楊文兵，鄒亞文，蔣一凡，余婉婷，楊 毅，鄔 靜*，王乃東*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128；2.獸用蛋白質(zhì)工程疫苗湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙 410128；3.獸用疫苗逆向創(chuàng)制湖南省工程研究中心，長(zhǎng)沙 410128)

非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)是目前唯一已知的蟲媒DNA病毒，該病毒外殼呈二十面體對(duì)稱(260～300 nm)，有囊膜，且擁有較大的基因組(170～194 kb)[1-2]。ASFV具有復(fù)雜的逃逸宿主免疫機(jī)制[3]，可引起急性、熱性、出血性和高致死性的傳染病，即非洲豬瘟(ASF)[4]。1921年，首次報(bào)道了肯尼亞ASF疫情[5]，此后該疫病蔓延，相繼在葡萄牙、意大利、法國(guó)和俄羅斯等地出現(xiàn)[6-8]。2018年8月，中國(guó)沈陽(yáng)確診首例ASF，對(duì)該地ASFV進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，該病毒株屬于p72基因Ⅱ型和CD2v血清群8，被命名為ASFV SY18株(亦稱China 2018/1)[9-10]，隨后ASF在我國(guó)內(nèi)陸所有省份出現(xiàn)，至今已給中國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失[11-12]。

消除ASF疫情需要長(zhǎng)期戰(zhàn)略。目前尚無(wú)商品化疫苗[13-14]，所以積極、長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)豬群中ASFV感染的相關(guān)情況，能為發(fā)現(xiàn)病例并采取及時(shí)的應(yīng)對(duì)措施提供有效依據(jù)[15-16]。目前檢測(cè)豬體內(nèi)ASFV病原基因或其抗原(體)是判斷豬群是否感染的重要手段，而血清學(xué)檢測(cè)可用于豬群ASF監(jiān)測(cè)篩查和輔助診斷[11]。豬感染 ASFV后，特別是亞急性感染，存活個(gè)體作為病毒攜帶者，可在感染后保持可檢測(cè)的抗體水平，此時(shí)基于抗原檢測(cè)抗體是了解發(fā)病特定區(qū)域內(nèi)的豬群ASF發(fā)病情況所不可或缺的，因此監(jiān)控ASFV特異性抗體在確定感染狀態(tài)方面很重要[16]。而如果ASFV弱毒疫苗或不同組分亞單位疫苗在臨床上實(shí)現(xiàn)應(yīng)用，ASFV抗體檢測(cè)方法作用亦尤為重要，比如野毒感染和疫苗免疫的鑒別診斷、疫苗效果評(píng)估等。

