蔡春波，劉 敏，楊 陽，張萬鋒，高鵬飛，曹果清，李步高,郭曉紅

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，太谷 030801)

肌內(nèi)脂肪含量是評價豬肉品質(zhì)的一個重要指標(biāo)，而豬的背脂厚度與肌內(nèi)脂肪含量呈明顯的正相關(guān)，兩者都與脂肪酸的合成相關(guān)[1]。此外，脂肪組織還能分泌多種蛋白類激素，例如瘦素和脂聯(lián)素，通過組織液滲透和血液循環(huán)等方式運(yùn)輸?shù)狡渌M織中，調(diào)控機(jī)體的新陳代謝[2]。脂肪組織的生成過程主要包括脂肪細(xì)胞數(shù)量的增多和甘油三酯的積累而導(dǎo)致的脂肪細(xì)胞的體積增大。篩選調(diào)控脂肪細(xì)胞增殖和成脂分化的關(guān)鍵因子對提高肌內(nèi)脂肪含量和改良豬肉品質(zhì)具有重要的意義。

microRNA(miRNA)是一類長約22 nt，具有調(diào)控基因表達(dá)功能的單鏈內(nèi)源性非編碼RNA。miRNA基因常以單拷貝、多拷貝或基因簇的形式存在于生物基因組中，廣泛存在真核和原核生物體內(nèi)。miRNA可以通過與互補(bǔ)的mRNA序列特異性地結(jié)合，從而降解mRNA或者抑制mRNA的翻譯，進(jìn)而參與機(jī)體相關(guān)生物學(xué)過程的調(diào)節(jié)。miRNA可通過調(diào)控靶基因的表達(dá)從而調(diào)控細(xì)胞的增殖、遷移[3-7]和分化[8-13]。miRNA對哺乳動物卵泡發(fā)育、卵母細(xì)胞成熟[14]和奶牛乳腺發(fā)育、乳脂合成[15]都具有重要的調(diào)控作用。miRNA對脂肪組織形成過程也具有重要的調(diào)控作用。研究表明，miR-331-3p能夠抑制前體脂肪細(xì)胞的增殖，而且可以通過靶向二氫硫辛酰胺琥珀酰轉(zhuǎn)移酶(dihydrolipoamide succinyltransferase，DLST)促進(jìn)萊蕪豬原代前體脂肪細(xì)胞成脂分化[16]；miR-125b-5p能夠抑制3T3-L1細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其成脂分化[17]；miR-204-5p可以通過調(diào)節(jié)B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，BCL-2)的表達(dá)，抑制前體脂肪細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，同時也可以通過靶向和抑制Kruppel樣轉(zhuǎn)錄因子3(Kruppel-like factor 3，KLF3)的表達(dá)，促進(jìn)前體脂肪細(xì)胞的分化[18]。

miR-186-5p最先在小鼠中被發(fā)現(xiàn)，其種子序列在各物種間高度保守，它的主要功能是抑制癌細(xì)胞的增殖，如骨肉瘤[19]、大腸癌[20]、膽管癌[21]、神經(jīng)母細(xì)胞瘤[22]、肺腺癌[23]。另外，miR-186-5p能夠抑制骨橋蛋白(osteopontin，OPN)的表達(dá)，進(jìn)而抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化[24]；miR-186-5p能夠抑制myogenin基因的表達(dá)，從而抑制C2C12細(xì)胞的成肌分化[25-26]；在3T3-L1細(xì)胞中，miR-186-5p可抑制細(xì)胞增殖，而且還可以直接靶向結(jié)合無翅型MMTV整合位點(diǎn)家族成員5A(wingless type MMTV integration site family member 5A，WNT5A)和促分裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase 1，Mapk1)，促進(jìn)細(xì)胞成脂分化[27]。目前，關(guān)于miR-186-5p對豬前體脂肪細(xì)胞的調(diào)控作用還未見報道。本研究以馬身豬原代前體脂肪細(xì)胞為細(xì)胞模型，探究miR-186-5p對豬前體脂肪細(xì)胞增殖、遷移和成脂分化的調(diào)控作用和機(jī)制，進(jìn)一步完善miRNA調(diào)控豬脂肪細(xì)胞分化的分子網(wǎng)絡(luò)，為改良豬肉品質(zhì)提供新的分子靶標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

