陸瀅雪 羅新華 程明亮 彭 虹 （貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院感染科，貴陽550004）

近年來，環(huán)狀RNA（circRNA）的功能備受關(guān)注，如調(diào)節(jié)親本基因表達、發(fā)揮miRNA海綿體等作用［1-3］。研究表明，circRNA參與腫瘤發(fā)生發(fā)展［4-5］。原發(fā)性肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球惡性腫瘤相關(guān)死亡的常見原因，預(yù)后差、復(fù)發(fā)率高，其發(fā)病機制受到高度關(guān)注［6-7］。最新研究表明，大量circRNA在HCC組織和正常肝組織中存在差異表達，與HCC發(fā)生發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)，但具體作用機制尚未明確［8-10］。本文就circRNA在HCC中的異常表達進行分析，探討其在HCC中的作用和潛在機制。高通量測序發(fā)現(xiàn)，circTMBIM1在HCC組織中表達上調(diào)，因此，課題組對Hsa-circTMBIM1在HCC細胞系中的表達進行RT-PCR定量分析，并設(shè)計合成靶向Hsa-circTMBIM1的小干擾RNA（siRNA），將其轉(zhuǎn)染至Huh7細胞，研究Hsa-circTMBIM1與Huh7細胞增殖和遷移的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系 人HCC細胞株HepG2、Hep3B、Huh7、Sk-hep-1、HCCLM3、SMMC-7721購自上海生命科學(xué)院所；慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株由南京科佰生物科技有限公司提供；引物由北京擎科生物有限公司合成；靶向circTMBIM1的siRNA序列委托廣州銳博生物公司設(shè)計合成；

1.1.2 主要試劑與儀器 DMEM細胞培養(yǎng)基（美國Hyclone公司）；胎牛血清（美國Gibco公司）；青-鏈霉素（武漢苑陵生物科技有限公司）；miR-24-3p模擬物（上海吉瑪生物有限公司）；miR-24-3p抑制劑和陰性對照（上海生工生物公司）；CCK-8試劑盒（日本Dojindo公司）；結(jié)晶紫染色液（碧云天公司）；碘化丙啶、Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑盒、熒光素酶報告基因質(zhì)粒（美國Sigma公司）；Transwell小室（美國Coster公司）；Trizol試劑（美國Invitrogen公司）；酶標儀（美國Thermo公司）；Muse智能觸控細胞分析儀（美國默克密理博公司）；熒光定量PCR儀（美國ABI公司）；雙熒光素酶報告基因測定系統(tǒng)（Promega，Madison，WI，USA）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 HCC細胞系HepG2、Hep3B、Huh7、Sk-hep-1、HCCLM3和SMMC-7721均采用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，添加10%胎牛血清（FBS）+100 U/ml青霉素+100μg/ml鏈霉素，37℃、5%CO2、95%相對濕度下培養(yǎng)。根據(jù)Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書轉(zhuǎn)染circTMBIM1-siRNA，培養(yǎng)48 h后進行細胞功能實驗。

1.2.2 RT-PCR 采用Trizol試劑從新鮮冷凍組織和培養(yǎng)細胞中分離總RNA，反應(yīng)體系10μl，反應(yīng)條件：25℃5 min，42℃60 min，70℃5 min，12℃ 循環(huán)，合成cDNA。擴增體系20μl，反應(yīng)條件：95℃5 min，95℃5 s，60℃60 s，共40個循環(huán)。circTMBM1引物序列為：F：5′-GGCTATGATGGGGAGGAGAGAGC-3′，R：5′-GGCGCTGGGGTTGGACATGG-3′；miR-24-3p引物序列為：5′-TGCGGTGGCTCAGTTCAGCAG‐GAAC-3′；GAPDH引物序列為：F：5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，R：5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。2-ΔΔCt法計算基因相對表達。比較circTMBIM1在HCC細胞中的表達，所有試驗重復(fù)3次，取平均值。

1.2.3 細胞功能實驗

1.2.3.1 細胞增殖及活性檢測 100μ/l孔向96孔反應(yīng)板中注入細胞懸浮液，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，10μ/l孔添加CCK-8溶液進行孵育，酶標儀測定樣品450 nm處吸光度。取對數(shù)生長期細胞，4×103～1×105個/孔接種于96孔板，培養(yǎng)至正常生長階段，采用細胞培養(yǎng)基按1 000：1比例稀釋EdU溶液（試劑A），制備50μmo/lL EdU培養(yǎng)基，固定細胞后用Apollo試劑染色，拍照并分析圖像。向6孔板中注入100個細胞，接種于培養(yǎng)液中并置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時終止培養(yǎng)，固定細胞，加入適量結(jié)晶紫染色，流動水沖洗，空氣干燥后拍照。所有試驗重復(fù)3次，取平均值。