ASFV重要蛋白的保守性及其抗原性具有實(shí)驗(yàn)室診斷學(xué)意義。ASF血清學(xué)檢測(cè)研究已經(jīng)采用了p30、p54和p72等多個(gè)保守蛋白，其中p30蛋白含量豐富，為早期病毒蛋白(CP204L基因編碼)[17]，可在感染細(xì)胞后2～4 h內(nèi)觀察到，并在整個(gè)感染周期中持續(xù)表達(dá)，當(dāng)檢測(cè)到細(xì)胞表達(dá)p30蛋白時(shí)，表明病毒已經(jīng)進(jìn)入細(xì)胞和脫殼，并且早期病毒基因表達(dá)已經(jīng)開始[18-19]；p30蛋白是ASFV感染過(guò)程中引起體液免疫應(yīng)答重要的抗原蛋白，針對(duì)p30的抗體可阻止病毒內(nèi)吞，能夠在病毒與細(xì)胞吸附之前或之后中和病毒，是重要的病毒早期診斷靶點(diǎn)[20-21]。p54也為早期病毒蛋白(E183L基因編碼)，蛋白分子中含有一段跨膜區(qū)域，對(duì)病毒蛋白經(jīng)過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜轉(zhuǎn)化成病毒包膜前體起重要作用[22]，而p54在Vero細(xì)胞的瞬時(shí)表達(dá)，可導(dǎo)致效應(yīng)因子caspase-3的激活和細(xì)胞凋亡[18,23]；用重組 p54 蛋白免疫豬可誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體，針對(duì)p54的抗體可在病毒與細(xì)胞吸附之前中和病毒，p54蛋白抗原性良好，其抗體可在豬感染ASFV 8 d 后出現(xiàn)，并可持續(xù)數(shù)周，是高敏感性和特異性ELISA 等抗體檢測(cè)方法的重要候選蛋白[20,24]。p72是在病毒感染后期表達(dá)的主要結(jié)構(gòu)蛋白(B646L基因編碼)，是ASFV二十面體衣殼的主要成分，p72分子可形成穩(wěn)定的三聚體，呈典型雙“果凍卷”結(jié)構(gòu)[25]。p72是ASFV高免疫原性蛋白之一，亦是ELISA等血清學(xué)診斷的重要靶點(diǎn)，p72抗體也可阻止ASFV吸附到巨噬細(xì)胞，但不能在抗體介導(dǎo)的免疫保護(hù)中起決定性作用[18,26]；CD2v在病毒感染后期表達(dá)(EP402R基因編碼)，是CD2的同系物，可引起病毒毒力增強(qiáng)、紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象[27]。CD2v和C型凝集素蛋白介導(dǎo)ASFV的血凝抑制(hemagglutination inhibition，HAI)血清學(xué)特異性，CD2v和C型凝集素特征序列為ASFV血清型分組提供了一種簡(jiǎn)單方法[18,28]。先前研究認(rèn)為CD2v免疫原性較弱[29-30]，但近期研究發(fā)現(xiàn)CD2v蛋白或其多克隆抗體均表現(xiàn)出良好的免疫反應(yīng)性[30-32]，這提示CD2v蛋白可能是潛在的血清學(xué)診斷靶點(diǎn)。而ASFV CD2v(EP402R)基因的缺失苗對(duì)親本(BA71)與異源毒株(Ⅰ、Ⅱ型毒株)均具有一定的保護(hù)作用[33-34]。

1 ASF血清學(xué)診斷靶點(diǎn)的應(yīng)用

1.1 抗體檢測(cè)方法

自ASFV發(fā)現(xiàn)以來(lái)，陸續(xù)有利用p72、p54和p30等候選蛋白研發(fā)不同形式的ASFV抗體血清學(xué)檢測(cè)方法。目前已經(jīng)有世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(Office International Des Epizooties，OIE)介紹的INgezim PPA COMPAC ELISA[35]、俄羅斯商用試劑盒“VNIIVViM ASF-ELISA Ab/Ag”[36]、法國(guó)ID-VET間接ELISA試劑盒、瑞典SVANOVIR抗體ELISA試劑盒、西班牙INGENASA抗體ELISA試劑盒[37-38](表1)。而利用ASFV蛋白建立準(zhǔn)確、靈敏和方便的ELISA應(yīng)用于抗體檢測(cè)仍是研究熱點(diǎn)之一，其中p72或p30為包被抗原檢測(cè)ASFV IgG抗體的ELISA可應(yīng)用于血清或糞便抗體篩查，兩種ELISA最早可在感染ASFV減毒株(Ken05)第9天 的糞便樣本中檢測(cè)到抗體，糞便抗體檢測(cè)結(jié)果可比血清樣本推遲達(dá)2.67 d[39]；基于重組蛋白p30 的ASFV IgG抗體ELISA可用于血清或唾液樣本中抗體檢測(cè)，而且該p30間接ELISA可以在低毒力ASFV分離株(NHV/P68)感染的第8天時(shí)檢出唾液中的ASFV抗體，計(jì)算26 dpi(day post inoculation)內(nèi)的S/P值，將血清與口腔液結(jié)果進(jìn)行比較，除12和18 dpi外，其余各天反應(yīng)均無(wú)顯著差異(P≤0.01)[40]。張蕾等[41]根據(jù)ASFV的p30、p54和p72蛋白設(shè)計(jì)3條合成肽，并建立了抗體ELISA檢測(cè)方法，與西班牙INGENASA抗體ELISA試劑盒結(jié)果符合率達(dá)92.9%。

