郭相前，董復(fù)成，黃鑫蕓，劉文忠，喬利英，張春香，任有蛇

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，太谷 030801)

哺乳動(dòng)物在出生時(shí)附睪處在未分化期，需要再經(jīng)過一段以細(xì)胞繼續(xù)增殖為主要特征的未分化期[1-2]，在該期末大鼠在21日齡基本形成特殊血-附睪屏障[3]，之后附睪再經(jīng)過以細(xì)胞分化為主要特征的分化期和以管腔擴(kuò)大為主要特征的擴(kuò)張期以提供精子發(fā)育成熟所需的微環(huán)境[4]，精子生成后附睪才能發(fā)揮正常的精子成熟與貯存等功能[5]。附睪不同區(qū)段血-附睪屏障結(jié)構(gòu)是有差異的，附睪頭部的屏障是由緊密連接和多個(gè)橋粒相連組成，定位在附睪主細(xì)胞連接處，屏障連接深層的表皮鈣粘著蛋白mRNA 在42日齡大鼠(性成熟)附睪頭部顯著高于附睪體部和尾部[6]，這為以性成熟前和成年時(shí)期為代表的兩個(gè)不同時(shí)期附睪頭樣品作為試驗(yàn)材料研究附睪頭部基因表達(dá)調(diào)控提供了理論依據(jù)。現(xiàn)今，基于多組學(xué)分析技術(shù)分析競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA(ceRNA)機(jī)制，探明附睪不同發(fā)育期其表達(dá)調(diào)控機(jī)理對(duì)雄性繁殖生理的研究有重要意義。ceRNA是一種競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源結(jié)合RNA，主要有l(wèi)ncRNA、circRNA、piRNA和假基因等[7-10]?；诓G丸組織的多組學(xué)測(cè)序數(shù)據(jù)，Meng等[11]構(gòu)建了藻毒素-亮氨酸-精氨酸誘導(dǎo)后與睪丸毒理變化顯著相關(guān)的lncRNAs、circRNAs、piRNAs、miRNAs和mRNAs相互調(diào)控的ceRNAs網(wǎng)絡(luò)。另有研究表明，lncRNA-自噬相關(guān)蛋白7(lncRNA recombinant autophagy related protein 7,lncRNAATG7)與mRNA人肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1(metastasis associated in lung denocarcinoma transcript 1,MALAT1)可以通過結(jié)合miR-200a調(diào)節(jié)泛素E3連接酶(membrane-associated RING-CH7,MARCH7)的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控卵巢癌細(xì)胞遷移和侵襲[12]。lncRNA H19表達(dá)下調(diào)會(huì)通過增強(qiáng)miR-124-3p和整合素β 3(integrin beta 3,ITGB3)表達(dá)進(jìn)而抑制異位子宮內(nèi)膜中的細(xì)胞侵襲和增殖[13]。還有研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA膜聯(lián)蛋白A2假基因3(lncRNA annexin A2 pseudogene 3,lncRNAANXA2P3)可以通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-613和miR-206抑制mRNA轉(zhuǎn)酮醇酶(transketolase,TKT)的表達(dá)引發(fā)非梗阻性無精子癥[14]。這說明lncRNAs、假基因等作為ceRNA對(duì)哺乳動(dòng)物繁殖有著重要調(diào)控作用。本課題組基于基因組學(xué)技術(shù)將太行山羊附睪分為9個(gè)功能區(qū)段[15]，其中，附睪頭I段有大量高表達(dá)且具有多重功能的β防御素和免疫調(diào)節(jié)因子，如β防御素124(beta-defensin124,gDEFB124)、脂質(zhì)運(yùn)載蛋白5(lipocalin 5,LCN5)、淋巴細(xì)胞抗原6復(fù)合體G5B(lymphocyte antigen 6 complex locus protein G5B,LY6G5B)等[15-17]，因此，附睪頭是附睪具有免疫調(diào)控機(jī)制的特殊區(qū)段。然而，有關(guān)附睪頭區(qū)段免疫的調(diào)控機(jī)理尚不清楚。

