李夢柔，韋明邦，張 健，邢 璐，徐士軍，肖青青，葉幼榮，董世雄，段夢琪，商 鵬

(西藏農(nóng)牧學院動物科學學院，林芝 860000)

低氧適應(yīng)性的研究在人類醫(yī)學[1-4]、動植物生理[5-7]和航空航天[8-9]等方面都有著重要的意義。高原地區(qū)是天然的低氧環(huán)境，藏豬是典型的地方小型豬種，長期生存于低溫、缺氧、強紫外線等惡劣環(huán)境條件的高原地區(qū)，已形成了能夠穩(wěn)定遺傳的高原低氧適應(yīng)機制[10-11]，是研究高原低氧適應(yīng)性的理想豬種。腎是人體的重要器官，隨著對心腎綜合征和腎移植等方面的研究，腎在低氧環(huán)境中的適應(yīng)機制已成為研究者關(guān)注的焦點之一[12-15]。正常生理狀態(tài)下，腎組織含氧量受到嚴格調(diào)控，持續(xù)暴露在低氧的環(huán)境中，氧化應(yīng)激會引起腎損傷[16]，血管內(nèi)皮細胞腫脹，小動脈壁增厚，腎小管發(fā)生進行性間質(zhì)損傷和炎癥，引起機體高血壓和紅細胞增多[17]。缺氧會刺激腎持續(xù)分泌激素，刺激促紅細胞生成素的表達，同時調(diào)節(jié)腎血流量和腎氧張力[18]。Yu等[19]研究發(fā)現(xiàn)，體外低氧誘導(dǎo)的腎小管，通過促進腎小管上皮細胞增殖和改善線粒體功能，在急性腎小管損傷中具有保護作用。Yan和Xu[20]研究表明，促紅細胞生成素(EPO)主要由腎分泌，慢性腎疾病發(fā)生時常伴隨EPO分泌不足，導(dǎo)致貧血。

本研究以高原地區(qū)藏豬和大約克豬的腎組織為研究對象，采用iTRAQ技術(shù)分析不同品種豬蛋白表達差異情況，從蛋白水平上對低氧適應(yīng)機制進行研究。為進一步研究豬高原低氧適應(yīng)機制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗動物選擇藏豬與大約克豬，均飼養(yǎng)于西藏農(nóng)牧學院實習牧場(海拔3 000 m)，為無親緣關(guān)系的健康去勢公豬，按自由采食方式開展同期飼養(yǎng)，飼養(yǎng)至180日齡后每個品種隨機挑選生長情況相近的試驗動物各9頭進行屠宰，藏豬(n=9)體重為(33.12±2.15) kg，大約克豬(n=9)體重為(77.49±1.40) kg，分別取其腎組織，液氮速凍后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱 進行保存。

1.2 腎組織蛋白樣品處理及質(zhì)量檢測

兩個品種豬的腎組織總蛋白提取使用哺乳動物組織總蛋白提取試劑盒(北京邦菲生物科技有限公司，AP0601-50)和Bradford蛋白濃度測定試劑盒(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司，KMS01)進行蛋白定量，利用SDS-PAGE電泳檢測蛋白樣品質(zhì)量。

1.3 腎組織蛋白酶解及iTRAQ標記分級

1.3.1 蛋白酶解 取已定量的蛋白200 μg溶液至離心管中，加入5 μL 1 mol·L-1二硫蘇糖醇(DTT)溶液混勻，37 ℃放置1 h，之后室溫條件下加入20 μL 1 mol·L-1碘代乙酰胺(IAA)溶液并放置1 h，隨后移入超濾管中離心棄收集液，在超濾管中按照蛋白和酶100∶1的比例加入Trypsin，37 ℃酶解不超過12 h。

1.3.2 iTRAQ標記分級 各組樣品肽段取100 μg，使用iTRAQ Reagent-8plex Multiplex Kit(AB SCIEX,美國)進行標記。在高pH條件下進行C18色譜柱的HPLC分級，5 min開始收集洗脫物至離心管中，真空冷凍離心干燥，樣品使用5 μL的甲酸(FA)重溶。分離梯度見表1。

表1 高pH反相色譜分離梯度Table 1 High pH reversed phase chromatographic separation gradient

1.4 LC-MS/MS質(zhì)譜分析

樣品使用納升流速HPLC液相系統(tǒng)分離，以95%的A液(0.1%FA，H2O)平衡，樣品上樣至質(zhì)譜頸柱，經(jīng)分析柱分離，液相色譜洗脫梯度見表2。

表2 液相色譜洗脫梯度參數(shù)Table 2 Liquid chromatographic elution gradient parameters

經(jīng)毛細管高效液相色譜分離后用質(zhì)譜儀Orbitrap Fusion Lumos(Thermo Scientific)進行質(zhì)譜分析。

1.5 數(shù)據(jù)庫與數(shù)據(jù)分析

使用搜庫軟件Proteome Discoverer對所得數(shù)據(jù)在數(shù)據(jù)庫Uniprot_Sus_scrofa(下載于2019年1月 2日，共49 003條序列)中進行搜索，對所得肽段數(shù)據(jù)以錯誤發(fā)生率(FDR)≤0.01進行過濾后，進行肽段的識別鑒定以及對肽段報告離子峰強度值進行定量分析。

