胡先華 趙春艷 張海迪 陳書(shū)志 母 波 （川北醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系，南充637000）

癌癥是威脅我國(guó)乃至全球人類(lèi)健康的重大疾病，其發(fā)病率和致死率居各類(lèi)慢性疾病之首［1］。然而，癌癥作為一種長(zhǎng)久以來(lái)存在的惡性疾病，一直難以攻克，這源于惡性腫瘤細(xì)胞獨(dú)有的特征，包括不間斷的生長(zhǎng)信號(hào)刺激、強(qiáng)勁的自我復(fù)制能力、持續(xù)的血管生成、組織浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移能力、逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)控、細(xì)胞代謝異常、基因組的不穩(wěn)定性和突變等［2］。其中，能量代謝的異常在近年來(lái)受到學(xué)界的廣泛關(guān)注［3］。

腫瘤的發(fā)生發(fā)展和細(xì)胞代謝異常密切相關(guān)［4］。德國(guó)生化和生理學(xué)家OTTO WARBURG早在20世紀(jì)20年代就提出了著名的“Warburg效應(yīng)”：即使有足夠的氧氣供應(yīng)，腫瘤細(xì)胞仍偏好于借助糖酵解途徑而不是能產(chǎn)生更多ATP的線粒體氧化磷酸化方式產(chǎn)生能量滿(mǎn)足快速生長(zhǎng)的需求［5］。

2-脫氧-D-葡萄糖（2-deoxy-D-glucose，2-DG）能競(jìng)爭(zhēng)性地抑制葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體1和己糖激酶介導(dǎo)的磷酸化，其產(chǎn)生的6-磷酸2DG（2DG-6-phosphate，2DG-6P）聚集在細(xì)胞內(nèi)無(wú)法被代謝利用，且半衰期長(zhǎng)達(dá)50 min，2DG-6P通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制磷酸葡萄糖異構(gòu)酶抑制6-磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)化為6-磷酸果糖，阻斷糖酵解于起始階段，從而發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)［6］。糖酵解途徑一直是腫瘤靶向的目標(biāo)，而2-DG作為一種糖酵解抑制劑應(yīng)用于腫瘤治療方面的研究。目前研究表明2-DG能增強(qiáng)阿霉素和紫杉醇的抗腫瘤活性，和組蛋白脫乙酰酶抑制劑具有協(xié)同效應(yīng)［7］；2-DG與阿霉素或l-丁硫氨酸磺酰亞胺協(xié)同作用，可減少乳腺癌細(xì)胞的黏附和遷移，但是對(duì)于靶向抑制線粒體還鮮有報(bào)道［8］。

本研究旨在通過(guò)2-DG作用于非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞后的一系列生物學(xué)行為改變來(lái)探討線粒體在腫瘤發(fā)展中所發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549由川北醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)影像研究保存并傳代。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胰蛋白酶、青霉素鏈霉素購(gòu)自HyClone公司；2-DG購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（JC-1）、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) A549細(xì)胞用含10%FBS、100 U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)80%～90%時(shí)用0.25%胰蛋白酶按1：3消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。

1.2.2 CCK-8試驗(yàn) A549細(xì)胞以5×103個(gè)/孔接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后更換新鮮培養(yǎng)基，并加入不同濃度的2-DG繼續(xù)培養(yǎng)48 h，棄去培養(yǎng)基，每孔加入10μl CCK-8試劑，37℃ 孵育2 h，450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值（A），計(jì)算細(xì)胞抑制率。

1.2.3 細(xì)胞凋亡試驗(yàn) A549細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后更換新鮮培養(yǎng)基，加入不同濃度2-DG培養(yǎng)48 h后，重懸細(xì)胞后離心棄上清，按說(shuō)明書(shū)分別加入Annexin V-FITC和碘化丙啶染色液，室溫避光孵育20 min，最后用流式細(xì)胞儀測(cè)定。