基于多組學(xué)技術(shù)系統(tǒng)研究不同RNAs之間的互作關(guān)系和ceRNAs機(jī)制為本研究提供了思路[18-20]，因此，本試驗(yàn)以幼齡和成年太行山羊附睪頭區(qū)段為研究對(duì)象，采用高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行l(wèi)ncRNAs、miRNAs測(cè)序并分析lncRNAs-miRNAs-mRNAs關(guān)系，篩選出差異表達(dá)ceRNAs，進(jìn)一步構(gòu)建附睪頭與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)ceRNAs網(wǎng)絡(luò)。本研究可為附睪發(fā)育過程中免疫調(diào)控機(jī)制研究提供參考，為揭示山羊附睪頭免疫調(diào)控的分子機(jī)制提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物和樣品采集

試驗(yàn)動(dòng)物來源于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院試驗(yàn)羊場(chǎng)，選取2月齡性成熟前和成年2周歲健康狀況良好、體重相近的太行山羊各3只。通過去勢(shì)手術(shù)取同一側(cè)幼齡山羊附睪頭(2月齡，KEH)和成年山羊附睪頭(2周歲，AEH)組織作為全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序樣品，分別放入2 mL凍存管暫時(shí)保存在液氮罐，隨后置于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

PrimeScrip RT reagent kit with gDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa,Japan)，TB GreenTMPremix Ex TaqTMII(TaKaRa,Japan)定量試劑盒；miRNA定量表達(dá)檢測(cè)使用的M5 miRNA cDNA synthesis Kit加尾法逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和M5 miRNA qPCR Assay Kit定量試劑盒(含下游引物)均購自北京聚合美生物有限公司；其他無機(jī)試劑均購自北京康達(dá)偉宏科技有限公司。

1.3 RNA提取、cDNA文庫構(gòu)建及Illumina測(cè)序

使用TRIzol試劑分別提取6個(gè)樣品RNA，經(jīng)質(zhì)量控制檢測(cè)合格后，分別用于smallRNA、lncRNA 和mRNA文庫的構(gòu)建。使用NEB Next Ultra small RNA Sample Library Prep Kit for Illumina 試劑盒對(duì)6個(gè)合格樣品分別構(gòu)建各自的small RNA文庫。對(duì)同批次樣品提取的RNA去除rRNA后使用Truseq RNA sample Prep Kit試劑盒進(jìn)行各自lncRNA和mRNA文庫構(gòu)建。對(duì)構(gòu)建好的文庫用Illumina公司的Illumina HiSeq高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，得到raw reads。

1.4 附睪頭組織差異mRNAs、lncRNAs和miRNAs篩選

對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制后得到clean reads，與山羊參考基因組(ASM170441v1)比對(duì)和映射，在服務(wù)器上統(tǒng)計(jì)reads counts估計(jì)表達(dá)量，使用StringTie (v1.3.1)和DESeq2 (v1.18.0)軟件進(jìn)行l(wèi)ncRNAs、mRNAs表達(dá)定量和差異表達(dá)篩選(|log2(FC)|≥1，F(xiàn)DR<0.01)。利用miRDeep2(v2.0.5)、RNAfold(v2.1.7)和Bowtie(v1.0.0)軟件進(jìn)行已知及新miRNAs鑒定及其表達(dá)定量，使用DESeq2軟件對(duì)差異表達(dá)miRNAs進(jìn)行篩選(|log2(FC)|≥1，F(xiàn)DR<0.01)。

