鄭穎穎

肺癌是最常見的死亡率最高的癌癥之一。根據(jù)國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(International Agency for Research on cancer)編制的《GLOBOCAN 2018年癌癥發(fā)病率和死亡率估算》報(bào)告，2018年1810萬新的癌癥病例(1700萬不包括非黑色素瘤皮膚癌)和960萬癌癥死亡(950萬不包括非黑色素瘤皮膚癌)中，肺癌是最常見的診斷癌癥，占總病例的11.6%，占總癌癥死亡的18.4%，是癌癥死亡的主要原因[1]。肺癌根據(jù)組織類型分為小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，其中NSCLC約占85%以上[2]，由于目前針對NSCLC尚未建立有效的治療措施，死亡率有逐年增高的趨勢[3]。因此，尋找NSCLC發(fā)生、發(fā)展或與其病理特征相關(guān)的特異性靶位點(diǎn)，提出針對性的治療方式，對提高NSCLC患者生存率具有重要意義。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)是一類無蛋白質(zhì)編碼能力，長度大于200nt的與腫瘤發(fā)生有密切關(guān)系的RNA分子[4-8]。如LncRNA AFAP1-AS1在NSCLC組織中的表達(dá)量高于癌旁組織，推斷LncRNA AFAP1-AS1可能與NSCLC的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[9]；研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA BCYRN1在胃癌中的高表達(dá)，有促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移，增強(qiáng)細(xì)胞耐缺血清環(huán)境的能力[10]；結(jié)直腸癌中LncRNA SHNG5能介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[11]等。這些研究結(jié)果表明，不同腫瘤相關(guān)LncRNA有望成為腫瘤治療新靶標(biāo)。

睪丸相關(guān)高度保守的致癌長鏈非編碼RNA(testis-associated highly-conserved oncogenic long non-coding RNA，THOR)是Hosono等人2015年新定義的一類lncRNA，其正常組織表達(dá)幾乎僅限于睪丸，但在多種癌細(xì)胞中廣泛表達(dá)[12]，包括鼻咽癌、腎細(xì)胞癌、骨肉瘤、黑色素瘤和舌鱗狀細(xì)胞癌等。目前發(fā)現(xiàn)其可與胰島素樣生長因子2mRNA結(jié)合蛋白1(insulin-link growth factor 2 mRNA-binding protein1，IGF2BP1)具有保守的相互作用，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。此外，Hosono等人還證實(shí)了，THOR在腺癌(lung adenocarcinoma，LUAD)和鱗癌(lung squamous carcinoma，LUSC)細(xì)胞中有表達(dá)的現(xiàn)象。目前針對臨床樣本癌組織及癌旁正常組織中THOR的表達(dá)研究相對較少，關(guān)于THOR與患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系亦鮮見報(bào)道。因此，本文采用我國臨床非小細(xì)胞癌樣本，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法檢測，比較非小細(xì)胞癌患者癌組織與癌旁正常組織中THOR的表達(dá)差異，根據(jù)患者臨床病理特征等研究THOR對預(yù)后的影響；并通過沉默A549細(xì)胞THOR的表達(dá)，檢測其對細(xì)胞增殖與凋亡的影響；從而探索THOR成為非小細(xì)胞肺癌診療的標(biāo)記分子。

資料與方法

一、研究對象

1 一般資料

選擇2014年6月至2016年12月在我院接收治療的79例NSCLC患者為研究對象。其中男46例，女33例；年齡在35～73(58.43±10.23)之間；有吸煙史者42例，不吸煙者37例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期32例，Ⅲ～Ⅳ期47例；組織學(xué)類型：腺癌35例，鱗狀細(xì)胞癌41例，大細(xì)胞癌3例；分化程度：高、中、低分化數(shù)量分別為39、22、18例。本次研究癌旁正常組織取自腫瘤邊緣5cm以上的位置。并將術(shù)后收集的樣本離體后立即轉(zhuǎn)入凍存管中液氮中速凍，隨后放入-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)組織病理學(xué)診斷后確認(rèn)為NSCLC的患者；(2)患者在手術(shù)前未經(jīng)放療、化療或其他抗癌治療，未服用過靶向藥物；(3)臨床資料完整；(4)隨訪時(shí)間≥6個(gè)月。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者不僅僅具有單一病癥(NSCLC)，如合并其他惡性腫瘤或嚴(yán)重感染性疾??；(2)術(shù)前服用過靶向藥物制劑；(3)術(shù)前接受過放療、化療或其他抗癌治療。本次研究的全部NSCLC病例患者及其家屬均已了解本研究內(nèi)容，并簽署了知情同意書。本研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