DMEM培養(yǎng)基(Hyclone，美國)，胎牛血清FBS(Gibco，美國)，油紅O、地塞米松(DEX)、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)和羅格列酮(RSG)(中國，索萊寶)，TRIZOL?Reagent(Life Technologies，美國)，PrimeScript?RT Master Mix(TaKaRa，日本)，miRNA 1 st Strand cDNA Synthesis Kit (by stem-loop)、AceQ?Universal SYBR qPCR Master Mix和miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix(諾唯贊，中國)，miR-186-5p mimics、inhibitor、mimics NC和inhibitor NC委托上海吉瑪公司合成，CCK8試劑盒(博士德生物，中國)，psiCHECK-2載體和Dual-Luciferase?Reporter Assay System(Promega，美國)。

1.2 主要儀器

核酸蛋白測定儀(ND-1000，美國)、實(shí)時熒光定量PCR儀(7500 Real Time，美國)、全功能微孔板檢測儀(SynerGyH1，美國)、細(xì)胞成像系統(tǒng)(EVOS FL Auto，美國)等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 豬原代前體脂肪細(xì)胞的分離培養(yǎng) 采集7日齡健康馬身豬公豬的頸部皮下脂肪組織，PBS清洗3次，剪碎后轉(zhuǎn)移至Ⅰ型膠原酶溶液(1 g·L-1)中，37 ℃振蕩消化60 min，加入完全培養(yǎng)基(DMEM+10% FBS+1%雙抗)終止消化；混合液經(jīng)過400目細(xì)胞篩過濾，濾液離心后棄上清液，然后加入紅細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞，室溫下靜置5 min，再次離心棄上清液，最后加入完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，置入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；24 h后加入PBS緩沖液清洗細(xì)胞，然后加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每2 d換新鮮的完全培養(yǎng)基。

1.3.2 豬原代前體脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)染 豬原代前體脂肪細(xì)胞的匯合度達(dá)到60%時，進(jìn)行轉(zhuǎn)染試驗(yàn)。首先將miR-186-5p的mimics (mimics NC、inhibitor和inhibitor NC的轉(zhuǎn)染方法與mimics一致)稀釋成終濃度為100 nmol·μL-1的工作液；20 μL mimics工作液中加入500 μL的DMEM培養(yǎng)基，混勻后靜置5 min；10 μL的LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑中加入500 μL的DMEM培養(yǎng)基，混勻后靜置5 min；將上述兩種溶液混合后，室溫靜置20 min，加入3 mL的DMEM培養(yǎng)基，混勻后加入到鋪有豬原代前體脂肪細(xì)胞的6孔板中，然后放置在培養(yǎng)箱中孵育，6 h后更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.3 CCK8試驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染后的豬原代前體脂肪細(xì)胞接種至96孔細(xì)胞板中培養(yǎng)，分別培養(yǎng)0、24、48和72 h后加入10 μL的CCK8試劑，輕輕搖晃混勻，37 ℃靜置孵育1 h，酶標(biāo)儀檢測450 nm波長下的OD值。

1.3.4 劃痕試驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染后的豬原代前體脂肪細(xì)胞接種至96孔細(xì)胞板中，當(dāng)細(xì)胞的匯合度達(dá)到100%后，在培養(yǎng)孔中輕輕劃出痕跡，再將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0、24、36和72 h后觀察劃痕處細(xì)胞的生長狀態(tài)。

1.3.5 RNA提取及cDNA合成 按RNA提取試劑盒的步驟提取豬原代前體脂肪細(xì)胞的總RNA。cDNA的合成分為兩步：第一步，總RNA中加入DNA去除劑，再加入雙蒸水至10 μL，42 ℃條件下反應(yīng)2 min；第二步，混合液中加入反轉(zhuǎn)錄酶，通用引物和緩沖液，終體積為20 μL，37 ℃反應(yīng)15 min，85 ℃反應(yīng)5 s，保存于-20 ℃冰箱。