1.5 差異ceRNAs篩選與功能注釋

使用miRanda(v3.3a)軟件分別預(yù)測(cè)差異miRNAs 的靶mRNAs和靶l(wèi)ncRNAs，篩選出具有與miRNAs相互調(diào)節(jié)關(guān)系的lncRNAs和mRNAs；運(yùn)用R語言軟件包(reshape2、dplyr、tidyr)，根據(jù)RNAs表達(dá)量，使用皮爾森相關(guān)性分析確定差異表達(dá)miRNAs分別與差異表達(dá)的lncRNAs和mRNAs 差異表達(dá)的皮爾森相關(guān)系數(shù)(cor<-0.8，P<0.01)，以及差異表達(dá)lncRNAs和差異表達(dá)mRNAs的皮爾森相關(guān)系數(shù)(cor>0.8，P<0.01)，篩選出具有ceRNAs統(tǒng)計(jì)學(xué)意義和相互調(diào)節(jié)關(guān)系的lncRNAs和mRNAs?；赾eRNA-score原理，利用自己編寫的R語言腳本篩選分析得到幼齡和成年太行山羊附睪頭差異ceRNAs。再對(duì)被GO和KEGG數(shù)據(jù)庫注釋過具有ceRNAs關(guān)系的mRNAs進(jìn)行GO和KEGG 富集分析，篩選顯著富集結(jié)果(P<0.05)。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果

為了進(jìn)一步保證測(cè)序結(jié)果的可靠性，用測(cè)序樣品提取的RNA為PCR擴(kuò)增模板，對(duì)隨機(jī)挑選的8個(gè) mRNAs、8個(gè)miRNAs和8個(gè)lncRNAs進(jìn)行qRT-PCR分析。使用PrimeScrip RT reagent kit with gDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和TB GreenTMPremix Ex TaqTMII定量試劑盒對(duì)目標(biāo)mRNAs和lncRNAs 進(jìn)行定量，使用M5 miRNA cDNA synthesis Kit加尾法逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和M5 miRNA qPCR Assay Kit定量試劑盒對(duì)目標(biāo)miRNAs進(jìn)行定量。相對(duì)表達(dá)量結(jié)果采用2-ΔΔCt法計(jì)算得到。mRNAs和lncRNAs定量檢測(cè)以18S為內(nèi)參，miRNAs 引物信息表見表1，miRNAs定量檢測(cè)以U6作為miRNA 的內(nèi)參，上游引物參照定量試劑盒說明書設(shè)計(jì)，ncRNAs引物信息表見表2，下游引物為試劑盒通用引物。

表1 mRNAs 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列Table 1 The primer sequences of mRNAs for qRT-PCR

表2 ncRNAs 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列Table 2 The primer sequences of ncRNAs for qRT-PCR

2 結(jié) 果

2.1 幼齡和成年太行山羊附睪頭組織全轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)分析

DESeq2分析結(jié)果顯示，以幼齡太行山羊附睪頭為對(duì)照，成年太行山羊附睪頭差異表達(dá)mRNAs有6 461個(gè)，其中2 997個(gè)上調(diào)、3 464個(gè)下調(diào)(圖1A)；差異表達(dá)lncRNAs共有1 147個(gè)，其中703個(gè)上調(diào)、444個(gè)下調(diào)(圖1B)；差異表達(dá)miRNAs共有182個(gè)，其中81個(gè)上調(diào)、101個(gè)下調(diào)(圖1C)。差異表達(dá)譜可用于ceRNAs機(jī)制分析。

2.2 mRNAs-lncRNAs-miRNAs 差異ceRNAs分析

根據(jù)lncRNAs、mRNAs與miRNAs之間的靶向關(guān)系和表達(dá)量相關(guān)性，基于ceRNA-score原理，在篩選出的ceRNAs機(jī)制中有3 131個(gè)mRNAs，其中1 253個(gè)上調(diào)，1 878個(gè)下調(diào)(圖1D)；有366個(gè)lncRNAs可作為ceRNAs，其中213個(gè)上調(diào)，153個(gè)下調(diào)(圖1E)；有140個(gè)miRNAs可作為ceRNAs，其中48個(gè)上調(diào)，92個(gè)下調(diào)(圖1F)。

