CPE) of V303/YNJH/2020 on BHK-21 cells (100× magnification)

2.2 BTV-7型毒株在細胞上增殖特性的比較

將BTV-7型V303/YNJH/2020與GDST008毒株分別感染BHK-21細胞，在細胞層面分析兩個毒株感染特性的差異。蝕斑試驗的結(jié)果(圖2)顯示，V303/YNJH/2020毒株在細胞上造成的蝕斑明顯大于GDST008毒株造成的。病毒的增殖曲線(圖3)顯示，感染后的48 h，感染細胞上清中V303/YNJH/2020與GDST008的含量基本一致；感染后72～96 h，V303/YNJH/2020在細胞上的增殖水平明顯高于GDST008(P<0.05)；在120 h后，兩種病毒在細胞增殖基本達到平臺期，但細胞上清中V303/YNJH/2020的病毒滴度(106.28PFU·mL-1)明顯高于GDST008毒株(105.19PFU·mL-1)，差異極顯著(P<0.01)。以上結(jié)果提示，V303/YNJH/2020在BHK-21細胞上的增殖能力明顯強于GDST008。

圖2 V303/YNJH/2020與GDST008毒株在BHK-21細胞上形成蝕斑比較Fig.2 Compare viral plaque formations of GDST008 and V303/YNJH/2020 strains on BHK-21 cells

2.3 BTV全基因組擴增

提取V303/YNJH/2020毒株的dsRNA進行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果(圖4A)顯示病毒基因組dsRNA在凝膠上的電泳帶型特征呈現(xiàn)“3-3-3”的遷移特征。通過FLAC技術(shù)[19]進行病毒基因組的RT-PCR擴增，電泳結(jié)果(圖4B)顯示，擴增的病毒基因組DNA在瓊脂糖凝膠上的電泳帶型特征與基因組dsRNA電泳帶型一致，表明成功擴增了病毒全基因組。

*.差異顯著，P<0.05；**.差異極顯著P<0.01*.Difference is significant,P<0.05;**.Difference is extremely significant,P<0.01圖3 BTV-7型GDST008與V303/YNJH/2020在BHK-21細胞上增殖曲線比較Fig.3 Viral growth curves of BTV-7 GDST008 and V303/YNJH/2020 strains on BHK-21 cells

2.4 NGS測序

V303/YNJH/2020毒株的基因組PCR產(chǎn)物的高通量測序結(jié)果顯示，得到1.4 G的原始測序數(shù)據(jù)，共產(chǎn)生49 375 600條reads。經(jīng)數(shù)據(jù)過濾處理后得到42 804 300條高質(zhì)量的reads，其中,98.3%的reads可被進一步組裝形成10個contigs，每個contig上單堿基位點的平均測序深度達5 000～20 000，測序結(jié)果表明對V303/YNJH/2020毒株的基因組進行了深度測序(基因組序列特征見表1)。

M.DL 5000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.V303/YNJH/2020 毒株全基因組擴增產(chǎn)物M.DL5000 DNA marker;1.RT-PCR products of V303/YNJH/2020 genome圖4 病毒基因組dsRNA(A)與全基因組RT-PCR擴增產(chǎn)物(B)電泳Fig.4 Agarose-gel electrophoresis genomic dsRNA of V303/YNJH/2020 (A) and its whole genome RT-PCR products (B)

表1 V303/YNJH/2020毒株基因組序列特征Table 1 Genome sequence characteristics of V303/YNJH/2020

2.5 BTV毒株基因組序列特征分析

獲取的V303/YNJH/2020毒株的基因組序列全長為19 154 bp，10個基因節(jié)段的G+C含量在41.84%～47.62%，長度為3 944 bp (Seg-1)至822 bp (Seg-10)，各基因節(jié)段編碼蛋白氨基酸殘基數(shù)為1 302(VP1) 至216(NS3a)?；蚪M非編碼區(qū)(non-coding regions,NCR)占整個基因組的4.07%，各基因節(jié)段5′端NCR的長度為34 bp(Seg-5)至8 bp(Seg-4)之間，3′ NCR的長度均大于5′端NCR，長度為133 bp(Seg-10)至27 bp(Seg-1)(表1)，各個節(jié)段的5′ 與3′ NCR區(qū)均具有5′-GUUAAAA-------ACACUUAC-3′的保守序列。

