董琳 史銳

P21是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制蛋白(CDKI)，不僅通過調(diào)控細(xì)胞周期維持細(xì)胞的生長和增殖，還參與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞衰老等過程[1-2]。它對細(xì)胞凋亡的調(diào)控起著雙刃劍作用，不僅可通過細(xì)胞凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1(ASK1)和具有BH1-4保守結(jié)構(gòu)區(qū)域調(diào)節(jié)因子(Bcl-2等)抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖，又可通過上調(diào)具有BH1-3結(jié)構(gòu)區(qū)域調(diào)節(jié)因子(促凋亡蛋白Bax等)或激活TNF家族死亡受體(TRAIL)促進(jìn)細(xì)胞凋亡[3-4]。因此它具有多樣的生物學(xué)功能。近期研究發(fā)現(xiàn)，G1期檢測點(diǎn)的CDK抑制因子p21促進(jìn)許多惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。并且當(dāng)p21缺失時(shí)可以促進(jìn)腫瘤耐藥[5]。為了深入研究p21蛋白功能的分子機(jī)制及其與腫瘤的關(guān)系，急需建立穩(wěn)定沉默p21的細(xì)胞模型。本研究擬使用pLV-CMV-MCS-EF1-mCherry-T2A-Puro慢病毒載體構(gòu)建pLV-CMV-MCS-EF1-mCherry-T2A-Puro-shp21重組質(zhì)粒，進(jìn)行穩(wěn)定沉默p21的人肺腺癌H460細(xì)胞模型的構(gòu)建，并檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)指標(biāo)Bax和Bcl-2及細(xì)胞增殖情況，為進(jìn)一步探索p21的生物學(xué)作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

資料與方法

一、主要試劑和細(xì)胞

Prestained Protein Marker購自中科瑞泰(北京)生物科技有限公司 ，質(zhì)粒提取試劑盒購自德國QIAGEN 公司，HiGene 細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司，胎牛血清及DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液均購自中國Clark公司，CCK8試劑盒購自上海佛元生物科技有限公司，pLV-CMV-MCS-EF1-mCherry-T2A-Puro慢病毒載體、pLV-CMV-MCS-EF1-mCherry-T2A-Puro-shp21重組質(zhì)粒、慢病毒包裝骨架PCMV-dr8.9dvpr416、PCMV-VSV-G417均購自上海生工公司，p21、Bax、Bcl-2、β-actin抗體均購自美國CST公司，人胚腎293T細(xì)胞、人肺腺癌H460細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室自存。

二、細(xì)胞培育

將293T細(xì)胞和H460細(xì)胞用8%的胎牛血清，在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)(37℃，5% CO2)，及時(shí)傳代，調(diào)整狀態(tài)備用。

三、質(zhì)粒抽提

利用質(zhì)粒提取試劑盒將購買的pLV-CMV-MCS-EF1-mCherry-T2A-Puro慢病毒載體質(zhì)粒和pLV-CMV-MCS-EF1-mCherry-T2A-Puro-shp21重組質(zhì)粒進(jìn)行大量抽提備用。

四、慢病毒病毒液的制備

轉(zhuǎn)染前18～24小時(shí)，將約2.5×106個(gè)293T 細(xì)胞置于10 cm 培養(yǎng)皿中并在 培養(yǎng)箱中 孵育過夜。細(xì)胞應(yīng)在24 小時(shí)內(nèi)達(dá)到 65%～70% 的密度。將6.6 μg PCMV-dr 8.9 dvpr 416、3.3 μg PCMV-VSV-G 417、3.1 μg pLV-CMV-MCS-EF1-mCherry-T2A-Puro(對照組)或pLV-CMV-MCS-EF1-mCherry-T2A-Puro-shp21(實(shí)驗(yàn)組)重組質(zhì)粒稀釋于500 μL無血清DMEM，分別加入30 μL HiGene 細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑，立即吹懸混勻，室溫放置30 min，將上述質(zhì)?；旌弦杭尤霚?zhǔn)備好的293T細(xì)胞，4～6 h后更換細(xì)胞培養(yǎng)液，于24、48、72 h分別收集培養(yǎng)基，1 500 r/min離心15 min去除下層沉淀，上清即為病毒液。收集上清4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