1.2.3.2 細胞創(chuàng)傷愈合實驗 將24孔細胞培養(yǎng)板的細胞培養(yǎng)24 h至70%～80%融合度，200μl移液槍垂直劃痕，沖洗脫落細胞，添加新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞48 h，PBS清洗2次，固定細胞并測距。所有試驗重復(fù)3次，取平均值。

1.2.3.3 Transwell實驗 調(diào)整細胞濃度至2×105個/ml，吸取100μl無血清細胞培養(yǎng)基加入Transwell上室，37℃培養(yǎng)48 h，按照操作規(guī)范進行實驗，顯微鏡明亮視野下觀察陽性細胞，所有試驗重復(fù)3次，取平均值。

1.2.3.4 流式細胞周期檢測 轉(zhuǎn)染24 h后棄培養(yǎng)基，PBS沖洗2次，加入1 ml不含EDTA的胰酶，待細胞成片脫落后，加入2 ml培養(yǎng)基終止消化，轉(zhuǎn)移至無菌離心管，1 000/rmin離心5 min，棄上清，PBS洗滌并離心3次，預(yù)冷70%乙醇固定，4℃孵育過夜，PBS離心洗滌細胞3次，去固定液，加入緩沖液，加入0.5μg/ml PI染色液染色30 min，流式細胞術(shù)檢測細胞周期，F(xiàn)lowJo7.6軟件分析各期細胞含量。

1.2.4 慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株構(gòu)建和細胞轉(zhuǎn)染 將過表達circTMBIM1的細胞（circTMBIM1 OE）、circTM‐BIM1-敲除細胞（sh-circTMBIM1）和陰性對照細胞（NC）進行慢病毒包裝，構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株。Huh7細胞接種于6孔板，第2天采用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染48 h后收集細胞，qRT-PCR驗證轉(zhuǎn)染效率。

1.2.5 雙熒光素酶報告基因試驗 TargetScan和miRanda預(yù)測circRNA-miRNA的相互作用，生物信息學(xué)預(yù)測circTMBIM1與底物miR-24-3p相結(jié)合，構(gòu)建psiCHECK-circTMBIM1-WT/-Mut質(zhì)粒，采用Li‐pofectamine 3000將psiCHECK-circTMBIM1-WT或psiCHECK-circTMBIM1-Mut和miR-519a-5p模擬物或miR-NC共轉(zhuǎn)染至293T細胞，雙熒光素酶報告基因測定系統(tǒng)測定轉(zhuǎn)染48 h后的熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，GraphPad Prism7軟件繪圖，兩組間比較采用t檢驗，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 circTMBIM1在HCC細胞系中的表達及敲減效率 circTMBIM1在Huh7細胞系中表達最高，其次分別為HepG2，Hep3B，Sk-hep-1，HCCLM3，SMMC-7721（圖1A），選用Huh7細胞系進行后續(xù)實驗。qRTPCR實驗檢測顯示，與對照組相比，siRNA干擾后，circTMBIM1表達顯著降低（P＜0.001，圖1B）。

2.2 下調(diào)circTMBIM1對Huh7細胞增殖的影響 CCK-8實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，下調(diào)circTMBIM1表達明顯降低Huh7細胞增殖活力（P＜0.01，圖2A）。集落形成實驗研究結(jié)果顯示，將circTMBIM1 siRNA轉(zhuǎn)染至Huh7細胞2周后，與對照組相比，Huh7細胞集落數(shù)明顯減少（圖2B）。進一步采用EdU實驗檢測沉默circTMBIM1后Huh7增殖活力的變化，結(jié)果顯示，與對照組比，沉默circTM‐BIM1可降低Huh7細胞增殖活力（圖2C）。

圖1 circTMBIM 1在HCC細胞系中的表達及敲減效率Fig.1 Expression and knock down efficiency of circTM?BIM 1 in HCC cell lines

圖2 下調(diào)circTMBIM 1對Huh7細胞增殖的影響Fig.2 Effect of down-regulation of circTMBIM 1 on pro?liferation of Huh7 cell

2.3 下調(diào)circTMBIM1表達對Huh7細胞遷移的影響 細胞創(chuàng)傷愈合實驗結(jié)果顯示，劃痕48 h后，與對照組相比，下調(diào)circTMBIM1表達顯著抑制細胞創(chuàng)傷愈合（圖3A）。Transwell細胞遷移實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，下調(diào)circTMBIM1表達后Huh7細胞遷移能力減弱（圖3B）。

2.4 下調(diào)circTMBIM1表達對Huh7細胞細胞周期的影響 流式細胞術(shù)檢測下調(diào)circTMBIM1表達對Huh7細胞細胞周期的影響，結(jié)果顯示，與對照組相比，敲低circTMBIM1表達，Huh7細胞S期占比顯著降低（P＜0.05，圖4）。