紅色代表上調(diào)，藍(lán)色代表下調(diào)；A、B、C分別代表差異表達(dá)mRNAs、lncRNAs和miRNAs；D、E、F分別代表ceRNAs機(jī)制中差異表達(dá)的mRNAs、lncRNAs和miRNAsRed denote up-regulation,blue denote down-regulation;A,B,C denote the differentially expressed mRNAs,lncRNAs and miRNAs respectively;D,E,F denote the differentially expressed ceRNAs-mRNAs,ceRNAs lncRNAs and ceRNAs miRNAs,respectively圖1 差異表達(dá)RNAs的火山圖Fig.1 Volcano plot of the differentially expressed RNAs

2.3 差異ceRNAs機(jī)制中mRNAs的GO與KEGG分析

對(duì)具有ceRNAs機(jī)制的幼齡和成年太行山羊附睪頭差異mRNAs進(jìn)行GO富集分析(圖2)，結(jié)果顯示，參與分子功能的mRNAs涉及催化活性、轉(zhuǎn)運(yùn)活性、分子轉(zhuǎn)導(dǎo)活性等；參與生物學(xué)過程的mRNAs主要涉及細(xì)胞過程、單有機(jī)體過程、生物調(diào)控、代謝過程等；參與細(xì)胞組分的mRNAs位于細(xì)胞器、胞內(nèi)、胞外區(qū)等位置。KEGG分析共挖掘出11個(gè)顯著富集的通路(圖3)，在顯著富集通路中有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工通路、蛋白質(zhì)輸出通路、粘蛋白型O-聚糖生物合成通路、細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用通路，這些通路可參與調(diào)節(jié)附睪頭內(nèi)精子成熟或免疫過程。

紅色代表生物過程，綠色代表細(xì)胞組分，藍(lán)色代表分子功能Red denotes biology process,green denotes cellular component,blue denotes molecular function圖2 ceRNAs機(jī)制中差異表達(dá)mRNAs的GO富集分析Fig.2 GO analysis of differentially expressed mRNAs in the ceRNAs mechanism

圖3 ceRNAs機(jī)制中差異表達(dá)mRNAs的KEGG富集分析Fig.3 KEGG enrichment analysis of differentially expressed mRNAs in the ceRNAs mechanism

2.4 ceRNAs機(jī)制中顯著變化的lncRNAs、miRNAs及其靶基因

表3顯示了ceRNAs機(jī)制中表達(dá)量顯著上調(diào)和下調(diào)的前10位lncRNAs及其預(yù)測(cè)靶基因。從表3可知，與幼齡太行山羊附睪頭lncRNAs表達(dá)量相比，成年附睪頭中顯著上調(diào)前10位lncRNAs的log2(FC)>11.24。在lncRNAs靶向mRNAs中與免疫相關(guān)的基因有DNAJB12、RBM47、NRBF2、DENND1B、USO1、ADAM28、MBOAT7、DUSP6和ACER3。

表3 ceRNAs機(jī)制中上調(diào)和下調(diào)前10的差異lncRNAsTable 3 Top 10 differentially expressed lncRNAs with up- and down-regulation in the ceRNAs mechanism

表4顯示了ceRNAs機(jī)制中表達(dá)量顯著上調(diào)和下調(diào)的前10位miRNAs及其預(yù)測(cè)靶基因。從表4可知，與幼齡太行山羊附睪頭lncRNAs表達(dá)量相比，成年附睪頭中顯著上調(diào)前10位miRNAs 的log2(FC)>4.54。在miRNAs靶向mRNAs中與免疫相關(guān)有SCN8A、CEBPB、RHBDL2、UNC93A、TMEM9B。

表4 ceRNAs機(jī)制中上調(diào)和下調(diào)前10的差異miRNAsTable 4 Top 10 differentially expressed miRNAs with up- and down-regulation in the ceRNAs mechanism

2.5 ceRNAs機(jī)制中顯著變化mRNAs及免疫相關(guān)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