3 隨訪

所有患者采用電話或定期來院復(fù)診的方式得到隨訪，隨訪截止日期為2018年12月31日或患者死亡。

二、材料

NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549由我院中心實(shí)驗(yàn)室保存；SiRNA-THOR及對照siRNA-NC均由廣州銳博生物科技公司提供；TRIZOL、脂質(zhì)體 2000購自美國 Invitrogen 公司；總RNA提取試劑盒，Titanium? One-Step RT-PCR Kit 購自湖南艾科瑞生物技術(shù)有限公司；鼠抗人 cyclin D1、兔抗人Bcl-2、鼠抗人 Bax 、鼠抗人 cleaved-caspase3、鼠抗人β-actin 抗體、HRP標(biāo)記二抗購自美國 Santa Cruz Biotech 公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒購自南京凱基公司；ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒購自美國 Pierce 公司；MTT細(xì)胞增殖檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所。

三、方法

1 核酸提取

采用總RNA提取試劑盒進(jìn)行NSCLC癌組織及癌旁正常組織中的總RNA的提取，具體操作步驟參見說明書。RNA存入-80 ℃冰箱備用。

2 qRT-PCR檢測

以上述提取的樣本總RNA為模板，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)方法，對NSCLC癌組織及癌旁正常組織中THOR的表達(dá)量進(jìn)行檢測。本研究采用的是Titanium?One-Step RT-PCR Kit一步法實(shí)時(shí)熒光檢測試劑盒，THOR的表達(dá)量用ΔΔCt法計(jì)算，以管家基因GAPDH的mRNA水平作為內(nèi)參。具體引物序列如下：GAPDH：(Forward)5′-CATGAGCAGTAA ACAGCCATGAT-3′；(Reverse)5′-AGTACAC CCATCG AATTCCAGT-3′[13]；THOR：(Forward)5′-CAAGGTGCTTCTCTCT GGATTT-3′；(Reverse)：5′-GCCAAAGTCATTTGTTGGGTAT-3′[12]。

3 細(xì)胞增殖能力檢測

將5000個(gè)細(xì)胞接種到96孔板中，按照實(shí)驗(yàn)需求培養(yǎng)不同天數(shù)后收集細(xì)胞，按照MTT細(xì)胞毒性/增殖活性檢測試劑盒說明書操作，用酶標(biāo)儀在490nm處讀取吸光度(A值)，并繪制生長曲線。

4 蛋白質(zhì)印跡法檢測蛋白表達(dá)

收集細(xì)胞，加入400ul NP-40裂解液置于冰上，用移液器將其吹散至單細(xì)胞懸液，然后繼續(xù)置于冰上靜置5 min。開啟低溫冷凍離心機(jī)，12 000 rpm，4 ℃，離心10 min，分離上清為所得的蛋白質(zhì)抽提物。BCA試劑盒檢測蛋白濃度后，取20 μg蛋白制備成20 μl上樣緩沖液，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、抗體孵育后，ECL顯影檢測蛋白表達(dá)。依次分別使用兔抗人cyclin D1、Bcl2、BAX、cleaved-caspase-3和 β-actin 多克隆抗體作為一抗(抗體稀釋比均為1 ∶10 000)，HRP標(biāo)記羊抗兔IgG為二抗(抗體稀釋比均為1 ∶20 000)。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)三次。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、NSCLC癌組織及癌旁正常組織中THOR的表達(dá)

通過qRT-PCR檢測79例NSCLC癌組織及癌旁正常組織中THOR的表達(dá)水平，結(jié)果顯示癌組織中THOR的相對表達(dá)量為(0.79±0.31)顯著高于癌旁組織的(0.08±0.5)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=20.36,P<0.05)。且研究中發(fā)現(xiàn)癌組織中的THOR水平均高于其對應(yīng)的癌旁正常組織(見圖1)。

圖1 非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者癌組織和癌旁正常組織中THOR的表達(dá)水平

二、NSCLC患者癌組織中THOR表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

分析結(jié)果顯示NSCLC癌組織中THOR的表達(dá)水平與患者性別、年齡、吸煙史、病理類型無關(guān)(P>0.05)；但與TNM分期、分化程度和腫瘤大小有關(guān)(見表1)。

表1 NSCLC患者癌組織中THOR表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

三、THOR表達(dá)對NSCLC患者預(yù)后的影響

根據(jù)THOR表達(dá)的平均值，將79例NSCLC患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。NSCLC癌組織中THOR高表達(dá)的患者其生存率顯著低于THOR低表達(dá)的患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=21.73，P<0.001)(見圖2)。

圖2 THOR 表達(dá)水平不同與NSCLC患者生存率的關(guān)系

四、沉默THOR表達(dá)抑制A549細(xì)胞增殖

A549細(xì)胞分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染siRNA-THOR及對照siRNA-NC，MTT法檢測細(xì)胞增殖。得到如(圖3)所示，轉(zhuǎn)染siRNA-THOR細(xì)胞增殖能力顯著低于siRNA-NC，24h(0.54±0.04 VS 0.63±0.04)、48h(0.65±0.04 VS 0.79±0.05)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