1.2.4 細(xì)胞周期試驗(yàn) A549細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后更換新鮮培養(yǎng)基，加入不同濃度2-DG培養(yǎng)48 h后，PBS重懸細(xì)胞，離心棄上清，70%乙醇固定2 h以上，再次重懸細(xì)胞，加入碘化丙啶染色液37℃避光溫浴30 min，最后用流式細(xì)胞儀測(cè)定。

1.2.5 線粒體膜電位測(cè)定（JC-1） A549細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后更換新鮮培養(yǎng)基，加入2-DG培養(yǎng)48 h后，按說(shuō)明書(shū)加入JC-1工作液，37℃孵育20 min，后續(xù)步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，最后用流式細(xì)胞儀分析。

1.2.6 線粒體基因組測(cè)定 不同濃度的2-DG處理A549細(xì)胞后，對(duì)對(duì)照組和處理組細(xì)胞進(jìn)行高通量測(cè)序，對(duì)比其線粒體基因組變化情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用GraphPad Prism5.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2 -DG抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549增殖 分別用濃度為25μmo/lL、50μmo/lL、100μmo/lL、1 mmo/lL、10 mmo/lL的2-DG處理A549細(xì)胞48 h后，計(jì)算細(xì)胞抑制率，結(jié)果如圖1所示。結(jié)果顯示，作用48 h后，各濃度2-DG均可明顯抑制A549細(xì)胞增殖，且隨著藥物濃度增大，A549細(xì)胞抑制率逐漸增大，其IC50約為10 mmo/lL。

2.2 2 -DG作用于A549細(xì)胞后凋亡測(cè)定 2-DG作用于A549細(xì)胞48 h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡結(jié)果如圖2所示，2-DG對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549的凋亡抑制不明顯。

2.3 2 -DG作用于A549細(xì)胞后周期測(cè)定 與對(duì)照組相比，不同濃度2-DG作用于A549細(xì)胞48 h后細(xì)胞周期均有所改變，且隨著2-DG濃度增大，細(xì)胞周期更多阻滯在S期（圖3、表1）。

圖1 不同濃度2-DG作用A549細(xì)胞48 h后細(xì)胞抑制率Fig.1 Cell inhibition rate of A549 treated with 2-DG at different concentrations for 48 h

圖2 不同濃度2-DG作用A549細(xì)胞48 h后細(xì)胞凋亡情況Fig.2 Apoptosis of A549 treated with 2-DG at different concentrations for 48 h

圖3 不同濃度2-DG作用A549細(xì)胞48 h后細(xì)胞周期情況Fig.3 Cell cycle of A549 treated with 2-DG at different concentrations for 48 h

2.4 線粒體膜電位測(cè)定結(jié)果 如4所示，2-DG作用于A549細(xì)胞后，細(xì)胞群發(fā)生偏移，A549細(xì)胞膜電位從高到低，說(shuō)明2-DG可誘導(dǎo)A549細(xì)胞的線粒體膜損傷。

表1 不同濃度2-DG作用A549細(xì)胞48 h后細(xì)胞周期情況Tab.1 Cell cycle of A549 treated with 2-DG at different concentrations for 48 h

圖4 不同濃度2-DG作用A549細(xì)胞48 h后線粒體膜電位（JC-1）變化情況Fig.4 Changes of mitochondrial membrane potential（JC-1）in A549atdifferentconcentrationsof 2-DGfor 48h

2.5 線粒體基因組測(cè)定結(jié)果 測(cè)序結(jié)果如圖5所示，經(jīng)2-DG處理后的細(xì)胞線粒體基因組結(jié)構(gòu)與對(duì)照組相比無(wú)明顯變異。本研究中的高通量數(shù)據(jù)Q30＞95%（表2），且Amplicon覆蓋均一性高（圖6），表明本次測(cè)序質(zhì)量的可信度高。

圖5 2-DG處理A549細(xì)胞后線粒體突變頻率Fig.5 Mitochondrial mutation frequency of A549 treated with 2-DG