五、建立穩(wěn)定沉默p21的人肺腺癌H460細(xì)胞模型

接種H460細(xì)胞至6孔板培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)使其密度達(dá)到40%左右，取1.4中制備的病毒200 μL感染細(xì)胞，24 h后重復(fù)感染一次，48 h后正常培養(yǎng)。

六、穩(wěn)定沉默p21的人肺腺癌H460細(xì)胞模型的鑒定

收取一部分對照組和實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞，裂解細(xì)胞，提取蛋白。利用Western blotting檢測p21蛋白表達(dá)，以鑒定穩(wěn)定沉默p21的人肺腺癌H460細(xì)胞模型構(gòu)建是否成功。

七、檢測穩(wěn)定沉默p21的人肺腺癌H460細(xì)胞模型細(xì)胞凋亡相關(guān)指標(biāo)Bax和Bcl-2的變化

待穩(wěn)定沉默p21的人肺腺癌H460細(xì)胞模型構(gòu)建成功后，利用Western blotting檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)指標(biāo)Bax和Bcl-2的變化。

八、檢測穩(wěn)定沉默p21的人肺腺癌H460細(xì)胞模型細(xì)胞增殖的變化

采用CCK-8法細(xì)胞增殖：分別將對照組和實(shí)驗(yàn)組以3×103/孔的密度將細(xì)胞接種至96孔板，每組3個(gè)復(fù)孔，待完全貼壁后，培養(yǎng)24、48 h后，加入CCK-8試劑(6.0 g/L)8 μL/孔，置入細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)0.5 h，酶標(biāo)儀檢測450 nm處各組吸光度，取平均值，用來表示細(xì)胞增殖能力的變化。

九、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、穩(wěn)定沉默p21的人肺腺癌H460細(xì)胞模型的鑒定

將pLV-CMV-MCS-EF1-mCherry-T2A-Puro和pLV-CMV-MCS-EF1-mCherry-T2A-Puro-shp21制備的病毒液感染H460細(xì)胞。Western blotting檢測結(jié)果顯示，感染pLV-CMV-MCS-EF1-mCherry-T2A-Puro-shp21病毒的細(xì)胞在 21×103位置條帶亮度明顯減弱，p21蛋白的相對表達(dá)量為1.008±0.003； 而感染pLV-CMV-MCS-EF1-mCherry-T2A-Puro病毒的細(xì)胞在 21×103位置條帶亮度無明顯改變，p21蛋白 相對表達(dá)量分別為3.708±0.043(見圖1)。表明穩(wěn)定沉默p21的人肺腺癌H460細(xì)胞模型構(gòu)建成功。

圖1 穩(wěn)定沉默p21的人肺腺癌H460細(xì)胞模型的鑒定

二、穩(wěn)定沉默p21的人肺腺癌H460細(xì)胞模型細(xì)胞凋亡相關(guān)指標(biāo)的檢測

將pLV-CMV-MCS-EF1-mCherry-T2A-Puro和pLV-CMV-MCS-EF1-mCherry-T2A-Puro-shp21制備的病毒液感染H460細(xì)胞。Western blotting檢測結(jié)果顯示，感染pLV-CMV-MCS-EF1-mCherry-T2A-Puro-shp21病毒的細(xì)胞在 21×103位置條帶亮度明顯增強(qiáng)，Bax蛋白的相對表達(dá)量為2.326±0.035；而感染pLV-CMV-MCS-EF1-mCherry-T2A-Puro病毒的細(xì)胞在 21×103位置條帶亮度無明顯改變，Bax蛋白 相對表達(dá)量分別為1.508±0.032。同時(shí)Western blotting檢測結(jié)果顯示，感染pLV-CMV-MCS-EF1-mCherry-T2A-Puro-shp21病毒的細(xì)胞在 28×103位置條帶亮度明顯減弱，Bcl-2蛋白的相對表達(dá)量為1.426±0.017；而感染pLV-CMV-MCS-EF1-mCherry-T2A-Puro病毒的細(xì)胞在 28×103位置條帶亮度無明顯改變，Bcl-2蛋白 相對表達(dá)量分別為2.420±0.052(見圖2)。表明穩(wěn)定沉默p21的人肺腺癌H460細(xì)胞模型較對照組促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