1.3.6 miRNA的反轉(zhuǎn)錄 按照miRNA 1 st Strand cDNA Synthesis Kit (by stem-loop)試劑盒的步驟對miRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。RNA溶液中加入DNA去除劑，加雙蒸水至10 μL，42 ℃反應(yīng)2 min；向混合液中加入反轉(zhuǎn)錄酶、緩沖液、miRNA 和U6的反轉(zhuǎn)錄引物，終體積為20 μL，25 ℃ 反應(yīng)5 min，55 ℃反應(yīng)15 min，85 ℃反應(yīng)5 min，產(chǎn)物保存于-20 ℃ 冰箱。

1.3.7 豬原代前體脂肪細(xì)胞成脂分化和油紅O染色 當(dāng)豬原代前體脂肪細(xì)胞的匯合度達(dá)到90%時，更換為成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)基+5 μmol·L-1INS + 1 μmol·L-1DEX+0.5 mmol·L-1IBMX + 1 μmol·L-1RSG)，每2 d 換液；誘導(dǎo)分化4 d后，更換維持成脂分化培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)基 + 5 μmol·L-1INS)，每2 d換液；維持成脂分化4 d后，進(jìn)行油紅O染色。細(xì)胞首先經(jīng)過4%多聚甲醛固定45 min，PBS清洗3次，油紅O工作液(飽和油紅O∶蒸餾水=3∶2)染色30 min，蒸餾水沖洗干凈，在顯微鏡下觀察并拍照。然后加入異丙醇萃取細(xì)胞中的甘油三酯(triglyceride，TG)，酶標(biāo)儀測量波長為510 nm處的OD值。

1.3.8 SYBR熒光定量qPCR qPCR的反應(yīng)體系為10 μL：包括2×SYBR Mixture 5 μL，上游引物和下游引物各0.3 μL，模板 cDNA 1 μL，RNase-free H2O 3.4 μL。qPCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火及延伸30 s，40個循環(huán)。引物序列見表1，18S和U6為內(nèi)參基因。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.3.9 雙熒光素酶報告試驗(yàn) 首先構(gòu)建2種雙熒光素酶報告載體：SIRT2 3′UTR野生型載體(SIRT2-Wt-psiCHECK-2)和SIRT2 3′UTR突變型載體(SIRT2-Mut-psiCHECK-2)。然后分為4組進(jìn)行293T細(xì)胞共轉(zhuǎn)染試驗(yàn)：SIRT2-Wt-psiCHECK-2 + mimics、SIRT2-Wt-psiCHECK-2 + mimics NC、SIRT2-Wt-psiCHECK-2 + inhibitor、SIRT2-Mut-psiCHECK-2+mimics。4組共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞的方法一樣，以SIRT2-Wt-psiCHECK-2 + mimics為例，簡述轉(zhuǎn)染方法。293T細(xì)胞的匯合度達(dá)到70%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染試驗(yàn)；50 μL DMEM中加入2 μL mimics(100 nmol·μL-1)和1 μL SIRT2-Wt-psiCHECK-2(500 ng·μL-1)重組質(zhì)粒，混勻后靜置5 min；另取50 μL DMEM中加入1.5 μL LipofectamineTM2000溶液，混勻后靜置5 min；將上述兩種溶液混合，混勻后靜置20 min；293T細(xì)胞的培養(yǎng)基更換為DMEM，然后加入上述混合溶液，混勻后置于培養(yǎng)箱中孵育6 h，然后更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；每組設(shè)3個重復(fù)，24 h后檢測熒光素酶的活性。首先吸出293T細(xì)胞中培養(yǎng)基，PBS洗滌3次，加入100 μL細(xì)胞裂解緩沖液，吹打細(xì)胞至完全裂解，收集樣品；然后將熒光素酶底物與緩沖液混合制成熒光素酶試劑，stop&Glo緩沖液與stop&Glo底物混合制成stop&Glo試劑；最后96孔 板中加入20 μL樣品和100 μL熒光素酶試劑，混勻后測量熒光值，再加入100 μL stop&Glo試劑，混勻后再次測量熒光值。