表2 2-DG處理A549細(xì)胞后線粒體測(cè)序質(zhì)量值QTab.2 Mitochondrial sequencing quality value Q of A549 treated with 2-DG

圖6 高通量測(cè)序Amplicon覆蓋均一性Fig.6 Coverage uniformity of high-throughput sequenc?ing Amplicon

3 討論

線粒體被稱(chēng)為細(xì)胞的能量屋，在細(xì)胞生理學(xué)中發(fā)揮重要作用。真核細(xì)胞中，大部分細(xì)胞能量（ATP）是在線粒體中通過(guò)氧化磷酸化過(guò)程產(chǎn)生的，但腫瘤細(xì)胞卻以產(chǎn)能效率更低的糖酵解方式獲取能量，提示在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，線粒體氧化磷酸化途徑的作用很可能被嚴(yán)重削弱［9］。研究證實(shí)，糖酵解和線粒體呼吸作用的失衡增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞對(duì)低氧環(huán)境的適應(yīng)，有利于腫瘤的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程［10］。此外，糖酵解途徑導(dǎo)致的乳酸增加還可分解破壞腫瘤細(xì)胞周?chē)募?xì)胞基質(zhì)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移［11］。因此，在腫瘤的發(fā)展過(guò)程中，糖酵解是其主要的供能方式。

在氧化呼吸過(guò)程中，線粒體電子傳遞鏈通過(guò)一系列氧化還原反應(yīng)將所產(chǎn)生的能量以電化學(xué)勢(shì)能儲(chǔ)存于線粒體內(nèi)膜，造成內(nèi)膜兩側(cè)質(zhì)子及其他離子濃度的不對(duì)稱(chēng)分布從而產(chǎn)生電化學(xué)梯度，形成線粒體膜電位（mitochondrial membranepotential，MMP）［12］。正常的MMP是維持線粒體進(jìn)行氧化磷酸化的先決條件，MMP的穩(wěn)定有利于維持細(xì)胞的正常生理功能，也是評(píng)價(jià)線粒體功能完整性的關(guān)鍵參數(shù)。線粒體功能障礙、線粒體膜損傷、線粒體電子傳遞鏈異常等均可能導(dǎo)致MMP發(fā)生改變。線粒體膜電位的下降是細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)標(biāo)志性事件。JC-1有單體和多聚體兩種形式存在，當(dāng)膜電位較高時(shí)，形成發(fā)射紅色熒光的多聚體，當(dāng)?shù)蛲霭l(fā)生即膜電位較低時(shí)，形成發(fā)射綠色熒光的單體形式，故而可以通過(guò)細(xì)胞群的偏移來(lái)檢測(cè)線粒體膜電位的變化。

另外，研究發(fā)現(xiàn)多種腫瘤表現(xiàn)出線粒體DNA變異，其變異可導(dǎo)致氧化磷酸化功能受到抑制，活性氧物質(zhì)增加，促使腫瘤細(xì)胞在不利條件下依然能夠生長(zhǎng)。由于線粒體DNA參與編碼有氧呼吸的關(guān)鍵組成部分—呼吸鏈的多個(gè)復(fù)合體，因此，與細(xì)胞核DNA相比，線粒體DNA缺乏組蛋白，且對(duì)DNA的修復(fù)能力較弱。由藥物刺激引起的腫瘤細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)可能導(dǎo)致線粒體DNA在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生異常［13］。同時(shí)，腫瘤細(xì)胞中線粒體DNA發(fā)生突變的頻率較高，這些突變也可能引起線粒體功能異常［14］。

WARBURG曾假設(shè)，線粒體呼吸鏈的破壞是腫瘤細(xì)胞糖酵解增強(qiáng)的重要原因［18］。由于線粒體基因組編碼了呼吸鏈中13個(gè)重要的蛋白組分，且線粒體DNA在腫瘤細(xì)胞中存在高頻突變［19］。例如，在前列腺癌、結(jié)直腸癌等多種癌癥中均可觀察到線粒體DNA突變［20-21］。推測(cè)線粒體DNA的突變很可能影響其所編碼蛋白的功能并影響呼吸鏈。