圖3 THOR表達(dá)沉默抑制A549細(xì)胞增殖

五、沉默THOR表達(dá)誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡

細(xì)胞周期蛋白在調(diào)控細(xì)胞增殖中發(fā)揮重要作用。cyclin D1 已被公認(rèn)為是一種原癌基因，其過度表達(dá)可致細(xì)胞增殖失控而惡性化。本研究通過Western blot法檢測THOR表達(dá)沉默后對cyclin D1表達(dá)及凋亡相關(guān)蛋白Bcl2、BAX 和cleaved-caspase-3的表達(dá)的影響。得到如(圖4)所示結(jié)果：A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA-THOR后，cyclin D1、Bcl2蛋白表達(dá)降低，BAX 和cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)升高；與siRNA-NC相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。提示THOR可能通過調(diào)控cyclin D1的表達(dá)發(fā)揮生物學(xué)作用。

圖4 THOR表達(dá)沉默對A549細(xì)胞cyclin D1、Bcl2、BAX 和cleaved-caspase-3的表達(dá)的影響

討 論

肺癌是全世界癌癥相關(guān)死亡的主要原因，因此尋找新的診斷和治療靶位點(diǎn)有可能改善患者治療的臨床策略和預(yù)后[14]。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，不同lncRNAs在人類癌癥中與正常組織相比,或低、或高的表達(dá)，抑制或促進(jìn)不同類型的腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[15]。因此，腫瘤相關(guān)lncRNAs的鑒定、功能分析與臨床病理特征的關(guān)系，甚至對預(yù)后的影響的研究，對于新的治療靶點(diǎn)可能具有重要意義[16]。

THOR 是Hosono等人采用大規(guī)模轉(zhuǎn)錄組測序方法進(jìn)行腫瘤相關(guān)lncRNAs的研究時(shí)發(fā)現(xiàn)的一種新的lncRNA，隨后越來越多的研究證明THOR在癌組織中過表達(dá),可促進(jìn)癌癥的發(fā)展。如Cheng等發(fā)現(xiàn)THOR可通過靶向β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)促進(jìn)肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)細(xì)胞去分化和肝腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells，CSCs)擴(kuò)張[17]；Hu Song 證實(shí)THOR可以通過與SOX9 3′UTR直接結(jié)合來增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的干細(xì)胞等。目前針對THOR在肺癌和癌組織中表達(dá)差異性、與臨床病理特征的關(guān)系及患者預(yù)后方面的影響卻鮮見報(bào)道。

為了探明THOR表達(dá)和NSCLC之間的關(guān)系，提供NSCLC患者治療的指導(dǎo)意見和建議，本研究采用79例臨床NSCLC病理的癌組織和癌旁組織中THOR的表達(dá)量進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)NSCLC組織中THOR的表達(dá)量顯著上調(diào)。并通過對比不同臨床病理特征的NSCLC患者THOR表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)THOR表達(dá)量與分析結(jié)果顯示NSCLC癌組織中THOR的表達(dá)水平與TNM分期、分化程度和腫瘤大小有關(guān)，但與性別、年齡、吸煙史、病理類型無關(guān)。且經(jīng)過36個(gè)月的隨訪調(diào)查，通過生存率曲線可以看出NSCLC癌組織中THOR高表達(dá)的患者其生存率顯著低于THOR低表達(dá)的患者。

研究顯示THOR在人腎細(xì)胞癌(RCC)組織和細(xì)胞中高表達(dá)，并有效促進(jìn)癌細(xì)胞增殖[18]。本研究中我們發(fā)現(xiàn)人肺癌細(xì)胞A549中THOR高表達(dá)，使用siRNA沉默其表達(dá)后，CCK-8法檢測得到其增殖被顯著抑制。同時(shí)我們檢測細(xì)胞周期蛋白cyclin D1的表達(dá)變化，觀察到其表達(dá)降低。cyclin D1是一個(gè)促癌基因，在癌細(xì)胞高表達(dá)，靶向抑制cyclin D1可以有效抑制細(xì)胞增殖，降低抗凋亡蛋白Bcl2，BAX 表達(dá)升高，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[19]。沉默LncRNA THOR表達(dá)后，有效下調(diào)cyclin D1的表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖[20]。本研究中我們發(fā)現(xiàn)，沉默肺癌A549細(xì)胞LncRNA THOR表達(dá)后，cyclin D1、抗凋亡蛋白Bcl2表達(dá)降低，凋亡蛋白BAX 和cleaved-caspase-3表達(dá)升高。由此我們推斷LncRNA THOR可能通過調(diào)控cyclin D1表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，拮抗細(xì)胞凋亡，促進(jìn)肺癌的發(fā)生與發(fā)展。

綜上所述，THOR的表達(dá)上調(diào)在促進(jìn)NSCLC發(fā)展中發(fā)揮重要作用；THOR可以作為NSCLC的診斷標(biāo)志物或預(yù)后評估的標(biāo)志物，但需要大樣本的進(jìn)一步證實(shí)。LncRNA THOR促進(jìn)NSCLC細(xì)胞增殖及其調(diào)控cyclin D1表達(dá)的分子機(jī)制有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探索。