1.3.10 數(shù)據(jù)分析 試驗(yàn)均設(shè)置3個重復(fù)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以“Mean ± SD”表示。數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism7軟件進(jìn)行作圖分析，兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，并進(jìn)行Duncan’s多重比較，以P<0.05作為差異顯著性的界值，P<0.01作為差異極顯著性的界值。

2 結(jié) 果

2.1 miR-186-5p抑制豬原代前體脂肪細(xì)胞的增殖

豬原代前體脂肪細(xì)胞分為4組，分別轉(zhuǎn)染miR-186-5p的mimics、mimics NC、inhibitor和inhibitor NC，通過CCK8試驗(yàn)檢測各組細(xì)胞的增殖效果，qPCR檢測細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)。與轉(zhuǎn)染mimics NC組相比，轉(zhuǎn)染miR-186-5p mimics組細(xì)胞中miR-186-5p的表達(dá)量極顯著升高(P<0.01，圖1A)，24、48和72 h的細(xì)胞數(shù)量都極顯著降低(P<0.01，圖1B)，細(xì)胞增殖相關(guān)基因PCNA和CDK4的表達(dá)量也極顯著降低(P<0.01，圖1C)。與inhibitor NC組相比，轉(zhuǎn)染miR-186-5p inhibitor組細(xì)胞中miR-186-5p的表達(dá)量極顯著降低(P<0.01，圖1D)，24、48和72 h的細(xì)胞數(shù)量都顯著增加(P<0.05，圖1B)，細(xì)胞增殖相關(guān)基因PCNA和CDK4的表達(dá)量也極顯著升高(P<0.01，圖1C)。結(jié)果說明，miR-186-5p可以抑制豬原代前體脂肪細(xì)胞增殖。

對轉(zhuǎn)染后的4組豬原代前體脂肪細(xì)胞進(jìn)行劃痕試驗(yàn)，通過觀察劃痕中長滿細(xì)胞所需要的時間，檢測每組細(xì)胞的增殖效果。轉(zhuǎn)染miR-186-5p mimics組細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，劃痕處仍然具有明顯的空隙(圖2A)；而轉(zhuǎn)染mimics NC組細(xì)胞培養(yǎng)36 h后，細(xì)胞基本鋪滿整個劃痕(圖2B)。轉(zhuǎn)染miR-186-5p inhibitor組細(xì)胞培養(yǎng)36 h后，細(xì)胞基本鋪滿整個劃痕(圖2C)；而轉(zhuǎn)染inhibitor NC組細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，劃痕處仍然具有明顯的空隙(圖2D)。結(jié)果說明，miR-186-5p可以抑制豬原代前體脂肪細(xì)胞的增殖。

2.2 miR-186-5p促進(jìn)豬原代前體脂肪細(xì)胞成脂分化

對轉(zhuǎn)染后的4組豬原代前體脂肪細(xì)胞進(jìn)行成脂誘導(dǎo)分化，然后通過油紅O染色和qPCR試驗(yàn)檢測各組細(xì)胞的成脂分化狀態(tài)。與轉(zhuǎn)染mimics NC組相比，轉(zhuǎn)染miR-186-5p mimics組細(xì)胞中miR-186-5p的表達(dá)量極顯著升高(P<0.01，圖3A)，成脂分化相關(guān)基因PPARγ、SREBF1、C/EBPβ、FABP4和LPL的表達(dá)量都極顯著升高(P<0.01，圖3B)，脂滴數(shù)量明顯增加(圖3C)，甘油三酯含量也極顯著增加(P<0.01，圖4D)。結(jié)果說明，miR-186-5p mimics可以促進(jìn)豬原代前體脂肪細(xì)胞成脂分化。