BLAST比對分析結(jié)果顯示，V303/YNJH/2020毒株的Seg-1至Seg-6、Seg-9與Seg-10等8個基因節(jié)段與BTV-7型GDST008毒株[9]的對應(yīng)基因節(jié)段有著最近的親緣關(guān)系，核苷酸與編碼蛋白氨基酸(nt/aa)序列的相似度在98.8%/99.0%(Seg-2/VP2)至100.0%/100.0%(Seg-5/NS1)之間。V303/YNJH/2020毒株的Seg-7/VP7與Seg-8/NS2則分別與澳大利亞BTV-7型V6963毒株和BTV-15型DPP192毒株[11]具有最近的親緣關(guān)系，序列相似度分別為94.8/99.1%和94.3/94.9%，與GDST008毒株的序列相似度僅為71.5/81.6%和79.6/84.4% (表1)。以上結(jié)果表明，云南省與廣東兩省分離的BTV-7型毒株雖有著最近的親緣關(guān)系，但Seg-7與Seg-8基因節(jié)段出現(xiàn)了遺傳多樣性。

2.6 Seg-7與Seg-8的系統(tǒng)發(fā)生樹

為分析BTV-7型V303/YNJH/2020與GDST008毒株Seg-7與Seg-8的遺傳進化關(guān)系，分別構(gòu)建兩個基因節(jié)段的系統(tǒng)發(fā)生樹。Seg-7構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹顯示，GDST008毒株與印度和中國分離的BTV毒株聚為Eastern 3地域亞型；而V303/YNJH/2020毒株則與澳大利亞、南非等地分離的BTV-7型和BTV-19型毒株聚為Western 6地域亞型(圖5A)。Seg-8的系統(tǒng)發(fā)生樹顯示，V303/YNJH/2020毒株屬Western型，與澳大利亞BTV-15型DPP192毒株聚為一簇，而GDST008毒株屬Eastern型，與中國BTV-4、-15與-21型毒株聚為一簇(圖5B)。以上結(jié)果提示，V303/YNJH/2020與GDST008毒株的Seg-7與Seg-8在進化上有著不同的來源。

2.7 BTV-7型毒株在哨兵牛上感染的回溯分析

通過qRT-PCR與血清中和試驗對感染動物血液中的BTV核酸含量與血清中和抗體效價進行監(jiān)測，對V303/YNJH/2020在哨兵牛上的感染情況進行回溯分析。將首次檢測到BTV-7型病毒核酸的采血時間點設(shè)為第1周(Ct值：33.4)，在感染后第2、3周，血液中病毒核酸含量處于高峰(Ct值：30.4)；從第4周開始，病毒核酸含量雖呈下降趨勢，但直到監(jiān)測結(jié)束的第12周，血液中病毒的檢測結(jié)果仍為陽性(Ct值：35.6)(圖6)。

血清中和抗體檢測結(jié)果顯示，病毒感染哨兵牛的第2周，可檢測到BTV-7的特異性中和抗體的產(chǎn)生(抗體效價1∶32)，感染后的3周，血清中病毒中和抗體已到達最高點(抗體效價1∶256)并持續(xù)約6周時間，在檢測期結(jié)束的第12周，抗體水平仍維持在較高水平(1∶113) (圖6)。為分析V303/YNJH/2020是否感染同群的其他哨兵動物，取另兩頭哨兵牛5—8月每月最后一次采集的血液樣本，分別進行BTV核酸的回溯檢測，發(fā)現(xiàn)其中一頭牛感染了BTV-4型，而另一頭牛感染了BTV-1型，未檢測到BTV-7型病毒的核酸。