1.6 差異蛋白的GO和KEGG富集分析

鑒定出的全部蛋白以FC>1.2或<0.833且P<0.05的條件進行篩選。使用網(wǎng)站Metascape(http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)對所獲得的DEPs進行GO和KEGG分析。此時篩選P<0.05即差異顯著的通路以待后續(xù)分析。

2 結(jié) 果

2.1 腎組織蛋白定量標準曲線

對藏豬與大約克豬腎組織總蛋白進行定量分析，標準曲線繪制結(jié)果中計算出標準曲線相關(guān)系數(shù)R2>0.9(圖1)，即相關(guān)性良好，符合下一步試驗要求。

圖1 蛋白定量標準曲線Fig.1 Protein quantitative standard curve

2.2 腎組織蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳

根據(jù)標準曲線計算各蛋白樣品的濃度和電泳體積進行SDS-PAGE電泳，結(jié)果顯示，電泳條帶清晰，無降解(圖2)，所提取總蛋白質(zhì)可以滿足后續(xù)的試驗。

T1、T2、T3.藏豬樣品；Y1、Y2、Y3.大約克豬樣品T1,T2,T3.The samples of Tibetan pig;Y1,Y2,Y3.The samples of Yorkshire pig圖2 SDS-PAGE電泳圖Fig.2 SDS-PAGE electrophoresis diagram

2.3 兩個豬種腎組織蛋白質(zhì)鑒定

在iTRAQ項目中匹配到肽段的二級譜圖數(shù)目總數(shù)為81 060個，共計獲得22 706個肽段，對其進行過濾后，在FDR≤0.01的條件下，共計獲得4 370個蛋白。在蛋白質(zhì)質(zhì)量分布上，60.89%的蛋白質(zhì)分布在10～60 ku之間(圖3)；肽段序列覆蓋率的分布中，肽段序列覆蓋率超過10%的蛋白占比為51.78%，超過20%的蛋白質(zhì)比例為26.06%(圖4)，表明在所有的鑒定蛋白中，該數(shù)據(jù)中肽段覆蓋率較高且所鑒定蛋白的序列覆蓋情況較好。

底部數(shù)字為蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量(ku)，百分比數(shù)字為腎組織中蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的分布The bottom numbers are the relative molecular weight of protein(ku),and the percentage numbers are the distribution of molecular weight of protein in kidney tissue圖3 蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量分布Fig.3 Relative molecular weight distribution of proteins

圖4 蛋白質(zhì)序列覆蓋度分布圖Fig.4 The distribution of protein sequence coverage

以差異倍數(shù)FC>1.2或<0.833，P<0.05為條件對藏豬與大約克豬的腎組織差異蛋白進行篩選，得到181個DEPs，其中上調(diào)138個，下調(diào)43個。差異表達蛋白的聚類圖(圖5)顯示，兩品種內(nèi)的生物學重復(fù)性較好，藏豬作為典型的高原適應(yīng)性動物與大約克豬有著明顯的差異。

圖5 181個DEPs聚類圖Fig.5 The clustering map of 181 DEPs

2.4 DEPs功能富集分析

使用Metascape對藏豬與大約克豬腎組織的DEPs進行GO功能注釋。在181個DEPs中，有152個在Metascape數(shù)據(jù)庫中被注釋，GO條目被分為生物過程(BP)、分子功能(MF)和細胞組成(CC)3個部分(圖6)。進一步KEGG pathway富集分析得到DEPs功能分布在13個通路中(圖7)。其中，62個DEPs富集在小分子分解代謝過程(small molecule catabolic process)，氨基酸代謝過程(alpha-amino acid meta bolic process)，輔因子代謝過程(cofactor metabolic process)、藥物分解過程(drug catabolic process)，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解(valine,leucine and isoleucine degradation)，碳代謝(carbon metabolism)，乙醛酸和二羧酸代謝(glyoxylate and dicarboxylate metabolism)，氨基糖和核苷酸糖代謝(amino sugar and nucleotide sugar metabolism)等代謝相關(guān)的條目與通路中。46個DEPs富集在氧化還原酶活性(oxidoreductase activity)、C-?；D(zhuǎn)移酶活性(C-acyltransferase activity)、3-羥基?；?CoA脫氫酶活性(3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase activity)、裂合酶活性(lyase activity)等與酶活性相關(guān)的條目。51個 DEPs富集在傷口愈合(wound healing)、血壓調(diào)節(jié)(regulation of blood pressure)、線粒體基質(zhì)(mitochondrial matrix)、PPAR信號通路(PPAR signaling pathway)、補體和凝血級聯(lián)信號通路(complement and coagulation cascades)、HIF-1信號通路(HIF-1 signaling pathway)等與低氧適應(yīng)相關(guān)的條目與通路中。