與轉(zhuǎn)染inhibitor NC組細(xì)胞相比較，轉(zhuǎn)染miR-186-5p inhibitor組細(xì)胞的miR-186-5p的表達(dá)量極顯著降低(P<0.01，圖4A)，成脂分化相關(guān)基因PPARγ、SREBF1、C/EBPβ、FABP4和LPL的表達(dá)量都極顯著降低(P<0.01，圖4B)，脂滴數(shù)量明顯減少(圖4C)，甘油三酯含量也顯著降低(P<0.05，圖4D)。結(jié)果說明，miR-186-5p inhibitor可以抑制豬原代前體脂肪細(xì)胞成脂分化。

2.3 miR-186-5p靶基因的檢測

通過軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，miR-186-5p可以與SIRT2基因的3′UTR序列反向互補(bǔ)結(jié)合(圖5A)，且miR-186-5p和SIRT2基因在豬原代前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)成脂分化過程中表達(dá)趨勢相反(圖5B和5C)。豬原代前體脂肪細(xì)胞中過表達(dá)miR-186-5p后，SIRT2的表達(dá)量極顯著降低(P<0.01,圖5D)；抑制miR-186-5p后，SIRT2的表達(dá)量極顯著的升高(P<0.01，圖5E)。為進(jìn)一步驗(yàn)證SIRT2與miR-186-5p的靶向關(guān)系，進(jìn)行了雙熒光素酶報告試驗(yàn)。檢測結(jié)果顯示(圖5F)，與共轉(zhuǎn)染mimics NC + SIRT2-Wt-psiCHECK-2野生型載體組和共轉(zhuǎn)染inhibitor + SIRT2-Wt-psiCHECK-2野生型載體組細(xì)胞相比，共轉(zhuǎn)染mimics + SIRT2-Wt-psiCHECK-2野生型載體組的293T細(xì)胞中熒光素酶的活性極顯著降低(P<0.01)，說明miR-186-5p可以靶向結(jié)合SIRT2 3′UTR序列，抑制SIRT2基因的表達(dá)；而且與共轉(zhuǎn)染mimics NC + SIRT2-Wt-psiCHECK-2野生型載體組細(xì)胞相比，共轉(zhuǎn)染mimics + SIRT2-Mut-psiCHECK-2野生型載體組的293T細(xì)胞中熒光素酶的活性沒有明顯變化，說明SIRT2 3′UTR序列的突變消除了miR-186-5p對SIRT2基因表達(dá)的抑制作用，進(jìn)一步說明miR-186-5p可以靶向結(jié)合SIRT2 3′UTR序列，抑制SIRT2基因的表達(dá)。

A.mimics轉(zhuǎn)染效率；B.轉(zhuǎn)染mimics后CCK8結(jié)果；C.轉(zhuǎn)染mimics后PCNA、CDK4基因的表達(dá)量；D.inhibitor轉(zhuǎn)染效率；E.轉(zhuǎn)染inhibitor后CCK8結(jié)果；F.轉(zhuǎn)染inhibitor后PCNA、CDK4基因的表達(dá)量。*.P<0.05，**.P<0.01，下同A.Mimics transfection efficiency;B.CCK8 results after mimics transfection;C.The expression of PCNA and CDK4 genes after mimics transfection;D.Inhibitor transfection efficiency;E.CCK8 results after inhibitor transfection;F.The expression of PCNA and CDK4 genes after inhibitor transfection;*.P<0.05,**.P<0.01,the same as below圖1 miR-186-5p對豬原代前體脂肪細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Effects of miR-186-5p on proliferation of porcine primary preadipocytes

A.轉(zhuǎn)染mimics；B.轉(zhuǎn)染mimics NC；C.轉(zhuǎn)染inhibitor；D.轉(zhuǎn)染inhibitor NCA.Transfected mimics;B.Transfected mimics NC;C.Transfected inhibitor;D.Transfected inhibitor NC圖2 劃痕試驗(yàn)的結(jié)果(50×)Fig.2 The results of scratch test (50×)

A.mimics轉(zhuǎn)染效率；B.成脂相關(guān)基因的表達(dá)量；C.油紅O染色結(jié)果(50 ×)；D.異丙醇萃取結(jié)果A.Mimics transfection efficiency;B.The expression of genes related to adipogenesis;C.Oil red O staining results (50 ×);D.Isopropanol extraction results圖3 miR-186-5p mimics促進(jìn)豬原代前體脂肪細(xì)胞成脂分化Fig.3 miR-186-5p mimics promote adipogenic differentiation of porcine primary preadipocytes