除了間接ELISA檢測(cè)方法外，側(cè)向流免疫色譜分析、量子點(diǎn)檢測(cè)試紙條、免疫印跡和免疫磁珠法等也被陸續(xù)研發(fā)，并應(yīng)用于ASFV抗體檢測(cè)(表1)。其中，INgezimPPA CROM lateral flow device (INGENASA)以p72蛋白為捕獲抗原，可檢測(cè)血拭子樣本中ASFV抗體[42]；將量子點(diǎn)與免疫層析技術(shù)結(jié)合起來(lái)的ASFV抗體量子點(diǎn)檢測(cè)試紙條使檢測(cè)方法簡(jiǎn)便、穩(wěn)定和靈敏，利用該試紙條可對(duì)320倍稀釋的ASFV陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè)[43]；而以重組p30蛋白為捕獲抗原建立的免疫印跡方法，可對(duì)ASFV強(qiáng)毒株(Stavropol 01/08、К-49)、弱毒株(КК-262/C)等不同毒力、不同血清型感染6～8 d后的血清和免疫系統(tǒng)器官樣本進(jìn)行有效的抗體檢測(cè)[44]。以ASFV p72和p30等為捕獲抗原的免疫磁珠法，在Benin病毒株感染豬8～15 d后采集的血清中，檢測(cè)的ASFV抗體陽(yáng)性率(68%)高于INgezim 11.PPA.K3 ELISA方法(58%)[45]。

表1 ASFV血清學(xué)抗體檢測(cè)技術(shù)Table 1 Serological antibody detection technology for ASFV

對(duì)接種ASFV/NH/P68病毒株后的豬血清進(jìn)行熒光微球免疫試驗(yàn)(fluorescent microsphere immunoassay，F(xiàn)MIA)，發(fā)現(xiàn)ASFV重組蛋白p30與免疫血清中l(wèi)gG的反應(yīng)性明顯高于p72與p54[40]；而Murgia等[46]構(gòu)建了表達(dá)ASFV p30、p54和p72蛋白的α病毒復(fù)制子顆粒(replicon particles，RPs)，并接種Vero細(xì)胞和試驗(yàn)豬，發(fā)現(xiàn)p30在Vero細(xì)胞中表達(dá)量最高，免疫原性最強(qiáng)，這些工作提示p30是建立間接ELISA的最佳候選蛋白之一。

目前，國(guó)內(nèi)外獲批商品化試劑盒未將CD2v蛋白作為診斷靶標(biāo)。但鐘秋萍等[31]利用ASFV SY18病毒株CD2v 胞外區(qū)(24～206 aa)與鐵蛋白融合，大腸桿菌BL21表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)并免疫 BALB/c 小鼠制備了多克隆抗體，經(jīng)間接免疫熒光試驗(yàn)(indiect immunofluorescence assay，IFA)驗(yàn)證該抗體具有特異性。于浩洋等[32]利用真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了CD2v胞外區(qū)(1～206 aa)的蛋白，在間接ELISA的初步試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，該蛋白片段對(duì)豬陽(yáng)性血清具有良好的免疫反應(yīng)性(98.9%特異性、100%敏感性)。周曉慧等[30]利用ASFV SY18病毒株CD2v胞內(nèi)區(qū)(231—333 aa)進(jìn)行表達(dá)研究，使用重組CD2v抗原進(jìn)行ELISA試驗(yàn)，檢測(cè)已知的30份豬ASFV陽(yáng)性和陰性血清，結(jié)果均符合。這些結(jié)果表明，CD2v蛋白中存在抗原表位，其重組抗原有應(yīng)用于抗體檢測(cè)方法的潛力。