表5顯示了ceRNAs機(jī)制中表達(dá)量顯著上調(diào)和下調(diào)前10位mRNAs。與免疫相關(guān)的基因有LY6G5B、脂質(zhì)運(yùn)載蛋白9(epididymal-specific lipocalin-9,LCN9)、解整合素金屬蛋白酶28(adisintegrinand metalloproteinase,ADAM28)和粘蛋白15(mucin 15,MUC15)，與雄性繁殖調(diào)控相關(guān)的有跨膜附睪蛋白1(transmembrane Epididymal Protein 1,TEDDM1)和ADAM7。上述與免疫和繁殖調(diào)控相關(guān)的基因在成年太行山羊附睪頭表達(dá)的FPKM值均在300以上，|log2(FC)|>10且極顯著高于幼齡太行山羊(P<0.01)。

表5 ceRNAs機(jī)制中上調(diào)和下調(diào)前10的差異mRNAsTable 5 Top10 differentially expressed mRNAs with up- and down-regulation in the ceRNAs mechanism

以表達(dá)量顯著上調(diào)前5位中與免疫相關(guān)的基因LY6G5B、LCN9、ADAM28和MUC15為核心，繪制附睪頭中調(diào)控免疫功能ceRNA網(wǎng)絡(luò)(圖4)。圖4顯示，lncRNA-MSTRG.22929.11、lncRNA-MSTRG.57822.5、lncRNA-MSTRG.26758.1、lncRNA-MSTRG.12113.3、lncRNA-MSTRG.59930.2等lncRNA可靶向miR-495-3p、miR-455-5p和miR-218等miRNAs進(jìn)而調(diào)控LY6G5B、LCN9、ADAM28和MUC15的表達(dá)。

紅色菱形代表lncRNAs，綠色方形代表mRNAs，藍(lán)色圓形代表miRNAsRed diamonds denote lncRNAs,green squares denote mRNAs,blue circles denote miRNAs圖4 免疫相關(guān)關(guān)鍵的ceRNAs網(wǎng)絡(luò)Fig.4 Network for immune-related key ceRNAs

2.6 全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的qRT-PCR驗(yàn)證

為了驗(yàn)證全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性，對(duì)幼齡和成年太行山羊附睪頭全轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)譜中隨機(jī)選擇的8個(gè)mRNAs、8個(gè)lncRNAs和8個(gè)miRNAs 進(jìn)行驗(yàn)證(圖5)，結(jié)果表明，除chi-miR-320-3p外，其余隨機(jī)選取的幼齡和成年太行山羊附睪頭差異表達(dá)mRNAs、lncRNAs和miRNAs的熒光定量結(jié)果與全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的差異倍數(shù)雖然存在偏差，但是兩者之間的上、下調(diào)表達(dá)趨勢(shì)一致。

圖5 RNA-Seq差異表達(dá)mRNAs和ncRNAs的qRT-PCR驗(yàn)證Fig.5 qRT-PCR verification for the differentially expressed mRNAs and ncRNAs results of RNA-Seq

3 討 論

哺乳動(dòng)物出生后附睪需經(jīng)過未分化期、分化期和擴(kuò)張期3個(gè)階段發(fā)育后才能發(fā)揮正常的生理功能，公鼠分別在出生后21 d完成細(xì)胞增殖[21]，此時(shí)血-附睪屏障也基本形成，以阻止血液中的免疫細(xì)胞、免疫蛋白等進(jìn)入附睪，為附睪細(xì)胞差異分化重新構(gòu)建附睪特異免疫系統(tǒng)提供微環(huán)境[22-23]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)了大量與雄性繁殖相關(guān)的lncRNAs 和miRNAs等非編碼RNAs[24-26]，但非編碼RNAs對(duì)附睪獨(dú)特免疫系統(tǒng)形成的調(diào)控機(jī)制仍不明晰，尚需進(jìn)一步研究探明。本研究采用多組學(xué)技術(shù)比較分析了幼齡和成年太行山羊附睪頭顯著差異表達(dá)lncRNAs-miRNAs-mRNAs的ceRNAs機(jī)制。