2-DG作為糖酵解抑制劑，在多種腫瘤中均表現(xiàn)出抗腫瘤活性。研究表明其可通過(guò)干預(yù)N連接糖基化，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)非正常蛋白質(zhì)折疊反應(yīng)，繼而誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激［15］。ZAGORODNA等［16］在淋巴瘤細(xì)胞的研究中表明，2DG誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，繼而激活Bcl-2相互作用細(xì)胞死亡介導(dǎo)因子，通過(guò)對(duì)Bcl-2家族促凋亡蛋白的調(diào)控誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。程秀等［17］的研究顯示，2-DG對(duì)乳腺癌細(xì)胞的增殖具有抑制作用，但其本身并不誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而是通過(guò)明顯增加臨床乳腺癌常用治療藥物的療效來(lái)誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)度的ER應(yīng)激反應(yīng)，增強(qiáng)Caspase-3活性而發(fā)揮作用。本研究著眼于經(jīng)2-DG作用之后的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的行為學(xué)改變是否與線粒體DNA突變有關(guān)，并期望找到線粒體DNA的突變模式及其作用機(jī)制。

由CCK-8結(jié)果可知，經(jīng)不同濃度的2-DG刺激后，A549細(xì)胞的增殖活性受到抑制，且隨著藥物濃度的增大，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率逐漸增高，說(shuō)明2-DG可有效抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖活性。然而，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，在不同濃度2-DG的刺激下，A549細(xì)胞的凋亡并未明顯增強(qiáng)，而隨著2-DG濃度增大，A549細(xì)胞周期阻滯在S期，說(shuō)明高濃度的2-DG刺激可有效抑制細(xì)胞周期進(jìn)程，從而阻斷腫瘤細(xì)胞增殖。

有研究顯示，線粒體功能障礙與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，化療誘導(dǎo)的低水平線粒體DNA與腫瘤細(xì)胞獲得性耐藥和抗凋亡特性有關(guān)［22-24］。LIjIE‐MA［22］等研究了非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）多藥耐藥的原因，發(fā)現(xiàn)線粒體DNA突變與NSCLC腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)，但與其多藥耐藥能力無(wú)關(guān)，另外，乳酸和ROS生成的差異提示線粒體功能障礙參與了NSCLC的多藥耐藥。因此，線粒體功能障礙可能是腫瘤細(xì)胞發(fā)展迅速的重要因素之一，線粒體功能障礙導(dǎo)致線粒體呼吸鏈的破壞或減弱，腫瘤細(xì)胞糖酵解得以增強(qiáng)。

本研究也測(cè)定了經(jīng)2-DG處理后A549細(xì)胞的線粒體基因組序列，與對(duì)照組相比，線粒體基因組序列并未有所改變。然而JC-1結(jié)果顯示，隨著2-DG濃度的增加，細(xì)胞群發(fā)生偏移，線粒體膜電位（MMP）由高到低發(fā)生改變，說(shuō)明2-DG誘導(dǎo)A549細(xì)胞線粒體膜發(fā)生損傷。結(jié)果表明，在2-DG的刺激下，A549細(xì)胞線粒體膜受到損傷，但并未導(dǎo)致基因組結(jié)構(gòu)的破壞。

4 結(jié)論

本研究顯示，2-DG能有效抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549的增殖活性，線粒體基因組檢測(cè)并未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞線粒體DNA突變，因此，2-DG對(duì)非小細(xì)胞肺癌的抑制作用可能并不是通過(guò)誘導(dǎo)DNA突變導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)異常來(lái)實(shí)現(xiàn)的。推測(cè)2-DG可能主要作用于A549細(xì)胞的線粒體，通過(guò)誘導(dǎo)線粒體膜損傷，使線粒體功能發(fā)生障礙，進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，從而抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。然而，該的推測(cè)需要佐證，其具體作用途徑尚需進(jìn)一步研究。