圖2 穩(wěn)定沉默p21的人肺腺癌H460細(xì)胞模型

三、穩(wěn)定沉默p21的人肺腺癌H460細(xì)胞模型細(xì)胞增殖的檢測

記錄3個(gè)時(shí)間點(diǎn)(0、24、48 h)的吸光值，計(jì)算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率(%)=實(shí)驗(yàn)組(pLV-CMV-MCS-EF1-mCherry-T2A-Puro-shp21)存活細(xì)胞數(shù)量/對照組(pLV-CMV-MCS-EF1-mCherry-T2A-Puro)存活細(xì)胞數(shù)量×100。實(shí)驗(yàn)組(pLV-CMV-MCS-EF1-mCherry-T2A-Puro-shp21)與對照組(pLV-CMV-MCS-EF1-mCherry-T2A-Puro)相比，細(xì)胞存活率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，見表1。CCK-8結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組(pLV-CMV-MCS-EF1-mCherry-T2A-Puro-shp21)細(xì)胞增殖能力較對照組(pLV-CMV-MCS-EF1-mCherry-T2A-Puro)明顯減弱。

表1 穩(wěn)定沉默p21的人肺腺癌H460細(xì)胞模型細(xì)胞增殖的檢測

討 論

細(xì)胞死亡曾被認(rèn)為是兩種不同過程中的一種，即凋亡(也稱為程序性細(xì)胞死亡)或壞死(不受控制的細(xì)胞死亡)[6-7].。細(xì)胞程序性死亡即凋亡的過程通常具有明顯的形態(tài)學(xué)特征和能量依賴的生化機(jī)制，被認(rèn)為是各種過程的重要組成部分，包括正常的細(xì)胞更新、免疫系統(tǒng)的正常發(fā)育和功能、激素依賴性萎縮、胚胎發(fā)育和化學(xué)誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡[8-12]。近年來，細(xì)胞凋亡的復(fù)雜性一直是眾多研究的焦點(diǎn)，不僅有助于更好地理解細(xì)胞凋亡的基本過程，而且有助于治療癌癥等疾病[13-14]。眾所周知，p21與細(xì)胞凋亡有著重要的聯(lián)系，細(xì)胞凋亡的加快，意味著細(xì)胞增殖的減慢，這影響著腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展[15-18]。研究表明，p21可明顯促進(jìn)胃癌細(xì)胞的生長與轉(zhuǎn)移[19]以及過表達(dá)P21基因可以通過影響細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，抑制甲狀腺癌細(xì)胞的增殖,并誘導(dǎo)其凋亡[20]。因此我們利用p21調(diào)控細(xì)胞凋亡和增殖來建立其與腫瘤細(xì)胞發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。本研究致力于探索p21與人肺腺癌細(xì)胞凋亡和增殖的關(guān)系，通過成功建立了穩(wěn)定沉默p21的人肺腺癌H460細(xì)胞模型，并以此來檢測該細(xì)胞模型凋亡相關(guān)指標(biāo)Bax和Bcl-2的變化及細(xì)胞增殖的情況。最終發(fā)現(xiàn)，在人肺腺癌H460細(xì)胞中穩(wěn)定沉默p21后，凋亡相關(guān)指標(biāo)Bax上調(diào)，Bcl-2下調(diào)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，CCK8結(jié)果顯示該細(xì)胞模型抑制細(xì)胞增殖。這為進(jìn)一步研究p21與人肺腺癌細(xì)胞凋亡和增殖的聯(lián)系奠定基礎(chǔ)。通過以上研究，我們初步得出p21與肺腺癌細(xì)胞凋亡和增殖的關(guān)系，為臨床治療肺腺癌疾病提供了新的思路。