本研究基于幼齡和成年太行山羊附睪頭多組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，具有ceRNA調(diào)控作用的差異基因顯著富集在催化活性、轉(zhuǎn)運(yùn)活性和分子轉(zhuǎn)導(dǎo)活性等GO分子功能條目上。其中，已有研究證明，表3中的lncRNA-MSTRG.33179.3靶基因DUSP6[27]、lncRNA-MSTRG.17938.1靶基因USO1[28]、lncRNA-MSTRG.57822.6靶基因PGM1[29]、lncRNA-MSTRG.57822.5靶基因ATP6V0B[30]，表4中的chi-miR-410-3p靶基因UNC93A[31]、chi-miR-376d靶基因RHBDL2[32]、chi-miR-154b-5p靶基因SLC12A5[33]等蛋白均具有轉(zhuǎn)運(yùn)活性、分子轉(zhuǎn)導(dǎo)或催化功能，這些結(jié)果佐證了本研究GO富集分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。

具有ceRNAs調(diào)控機(jī)制的顯著上調(diào)的LY6G5B、ADAM28、MUC15和LCN9在成年山羊附睪頭中高表達(dá)，這些基因均與炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答相關(guān)[34-41]，說明lncRNA作為ceRNA對(duì)這些附睪免疫相關(guān)基因的表達(dá)具有極其復(fù)雜的調(diào)控過程，同時(shí)，這些高度活躍的免疫相關(guān)基因蛋白的合成、分泌以及轉(zhuǎn)運(yùn)需要內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工通路、蛋白質(zhì)輸出通路、粘蛋白型O-聚糖生物合成通路的參與，這支持了本研究KEGG富集分析的結(jié)果。

ADAM28是ADAM家族成員，包含ADAM家族共有的金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域。金屬蛋白酶是調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)微環(huán)境蛋白降解的主要執(zhí)行蛋白，同時(shí)在細(xì)胞-基質(zhì)的黏連和細(xì)胞-細(xì)胞的黏連中也具有重要作用[35]。Miyamae等[36]發(fā)現(xiàn),ADAM28定位于附睪上皮細(xì)胞，同時(shí)，ADAM28可通過結(jié)合補(bǔ)體C1q(complement 1q,C1q)誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞死亡和自噬，而C1q表達(dá)異常通常見于急性炎癥感染。本研究轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果表明，成年山羊附睪頭ADAM28表達(dá)量極顯著高于幼年，同時(shí)發(fā)現(xiàn)C1q在附睪頭中也有表達(dá)，因此推測(cè)，山羊性成熟后附睪頭ADAM28可能在調(diào)控血-附睪屏障上附睪上皮細(xì)胞之間的黏連、附睪微環(huán)境基質(zhì)穩(wěn)態(tài)以及附睪上皮細(xì)胞死亡和自噬中發(fā)揮重要作用，可能是附睪頭炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答的關(guān)鍵分子。

MUC15是膜型黏蛋白家族成員，對(duì)于保護(hù)組織黏膜和促進(jìn)上皮細(xì)胞的更新和分化具有重要作用。研究表明，MUC15可以通過激活p-ERK使MAPK信號(hào)通路活化[37]，參與機(jī)體炎癥反應(yīng)和應(yīng)激反應(yīng)。也有研究表明，MUC15可以與表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)相互作用調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路進(jìn)而調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)[38]，同時(shí)，PI3K/Akt信號(hào)通路也可以調(diào)控白細(xì)胞介素-8、白細(xì)胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α等促炎因子的表達(dá)[39-40]。本研究中成年山羊附睪頭MUC15表達(dá)量顯著高于幼年的，但轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)附睪頭有ERK基因的表達(dá)，而EGFR在附睪頭中有表達(dá)，同時(shí)，78個(gè)基因富集于PI3K/Akt信號(hào)通路，這提示MUC15可能通過與EGFR受體結(jié)合來調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號(hào)通路進(jìn)而對(duì)附睪頭微環(huán)境與附睪頭炎癥反應(yīng)發(fā)揮影響，為本課題組下一步研究提供了思路。