pp62蛋白雖作為法國(guó)ID-VET商業(yè)化試劑盒選用的診斷靶點(diǎn)，但將其應(yīng)用于血清學(xué)診斷方法的研究報(bào)道不多。Gallardo等[47]在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)了p30、p54和pp62蛋白，并初步應(yīng)用于ELISA血清學(xué)診斷方法，結(jié)果表明，pp62的抗體檢測(cè)特異性(99%)高于p30與p54(97%)，而且pp62蛋白可對(duì)保存質(zhì)量不佳(如熱處理后)的豬血清進(jìn)行ASFV抗體檢測(cè)，提示pp62可能與ASFV抗體結(jié)合更加穩(wěn)定，或與ASFV抗體親和力高于其他蛋白[47]。

1.2 抗原檢測(cè)方法

近期基于p72抗體的ASFV抗原檢測(cè)方法陸續(xù)被研發(fā)、報(bào)道，包括夾心ELISA、側(cè)向流免疫色譜分析(lateral flow assay，LFA)和膠體金免疫層析法等(表2)。其中，使用抗ASFV Uganda分離株p72的IgG抗體建立了夾心ELISA方法，但應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)抗原濃度較低的樣品(慢性ASFV感染)可能會(huì)出現(xiàn)假陰性，其結(jié)果敏感度較低[48]；以抗p72蛋白的單克隆抗體(18BG3)為捕獲抗體建立了一種用于抗原檢測(cè)的側(cè)向流動(dòng)分析法，其敏感性為RT-PCR的67.86%，超過(guò)50%的LFA檢測(cè)為陰性的血清樣本在RT-PCR結(jié)果中為陽(yáng)性(CT值30)，而這些血清樣本來(lái)自感染ASFV 2周后的豬，說(shuō)明該LFA檢測(cè)方法敏感性較低[49]；膠體金免疫層析法將膠體金與免疫層析技術(shù)結(jié)合，以p72蛋白制備的單抗為捕獲抗體，可識(shí)別15 ng的抗原量(原核表達(dá)載體pET-30A表達(dá)的ASFV p72蛋白)[50]。Szeredi等[51]使用商品化小鼠單克隆抗體(1BC11)，建立了免疫細(xì)胞化學(xué)(immunocytochemical，IC)和免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry，IHC)方法，并用于檢測(cè)ASFV p72蛋白，雖然不適用于大規(guī)模檢測(cè)，但可作為急性ASF的實(shí)驗(yàn)室輔助診斷。

表2 ASFV血清學(xué)抗原檢測(cè)技術(shù)Table 2 Serological antigen detection techniques for ASFV

2 ASF血清學(xué)診斷靶點(diǎn)的抗原表位

最近，陸續(xù)報(bào)道了利用單抗對(duì)ASF血清學(xué)診斷靶點(diǎn)p30、p54和p72的表位進(jìn)行鑒定，獲得了豐富的表位信息，對(duì)ASFV血清學(xué)診斷靶點(diǎn)的抗原表位進(jìn)行解析，將為ASF血清學(xué)診斷和疫苗的研究提供新的靶點(diǎn)。

2.1 p30蛋白

用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)(pHUE載體)表達(dá)了ASFV BA71V病毒株p30全長(zhǎng)蛋白(204 aa)，利用該蛋白制備、篩選獲得3株陽(yáng)性單克隆抗體(47-3、62-35和142-4)，利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)(pHUE載體)以及哺乳動(dòng)物細(xì)胞(pEGFP-C3載體)表達(dá)p30多肽，并對(duì)單抗識(shí)別p30蛋白區(qū)域進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)單抗識(shí)別p30片段的表位序列(mAb47-3識(shí)別61—93 aa；mAb62-35 和mAb142-4識(shí)別120—204 aa)，其中mAb47-3單抗識(shí)別的表位在至少10種ASFV基因型中保守，提示該單抗至少可以檢測(cè)10種基因型毒株[52]。