3 討 論

2012—2017年，在國家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))專項的資助下，本實驗室在我國云南省、廣東省、廣西壯族自治區(qū)以及江蘇省相繼分離出到12種血清型的BTV，分別為BTV-1、-2、-3、-4、-5、-7、-9、-12、-15、-16、-21與-24[26-29]，顯示我國南方地區(qū)流行BTV血清型的高度多樣性。BTV-7型毒株于2014年在廣東省設(shè)立的哨兵牛中首次分離[9]，但在為期5年的監(jiān)測過程中，其他省份設(shè)立的哨兵動物中均未分離出BTV-7型毒株，因此BTV-7型在我國的擴散、流行特征、演化規(guī)律與在動物上的感染特性尚不清楚。本研究在云南省景洪市設(shè)立的哨兵牛中分離出BTV-7型毒株，一方面確認(rèn)了BTV-7型毒株在云南省的流行，另一方面也為比較分析我國不同地域流行BTV-7型毒株的遺傳特征，進而推測病毒的演化提供了條件。

基因重配是BTV進化的主要動力，其發(fā)生頻率很高，不同血清型毒株之間、弱毒疫苗毒株與野毒株之間、本地流行毒株與外來毒株之間均可發(fā)生重配，是引起B(yǎng)TV高度遺傳多樣性的主要原因[30]。對BTV-7型V303/YNJH/2020毒株全基因組序列比較分析顯示，V303/YNJH/2020毒株的8個基因節(jié)段(Seg-1至Seg-6,Seg-9與Seg-10)，與廣東2014年分離的GDST008毒株序列高度相似，核酸序列相似度為98.8%(Seg-2)至100%(Seg-5)，氨基酸序列相似度為99.0%(VP2)～100%(VP3、VP5與NS1)(表1)，提示兩個毒株之間有著最近的親緣關(guān)系。V303/YNJH/2020毒株與GDST008毒株的Seg-7與Seg-8基因節(jié)段卻有著明顯的差異：Seg-7序列相似度僅為71.5%，分屬Western-6 與Eastern-3地域型；Seg-8的序列相似度為79.6%，分屬Western與Eastern地域型(圖5)。以上結(jié)果表明我國流行的BTV-7型毒株很可能通過基因重配產(chǎn)生遺傳多樣性。

圖中節(jié)點處的數(shù)字為各進化分支的自舉檢驗值，比例尺為每個位點的核苷酸替代數(shù)。本研究分離的V303/YNJH/2020毒株以點表示，廣東省分離的BTV-7型GDST008毒株以方塊表示。Seg-7的Eastern-1～3、Western-1～7地域型與Seg-8的Western、Eastern地域型標(biāo)注參照Maan等[3]的報道進行命名The number at the point of each branch indicates a bootstrap value.Scale bars indicate nucleic acid substitutions per site.V303/YNJH/2020 strain isolated in present study was indicated by dot and BTV-7 GDST008 strain isolated in Guangdong Province was indicated by squares.Eastern-1 to Eastern-3 and Western-1 to Western-7 toptypes of Seg-7，and Western and Eastern topypes of Seq-8 of BTV strains were assigned as per Maan[3]圖5 基于鄰近法構(gòu)建的BTV Seg-7、Seg-8系統(tǒng)發(fā)生樹Fig.5 Phylogenetic tree of BTV Seg-7,Seg-8 constructed by Neighbor-join (NJ) method

左邊Y軸表示血液中病毒核酸的qRT-PCR檢測結(jié)果的Ct值(實線表示Ct值曲線)；右邊Y軸表示血清中針對V303/YNJH/2020毒株的中和抗體滴度(虛線表示中和抗體滴度曲線)The Y axis on the left represents the qRT-PCR detection results of viral nucleic acids in the blood (Solid line indicates the curve of the Ct value);the Y axis on the right represents the titers of neutralization antibody against the V303/YNJH/2020 strain in serum (Dotted line indicates the neutralization antibody titers)圖6 自然感染V303/YNJH/2020毒株哨兵牛血液中病毒核酸與中和抗體動態(tài)監(jiān)測結(jié)果Fig.6 Detection of viral nucleic acids and neutralization antibodies in blood samples collected from sentinel cattle naturally infected with V303/YNJH/2020