LY6G5B是LY6超家族的成員，在中性粒細(xì)胞、子宮內(nèi)膜細(xì)胞和腸上皮細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)有LY6家族蛋白的表達(dá)，其蛋白通過GPI錨定在細(xì)胞表面，中性粒細(xì)胞Ly6G蛋白可以調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞向炎癥部位的遷移[34]，介導(dǎo)炎癥部位炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果表明，附睪頭LY6G5B基因在成年附睪頭中高度表達(dá)，說明LY6G5B在附睪頭免疫中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。LCN9基因編碼的蛋白是附睪特異脂質(zhì)運(yùn)載蛋白9，是lipocalin家族的成員，在附睪頭中高度表達(dá)，可運(yùn)送疏水性小分子到特定細(xì)胞，參與調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)與炎癥應(yīng)答[41]，但其在山羊附睪頭的功能及作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探明。

在圖5繪制的免疫相關(guān)關(guān)鍵ceRNAs網(wǎng)絡(luò)中，miR-495-3p、miR-455-5p和miR-218已被證實(shí)與免疫相關(guān)。miR-495-3p是與炎性反應(yīng)相關(guān)的miRNA，其靶向Toll樣受體基因(toll like receptor 4,TLR4)，調(diào)控NF-κB通路抑制炎性因子的產(chǎn)生[42]。miR-455-5p直接靶標(biāo)髓樣分化因子(myeloid differentiation factor 88,MyD88)和Rel，在多發(fā)性硬化癥中發(fā)揮抗炎作用[43]。miR-218通過下調(diào)2，3雙加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase 1,IDO1)抑制宮頸癌細(xì)胞的免疫逃逸[44]。本研究的附睪頭轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)中也有TLR4、MyD88、Rel和IDO1基因，另外miR-495-3p、miR-455-5p和miR-218靶向LY6G5B、LCN9、ADAM28和MUC15免疫相關(guān)基因，說明miR-495-3p、miR-455-5p和miR-218通過這些靶標(biāo)基因發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。本試驗(yàn)篩選出的ceRNAs均為生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)結(jié)果，還需進(jìn)一步進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證。

近年來,研究發(fā)現(xiàn)了lncSmad3、lncEGFR和LncLsm3b等大量與免疫相關(guān)的lncRNAs[45]，這些研究表明，lncRNAs對(duì)炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答具有重要作用，本研究分析結(jié)果也說明，lncRNAs可做為附睪頭免疫應(yīng)答調(diào)控分子。由于lncRNAs可通過介導(dǎo)表觀遺傳、ceRNAs機(jī)制、miRNAs前體等多種方式調(diào)控機(jī)體生命活動(dòng)[46]，ceRNA機(jī)制只是其中一種，因此，本研究篩選所得具有ceRNAs機(jī)制中l(wèi)ncRNAs的其他作用有待進(jìn)一步挖掘。另外，本試驗(yàn)從幼齡和成年太行山羊附睪頭差異ceRNAs機(jī)制表達(dá)譜中除篩選得到免疫相關(guān)關(guān)鍵ceRNAs調(diào)控網(wǎng)絡(luò)之外，該機(jī)制中其他基因還參與能量代謝、抗氧化系統(tǒng)、蛋白合成等相關(guān)生物學(xué)過程，推測(cè)這可能與附睪頭發(fā)育及附睪精子成熟等有關(guān)，具體調(diào)控機(jī)制還需進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)及生物信息學(xué)分析獲得了3 131個(gè)幼齡和成年太行山羊的附睪頭差異表達(dá)ceRNAs，具有ceRNAs機(jī)制的基因顯著富集通路與免疫功能相關(guān)。成年附睪頭高表達(dá)的免疫相關(guān)基因LY6G5B、LCN9、ADAM28和MUC15具有復(fù)雜ceRNAs調(diào)控機(jī)制，這為進(jìn)一步研究非編碼RNAs對(duì)太行山羊附睪頭免疫調(diào)控作用提供了參考依據(jù)。