Wu等[53]使用Sf9昆蟲細(xì)胞桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(pFastBac載體)表達(dá)了ASFV Georgia 2007/1病毒株p30基因片段(70—564 nt)，利用該片段制備篩選獲得14株陽(yáng)性單克隆抗體。利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)(pHUE載體)表達(dá)ASFV BA71V病毒株p30多肽和購(gòu)置的ASFV Georgia 2007/1病毒株的p30寡肽(GenScript公司)，對(duì)單抗識(shí)別p30蛋白的區(qū)域進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)5個(gè)p30的單抗識(shí)別的表位序列(mAb8H2-6識(shí)別61—84 aa；mAb3E10-9識(shí)別84—90 aa；mAb63、mAb181和mAb192識(shí)別96—105 aa；mAb2B9-1、mAb4B6-1、mAb214、mAb330、mAb355和mAb428識(shí)別116—125 aa；mAb8G12-1、mAb81和mAb362識(shí)別146—160 aa)，其中p30蛋白的116—125 aa與146—160 aa區(qū)域和抗體反應(yīng)的陽(yáng)性信號(hào)明顯高于其他區(qū)域，且更具有免疫優(yōu)勢(shì)。通過(guò)對(duì)NCBI基因庫(kù)中86個(gè)p30蛋白序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)116—125 aa與146—160 aa區(qū)域高度保守。Murgia等[46]也同樣發(fā)現(xiàn)了p30的C-末端(111—130 aa)為免疫優(yōu)勢(shì)區(qū)域，Vlad等[54]使用GeneSilico MetaDisorder server預(yù)測(cè)BA71V病毒株p30蛋白，發(fā)現(xiàn)固有無(wú)序(intrinsically disordered proteins，IDP)的區(qū)域(91—143 aa)，表明它可能是不穩(wěn)定的，但I(xiàn)DP在ASFV p30蛋白功能中的意義仍需要進(jìn)一步揭示[52-54]。

2.2 p54蛋白

使用Sf9和Hi-Five昆蟲細(xì)胞桿狀病毒系統(tǒng)(pFastBac載體)表達(dá)ASFV Georgia 2007/1病毒株p54蛋白片段(60—178 aa)，利用該片段制備和篩選出5株單克隆抗體(154-1、143-1、7、117和101)，之后用單克隆抗體對(duì)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)(pHUE載體)表達(dá)ASFV BA71V病毒株p54多肽和購(gòu)置的ASFV Georgia 2007/1病毒株p54寡肽(21stCentury Biochemicals公司)對(duì)單抗的識(shí)別表位區(qū)域進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)4個(gè)p54的單抗識(shí)別的表位序列(mAb154-1識(shí)別65—75 aa；mAb143-1識(shí)別93—107 aa；mAb7識(shí)別97—113 aa；mAb117和mAb101識(shí)別118—127 aa)[46-47]。用BA71V病毒株p54多肽和寡肽分別與一批感染ASFV OURT 88/3弱毒株第17 天的豬血清進(jìn)行抗體結(jié)合鑒定，發(fā)現(xiàn)113—127 aa區(qū)域可與62.5%的ASFV感染豬血清抗體反應(yīng)，且明顯高于其他表位區(qū)域，但遺憾的是，通過(guò)對(duì)26株不同ASFV病毒株的p54蛋白序列對(duì)比發(fā)現(xiàn)p54(117—126 aa)區(qū)域具有高度的差異性[55]。