圖7 藏豬與大約克豬腎組織差異表達蛋白通路分析Fig.7 Pathway analysis of differentially expressed proteins in kidney tissues of Tibetan pigs and Yorkshire pigs

2.5 與低氧適應(yīng)相關(guān)DEPs的篩選

通過對DEPs功能分析，在補體和凝血級聯(lián)信號通路、HIF-1信號通路中篩選出5個與低氧適應(yīng)相關(guān)的DEPs，見表3。

表3 重要DEPs分析Table 3 The important DEPs analysis

3 討 論

本試驗以具有穩(wěn)定遺傳低氧適應(yīng)特征的藏豬和通過應(yīng)激性調(diào)節(jié)適應(yīng)高原低氧環(huán)境的大約克豬為研究對象，利用iTRAQ技術(shù)對高原飼養(yǎng)的兩個品種豬的腎組織進行差異表達蛋白篩選，篩選得到181個DEPs，其中在藏豬中上調(diào)的蛋白質(zhì)有138個，下調(diào)的蛋白質(zhì)有43個。篩選出的181個DEPs分別富集在與代謝、酶活性、低氧適應(yīng)等相關(guān)的條目與通路中，推測這些蛋白在維持機體低氧環(huán)境下的供氧與供能起到重要調(diào)節(jié)作用。Navarro-Yepes等[21]研究發(fā)現(xiàn)，當機體持續(xù)暴露在低氧環(huán)境中，組織細胞因長時間的供氧缺乏導(dǎo)致氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)細胞凋亡，為維持各組織器官的生理穩(wěn)態(tài)，機體會發(fā)生一系列氧化應(yīng)激和自噬調(diào)節(jié)來維持組織細胞生存。持續(xù)低氧環(huán)境下，誘導(dǎo)激活HIF-1信號通路，可提高糖酵解的效率，降低線粒體損傷和凋亡[22-24]，同時可增強細胞增殖活力、促進血管生成[25]，以保障機體氧氣和能量的供應(yīng)與代謝，維持組織穩(wěn)態(tài)。

在缺氧條件下，呼吸、循環(huán)、代謝等系統(tǒng)的組織器官對機體氧化應(yīng)激進行調(diào)節(jié)[26-27]，激活補體和凝血級聯(lián)、HIF-1等信號通路，誘導(dǎo)多種蛋白參與機體調(diào)節(jié)[28-30]。本研究通過GO與KEGG對DEPs進行功能富集和分析，發(fā)現(xiàn)其中有5個重要的DEPs在激活補體和凝血級聯(lián)信號通路、HIF-1信號通路上富集，分別為：CD59、A2M、eNOS、CDKN1B、PGK1。CD59作為膜攻擊復(fù)合物形成的抑制劑來調(diào)節(jié)補體激活，在低氧條件下內(nèi)皮細胞CD59表達的劑量呈現(xiàn)依賴性增加[31]，CD59通過補體的活化在保護紅細胞中起重要作用[32]。A2M在血管外膜成纖維細胞和內(nèi)皮細胞中表達，在血管平滑肌中起調(diào)控作用，血管重塑的過程中起到重要作用[33]。eNOS是鈣依賴性一氧化氮合酶，與肺和血管中堿性一氧化氮的合成有關(guān)，在調(diào)控血管張力、血壓和血流中起著重要作用[34]。張博等[35]研究發(fā)現(xiàn)，高原豬的eNOS基因表達量極顯著高于低地豬，低地豬引進高原后心肌組織中eNOS基因表達增加，舒張血管，提高血流量，維持機體供氧[36-37]。CDKN1B控制細胞G1期，CDKN1B由缺氧誘導(dǎo)，引起機體細胞周期停滯，成為G1晚期的氧依賴性限制點[38-39]，當心肌微血管內(nèi)皮細胞受到缺血再灌注損傷，上調(diào)表達CDKN1B蛋白，起到參與保護血管內(nèi)皮的作用[40]。PGK1是調(diào)節(jié)糖酵解的蛋白激酶，在糖酵解的第二階段起限速作用，調(diào)節(jié)能量產(chǎn)生和氧化還原平衡[41]。缺氧條件下PGK1表達上升，促進糖酵解，并協(xié)調(diào)糖酵解和線粒體代謝，為細胞代謝提供ATP[42]。

4 結(jié) 論

綜上所述，通過對兩個豬種腎組織DEPs進行篩選與功能分析，發(fā)現(xiàn)它們分別富集在代謝、酶活性、低氧適應(yīng)性等相關(guān)條目與通路中。這些DEPs在血管內(nèi)皮保護，維持血管張力和血壓，維持低氧環(huán)境中機體能量代謝等生理調(diào)節(jié)中起到重要作用，維持機體組織在低氧環(huán)境下的機體血液動力學和組織穩(wěn)態(tài)，保障機體氧氣與能量的供應(yīng)。同時，在激活補體和凝血級聯(lián)信號通路和HIF-1信號通路中篩選出與低氧適應(yīng)相關(guān)的5個重要DEPs(CD59、A2M、eNOS、CDKN1B、PGK1)，為進一步研究豬低氧適應(yīng)性提供理論依據(jù)。