A.inhibitor轉(zhuǎn)染效率；B.成脂相關(guān)基因的表達(dá)量；C.油紅O染色結(jié)果(50 ×)；D.異丙醇萃取結(jié)果A.Inhibitor transfection efficiency;B.The expression of genes related to adipogenesis;C.Oil red O staining results (50 ×);D.Isopropanol extraction results圖4 miR-186-5p inhibitor抑制豬原代前體脂肪細(xì)胞成脂分化Fig.4 miR-186-5p inhibitor inhibit adipogenic differentiation of porcine primary preadipocytes

A.SIRT2 3′UTR的結(jié)合位點(diǎn)及突變位點(diǎn)；B、C.豬原代前體脂肪細(xì)胞成脂分化過程中miR-186-5p與SIRT2的表達(dá)量；D、E.過表達(dá)和抑制miR-186-5p時SIRT2的表達(dá)量；F.雙熒光素酶報告試驗(yàn)結(jié)果。標(biāo)注不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，標(biāo)注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)A.The binding site and mutation site of SIRT2 3′UTR;B,C.The expression of miR-186-5p and SIRT2 during adipogenic differentiation of porcine primary preadipocytes;D,E.The expression of SIRT2 after miR-186-5p overexpression and inhibition;F.The result of dual-luciferase reporter assay.Different capital letters indicate very significant difference (P<0.01) and different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05)圖5 miR-186-5p靶基因的檢測Fig.5 Detection of miR-186-5p target gene

3 討 論

miRNA的長度約22 nt，屬于單鏈內(nèi)源性非編碼RNA。miRNA序列較短，很容易通過化學(xué)合成的方式獲得。構(gòu)建特異性的miRNA載體和化學(xué)合成miRNA序列，然后轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，都可以特異性增強(qiáng)或抑制內(nèi)源性miRNA的表達(dá)。由于miRNA的序列較短，化學(xué)合成miRNA的成本較低，而且短序列的轉(zhuǎn)染效率更高，操作也更加簡單，減少了構(gòu)建載體的步驟，因此，通過轉(zhuǎn)染化學(xué)合成的miRNA，增強(qiáng)或抑制內(nèi)源miRNA的表達(dá)，成為miRNA功能研究的主要方法。目前，化學(xué)合成的miRNA主要分為4種，分別是mimics、inhibitor、agomir和antagomir。mimics是化學(xué)合成的成熟雙鏈miRNA，是miRNA的模擬物，能夠增強(qiáng)內(nèi)源miRNA的調(diào)控作用。agomir是經(jīng)過特殊標(biāo)記和化學(xué)修飾的雙鏈小RNA，屬于miRNA激動劑，通過模擬內(nèi)源性miRNA來調(diào)節(jié)靶基因的生物學(xué)功能，作用效果持續(xù)時間長。inhibitor是化學(xué)修飾的成熟miRNA互補(bǔ)單鏈，屬于miRNA抑制物，通過特異地靶向miRNA分子削弱內(nèi)源miRNA的調(diào)控作用。antagomir是經(jīng)過特殊標(biāo)記和化學(xué)修飾的miRNA拮抗劑，特異性削弱內(nèi)源miRNA的調(diào)控作用，具有更高的穩(wěn)定性，作用效果持續(xù)時間長。agomir和antagomir都經(jīng)過特殊化學(xué)修飾，雖然其作用效果更強(qiáng)，持續(xù)時間更久，但是其價格也較為昂貴，主要用于活體動物試驗(yàn)。本研究探討miR-186-5p對豬原代脂肪前體細(xì)胞的調(diào)控作用，并沒有在活體水平上研究其功能，所以采用miR-186-5p mimics和inhibitor。