2.3 p72蛋白

Heimerman等[56]使用Sf9和Hi-Five昆蟲細(xì)胞桿狀病毒系統(tǒng)(pFastBac載體)表達(dá)了ASFV Georgia 2007/1病毒株p72蛋白片段(20—303 aa)，利用該片段制備并篩選獲得6株陽(yáng)性單抗(23、4A4、85、65-3、6H9-1和8F7-3)。隨后利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)(pHUE載體)表達(dá)ASFV BA71V病毒株p72重疊多肽與寡肽對(duì)上述單抗識(shí)別區(qū)域進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)4個(gè)單抗分別結(jié)合p72的不同抗原表位(mAb 85識(shí)別156—165 aa；mAbs 65-3 和 6H9-識(shí)別265—280 aa；mAbs 8F7-3 和 23識(shí)別 280—294 aa；mAb 4A4識(shí)別290—303 aa)。其中，mAb85、mAb8F7-3和mAb23識(shí)別的p72基因中的表位在10種基因型的ASFV毒株中相對(duì)保守，這些抗體有助于開發(fā)抗原捕獲或阻斷ELISA。但部分ASFV毒株的p72基因不保守，特別是在C末端，所以選擇p72抗原區(qū)域或表位研發(fā)血清學(xué)診斷方法時(shí)需謹(jǐn)慎考慮C末端的使用[53,57]。

3 展 望

ASFV含有151～167個(gè)開放閱讀框，可編碼160多種結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白[55,58-60]，ASFV編碼蛋白具有復(fù)雜性，為ASF感染血清學(xué)診斷的新方法研制帶來(lái)了挑戰(zhàn)，也帶來(lái)了機(jī)會(huì)?；谀壳暗腁SFV抗體檢測(cè)方法進(jìn)展發(fā)現(xiàn)，近年來(lái)用于ASFV抗體檢測(cè)的ELISA大多以p30與p72蛋白為基礎(chǔ)。p30與p72 聯(lián)合應(yīng)用于免疫磁珠法可提高檢測(cè)技術(shù)敏感性[45]，使用p30、pp62和p72為包被抗原的法國(guó)ID-VET試劑盒也已商品化[37，61]，提示多種蛋白的聯(lián)合應(yīng)用可提高檢測(cè)方法性能，這為開發(fā)檢測(cè)ASFV抗體和抗原的新方法提供了機(jī)會(huì)。

病毒蛋白表位及其特性鑒定不僅有助于更好地了解病毒的病理學(xué)和宿主免疫反應(yīng)，而且基于保守表位的血清學(xué)檢測(cè)方法有望提供更廣泛的診斷范圍。近年來(lái)，基于多抗原表位的血清學(xué)診斷方法已應(yīng)用于檢測(cè)登革熱病毒、丙型肝炎病毒和甲型肝炎病毒等的抗體，并且方法具有高敏感性和特異性[62-64]。如甲型肝炎病毒(hepatitis A virus，HAV)感染可刺激機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)病毒結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白的抗體。然而，接種滅活或減毒的HAV疫苗只產(chǎn)生針對(duì)結(jié)構(gòu)蛋白的抗體，而不會(huì)產(chǎn)生或產(chǎn)生非常少的針對(duì)非結(jié)構(gòu)蛋白的抗體。Su等[64]構(gòu)建了以HAV非結(jié)構(gòu)蛋白多表位診斷抗原為基礎(chǔ)的雙抗原夾心ELISA(double-antigen sandwich ELISA)來(lái)區(qū)分這種情況，診斷準(zhǔn)確性和實(shí)用性均較好(靈敏度93.75%，特異性93.75%)。重組蛋白或表位多肽在血清學(xué)診斷方面可能比天然抗原更具有優(yōu)勢(shì)[65-66]。多表位重組蛋白由免疫優(yōu)勢(shì)表位區(qū)域組成，沒(méi)有非特異性部分，這可能提高檢測(cè)方法的質(zhì)量[66-68]。而基于近期陸續(xù)獲得的ASFV候選蛋白的單抗和已定義的p30和p54等保守抗原表位或區(qū)域，借助生物信息學(xué)分析技術(shù)，篩選設(shè)計(jì)表位或多表位組合，有望為改進(jìn)ASFV檢測(cè)、監(jiān)測(cè)和疾病控制提供有價(jià)值的新靶點(diǎn)或新組合，并推動(dòng)ASF血清學(xué)診斷的潛在應(yīng)用。而深入了解ASFV保護(hù)性抗原、相關(guān)表位及其在自然界中的多樣性，也將有助于ASFV亞單位疫苗的設(shè)計(jì)和開發(fā)。