基因組分節(jié)段RNA病毒的基因重配，對病毒的傳播、致病性、感染特性與免疫原性等方面均有著深刻的影響，歷史上幾次大范圍流感病毒的暴發(fā)與流行，均與基因重排產(chǎn)生變異毒株有關(guān)[31-32]。為分析基因重配是否改變我國BTV-7型毒株的感染特性，作者首先在細胞層面通過比較病毒蝕斑與增殖曲線，分析病毒在感染特性上的差異，發(fā)現(xiàn)V303/YNJH/2020毒株在BHK-21細胞上形成的蝕斑明顯大于GDST008毒株的，同時增殖曲線分析也顯示，V303/YNJH/2020毒株在感染BHK-21細胞后的72～96 h增殖能力明顯強于GDST008(圖2、3)。在基因組層面，V303/YNJH/2020 與GDST008毒株的Seg-7與Seg-8序列差異最大，2個毒株在細胞上增殖特性的差異是由病毒的Seg-7與Seg-8差異所導(dǎo)致，亦或是病毒蛋白某些關(guān)鍵氨基酸位點的突變所引起，這是一個值得探討的問題。

BTV的Seg-7與Seg-3編碼的VP7與VP3蛋白共同構(gòu)成病毒的內(nèi)層衣殼[4]，研究已證實Seg-7是BTV的毒力基因之一[33]。V303/YNJH/2020毒株的Seg-3與Seg-7均為Western型，而GDST008毒株的Seg-3與Seg-7分屬Western型與Eastern型。作者推測，Eastern型Seg-7編碼的VP7蛋白與Western型Seg-3編碼的VP3蛋白的結(jié)合能力較弱，導(dǎo)致了GDST008毒株內(nèi)層衣殼蛋白組裝效率低于V303/YNJH/2020毒株，引起GDST008病毒增殖能力減弱。BTVSeg-8編碼的NS2蛋白在感染細胞中形成病毒包涵體，是BTV病毒粒子的組裝“工廠”[34]。V303/YNJH/2020毒株的Seg-8為Western型，與歐洲強致病性BTV-8型毒株[3]具有更近的親緣關(guān)系，核酸/氨基酸序列相似度為90.8%/96.3%；而GDST008毒株的Seg-8為Eastern型，與BTV-8型強致病性毒株親緣關(guān)系較遠，序列相似度僅為80.3%/86.2%。這可能也是導(dǎo)致V303/YNJH/2020毒株在細胞上增殖能力強于GDST008病毒的原因之一。以上只是初步推測，要證實這種推測，可通過BTV反向遺傳體系[35]進行驗證。

雖然早在2014年即從我國的哨兵牛上分離出了BTV-7型毒株，但該血清型病毒在易感動物上的感染特性是怎樣的，尚無相關(guān)報道。因此作者對V303/YNJH/2020在哨兵牛上的病毒的核酸與中和抗體產(chǎn)生進行了回溯分析。結(jié)果顯示，BTV-7型感染哨兵牛后，未觀察到可見的臨床癥狀，因此可認(rèn)為牛在BTV-7型的傳播鏈中起著存儲宿主的作用，由于無臨床癥狀的出現(xiàn)，因此BTV十分容易通過活牛的貿(mào)易進行擴散。對血液樣本中BTV-7型病毒核酸的監(jiān)測結(jié)果顯示，V303/YNJH/2020感染動物后的兩周病毒達到增殖的高峰，隨后隨著中和抗體的產(chǎn)生，雖然血液中病毒核酸含量有所下降，但是在為期12周的監(jiān)測期內(nèi)，血液中始終可檢測到病毒核酸的存在。由于BTV-7型病毒核酸在血液中長期存在，是否意味著在較長時期內(nèi)，庫蠓叮咬感染動物后仍可繼續(xù)傳播病毒，值得進一步分析。

4 結(jié) 論

本研究從云南省哨兵牛上分離獲得1株BTV-7型毒株V303/YNJH/2020，全基因組測序結(jié)果顯示，該毒株與廣東BTV-7型毒株之間有最近的親緣關(guān)系，但Seg-7與Seg-8發(fā)生了基因重配，形成了新的變異毒株，導(dǎo)致其在細胞上的增殖能力明顯增強。V303/YNJH/2020感染的哨兵牛上檢測到病毒的復(fù)制與中和抗體應(yīng)答，但未觀察到臨床癥狀。本研究結(jié)果將有助于開展我國BTV-7型毒株的演化規(guī)律和致病性研究。