2.5 雙熒光素酶活性檢測實驗證實TMBIM1與miR-24-3p結(jié)合 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）查詢分析，預(yù)測TMBIM1與miR-24-3p存在結(jié)合位點（圖5A）。共轉(zhuǎn)染circTM‐BIM1-WT和miR-24-3p模擬物后熒光素酶相對活性降低，miR-24-3p表達顯著降低。轉(zhuǎn)染circTMBIM1 OE后，miR-24-3p表達下降，轉(zhuǎn)染sh-circTMBIM1后miRNA表達升高（P＜0.01，P＜0.001，圖5B）。提示circTMBIM1可能直接與miR-24-3p結(jié)合而抑制miR-24-3P活性。

圖3 下調(diào)circTMBIM 1表達對Huh7細胞遷移的影響Fig.3 Effect of down-regulation of circTMBIM 1 on mi?gration of Huh7 cell

圖4 下調(diào)circTMBIM 1表達對Huh7細胞細胞周期的影響Fig.4 Effect of down-regulation of circTMBIM 1 on cell cycle of Huh7 cell

圖5 雙熒光素酶活性檢測實驗證實TMBIM 1與miR-24-3p結(jié)合Fig.5 Double luciferase activity test confirmed combina?tion of TMBIM 1 and miR-24-3p

圖6 過表達circTMBIM 1可逆轉(zhuǎn)miR-24-3p mimics對Huh7細胞增殖、遷移、細胞周期的影響Fig.6 Overexpression of circTMBIM 1 can reverse effects of miR-24-3p mimics on proliferation，migration and cell cycle of Huh7 cells

2.6 過表達circ TMBIM1可逆轉(zhuǎn)miR-24-3p mimics對Huh7細胞增殖、遷移、細胞周期的影響 采用CCK-8法測定共轉(zhuǎn)染miR-24-3p mimics和circTM‐BIM1 OE后Huh7細胞增殖情況，結(jié)果顯示，miR-24-3p mimics可抑制Huh7細胞增殖，而過表達circTM‐BIM1可逆轉(zhuǎn)miR-24-3p mimics對Huh7細胞增殖的抑制作用（圖6A），集落形成實驗結(jié)論相同（圖6B）。細胞創(chuàng)傷愈合實驗、Transwell實驗共轉(zhuǎn)染miR-24-3p mimics和circTMBIM1 OE后Huh7細胞遷移結(jié)果顯示，miR-24-3p mimics可抑制Huh7細胞遷移，而過表達circTMBIM1可逆轉(zhuǎn)miR-24-3p mimics對Huh7細胞遷移的抑制作用（圖6C、D）。流式細胞術(shù)實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，下調(diào)circTMBIM1表達細胞S期占比降低，共轉(zhuǎn)染circTMBIM1 OE結(jié)論相反（圖6E）。

3 討論

HCC是一種死亡率較高的惡性腫瘤，預(yù)后差、惡性程度高、復(fù)發(fā)率高，對多種化療藥物耐藥，若發(fā)生惡性轉(zhuǎn)移控制較難［11-12］。進一步篩選潛在診斷、預(yù)后生物標志物和治療靶點，深入研究可能的分子機制對HCC治療至關(guān)重要。近年非編碼RNA（ncRNA）已成為HCC研究重點。多項研究表明，腫瘤特異性ncRNA可用于生存預(yù)測和治療干預(yù)［13-15］。HCC相關(guān)ncRNA中，circRNA在HCC發(fā)生發(fā)展中具有重要作用［16］。circRNA/miRNA軸在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達［17］。研究表明，circRNA可與多種miRNA結(jié)合起miRNA“海綿體”作用，影響其他基因轉(zhuǎn)錄和翻譯，調(diào)控腫瘤惡性進展，如circ‐MTO1和cSMARCA5已被認為是致癌miRNA海綿，在HCC進展過程中發(fā)揮重要作用，可能成為HCC治療的潛在靶點［18-20］。

本研究發(fā)現(xiàn)circTMBIM1在HCC細胞中表達顯著上調(diào)，敲低circTMBIM1可使HCC細胞增殖及遷移能力減弱。生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫分析顯示circTM‐BIM1與miR-24-3p存在結(jié)合位點，熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞C結(jié)合位點的結(jié)合能力。circTMBIM1/miR-24-3p信號軸的潛在下游基因主要參與細胞代謝過程，與HCC細胞代謝失調(diào)相關(guān)。circTMBIM1可能通過影響Huh7細胞代謝調(diào)控miR-24-3p的下游基因，從而促進Huh7細胞增殖、遷移。因此circTM‐BIM1可能是HCC的潛在治療靶點。本研究仍存在一定局限性，樣本量較小，需要招募更多患者進一步闡明circTMBIM1的臨床意義，且未涉及miR-24-3p的下游基因。circTMBIM1在體內(nèi)的致癌作用及合成和降解機制有待進一步研究。

綜上所述，本研究首次探討了circTMBIM1在人HCC細胞中的生物學(xué)功能，證明circTMBIM1在HCC發(fā)生發(fā)展中起重要作用。此外，circTMBIM1的致癌作用可能與miR-24-3p的抑制有關(guān)，circTMBIM1可能成為HCC治療的有效靶點。