miR-186-5p的主要功能是抑制癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。Zhu等[22]研究發(fā)現(xiàn)，miR-186-5p可以通過靶向抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤中驅(qū)動蛋白5(kinesin-5，EG5)的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。Feng等[23]發(fā)現(xiàn)，miR-186-5p可以通過靶向抑制磷脂酶和張力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog，PTEN)的表達(dá)促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。Cao等[28]發(fā)現(xiàn)，miR-186-5p可以抑制轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白β樣1X 連鎖受體1(transducin β like 1X-linked receptor 1，TBL1XR1)的表達(dá)，抑制骨肉瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。這些研究說明，在不同的癌細(xì)胞中，miR-186-5p對癌細(xì)胞的調(diào)控作用并不一致。miR-186-5p也可以抑制綿羊黑色素細(xì)胞的增殖和遷移，減少黑色素的沉積[29]。豬屬于脂肪沉積型動物，脂肪含量非常高。豬脂肪組織形成過程中，細(xì)胞增殖發(fā)揮著重要的作用，決定著成熟脂肪細(xì)胞的數(shù)量；而miR-186-5p對癌細(xì)胞的增殖和遷移過程具有重要的調(diào)控作用；因此，猜測miR-186-5p可能會通過調(diào)節(jié)豬前體脂肪細(xì)胞的增殖過程來調(diào)控成熟脂肪細(xì)胞的數(shù)量，進(jìn)而最終影響豬的脂肪沉積。目前，關(guān)于miR-186-5p對豬脂肪沉積調(diào)控作用的研究還未見報道。因此，本研究以馬身豬原代前體脂肪細(xì)胞為細(xì)胞模型，探討miR-186-5p對豬前體脂肪細(xì)胞增殖和成脂分化的調(diào)控作用。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-186-5p可以抑制馬身豬原代前體脂肪細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其成脂分化。

miRNAs的主要作用方式是通過調(diào)控靶基因的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)其對機(jī)體的調(diào)控。本研究通過軟件預(yù)測SIRT2為miR-186-5p的靶基因。SIRT2是與酵母的沉默信息調(diào)節(jié)因子2(silent information regulator 2,SIR2)同源的去乙?；?，屬于sirtuin蛋白家族成員，在脂肪細(xì)胞中大量表達(dá)[30]。SIRT2主要定位于細(xì)胞質(zhì)，但在有絲分裂過程中可以從細(xì)胞質(zhì)中轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核[31]。SIRT2能參與調(diào)節(jié)多種生物過程，包括細(xì)胞周期、卵泡發(fā)育、卵母細(xì)胞成熟、DNA修復(fù)、自噬等過程[32-34]。Jing等[35]發(fā)現(xiàn)，3T3-L1細(xì)胞中敲除SIRT2基因，叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O1 (forkhead box O1，F(xiàn)oxO1)的乙?；土姿峄蕉硷@著升高，導(dǎo)致細(xì)胞核中的FoxO1轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中，減弱了FoxO1對PPARγ的抑制作用，從而促進(jìn)細(xì)胞成脂分化。Wang和Tong[36]也發(fā)現(xiàn)，SIRT2可以通過抑制FoxO1的乙酰化，增強(qiáng)FoxO1對PPARγ的抑制作用，從而抑制3T3-L1細(xì)胞的成脂分化。劉炳婷等[37]發(fā)現(xiàn)，在豬原代前體脂肪細(xì)胞中過表達(dá)SIRT2可以抑制其成脂分化。本研究也發(fā)現(xiàn),miR-186-5p可以靶向結(jié)合SIRT2的3′UTR序列，抑制SIRT2的表達(dá)，促進(jìn)馬身豬原代前體脂肪細(xì)胞的成脂分化。因此，miR-186-5p可以通過靶向抑制SIRT2的表達(dá)，增強(qiáng)FoxO1的乙?；剑龠M(jìn)PPARγ的表達(dá)，促進(jìn)馬身豬原代前體脂肪細(xì)胞成脂分化。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果顯示，miR-186-5p可以靶向結(jié)合SIRT2的3′UTR序列，降低SIRT2的表達(dá)，抑制馬身豬原代前體脂肪細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其成脂分化。