周恩正 郭貴明 蘇 旭 吳春凱 左 麗 貴州醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院貴陽550025

根據(jù)世界衛(wèi)生組織發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示,全世界乳腺癌的發(fā)生率占了所有癌癥的25.1%,已成為女性發(fā)病率最高的腫瘤[1]。我國女性乳腺癌發(fā)病率呈上升趨勢,根據(jù)國家癌癥中心2018年癌癥報告,乳腺癌占我國女性惡性腫瘤發(fā)病率的16.51%,排名第一,嚴重危害著女性的健康[2]。三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)是指雌激素受體(estrogen receptor,ER)、孕激素受體(progesterone receptor,PR)及人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor-2,HER-2)的表達均為陰性[3]。ER、PR、HER-2是目前臨床乳腺癌治療的靶點,由于TNBC缺乏這些靶點,也就不能進行激素阻斷及分子靶向治療,轉移率、復發(fā)率及病死率較高[4]。

胰島素可作用于細胞膜上的胰島素受體(insulin receptor,INSR),致使自身多個β亞基酪氨酸位點磷酸化,繼而與胰島素受體底物(IRS-1和IRS-2)結合,使底物磷酸化并與下游的磷脂酰肌醇3激酶(P13K)相互作用生成的3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)可以發(fā)揮第二信使作用激活其下游的蛋白激酶B(Akt)[5]。有報道胰島素、細胞因子可通過PI3K/Akt通路刺激Akt的活化[6]。并有報道將胰島素作為Akt激活劑來研究植物提取物對EGFR/PI3K/Akt信號通路的影響[7]。

山蒼子(Litsea cubeba)又名山雞椒,屬于樟科木姜子屬,具有芳香氣味,是一種食、藥兩用植物,根、莖、葉和果實均可入藥,有抗血栓、抗哮喘和抗過敏功效[8]。山蒼子油是從其果實中提取的一種淡黃色油狀液體,有研究報道山蒼子油在體外實驗中對胃癌、肺癌有較強的抑制作用,但未見對乳腺癌細胞作用的報道[9-10]。本文利用山蒼子油作用于三陰性乳腺癌細胞株MDA-MB-231,了解其對MDA-MB-231細胞增殖及凋亡的影響,并探討可能的作用機制,為開發(fā)山蒼子油治療乳腺癌提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人乳腺癌細胞MDA-MB-231購自ATCC細胞庫。山蒼子油由貴州黔中香綠色產(chǎn)業(yè)有限責任公司提供。DMEM(高糖型)培養(yǎng)基購自Gibco公司；胎牛血清、胰消化酶均購自BI公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁；AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒、細胞周期檢測試劑盒購自凱基生物技術有限公司；GAPDH、Bax、Bcl-2、EGFR、p-AKt、Akt抗體購自美國Abcam公司；二抗購自杭州賢至公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒、DMSO液(細胞水平)、RIPA細胞裂解液(弱)、PMSF、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購自中國索萊寶生物技術有限公司；胰島素、蛋白顯影液、PVDF膜均購自millipore公司；其他試劑均為進口或國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及藥品配制 人乳腺癌細胞MDA-MB-231用含10%胎牛血清的高糖型DMEM培養(yǎng)液,于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng),每2～3 d傳代1次,培養(yǎng)至對數(shù)生長期。山蒼子油溶于3%DMSO液(高糖型DMEM培養(yǎng)液為溶劑)中配置成濃度 分 別 為1.0 mg/ml、1.5 mg/ml、2.0 mg/ml、2.5 mg/ml、3.0 mg/ml溶液,室溫避光保存。

1.2.2 細胞增殖抑制實驗 取1.2.1的MDA-MB-231人乳腺癌細胞,以5×103個/孔接種于96孔板,培養(yǎng)24 h待細胞貼壁并生長覆蓋孔底約80%后,棄去培養(yǎng)上清液,加入終濃度為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/ml的山蒼子油,另設陰性對照組、空白對照組、陽性藥物對照組(順鉑濃度:0.5 mg/ml)和3%DMSO溶劑組,每孔10μl,每組設6個復孔,培養(yǎng)3 h、6 h、9 h、12 h后,分別每孔加入10μl的CCK-8試劑,37℃孵育90 min后,用酶標儀測定各孔在450 nm處的吸光值(OD值)。細胞抑制率=(陰性對照組-給藥組)/(陰性對照組-空白孔)×100%。

1.2.3 細胞周期分析 取1.2.1的MDA-MB-231人乳腺癌細胞,調整細胞濃度為1×105個/ml,接種于6孔板,每孔2 ml,待細胞生長至覆蓋板底約80%時,棄去培養(yǎng)上清液,加入終濃度為1.0、2.0、3.0 mg/ml的山蒼子油,每孔200μl,另設不含山蒼子油的陰性對照組,37℃、5%CO2培養(yǎng)9 h。收集孔內培養(yǎng)液(便于收集懸浮的乳腺癌細胞)裝入對應的流式上樣管內,每孔加入胰蛋白酶200μl,消化4 min,將消化的細胞懸液加入至對應的流式上樣管內,1 500 r/min,5 min收集。棄上清,用70%的乙醇溶液重懸,4℃固定2 h。1 500 r/min離心5 min棄上清,加入PI/RNaseA工作液,每管500μl,室溫避光反應30 min,使用流式細胞儀檢測分析。

1.2.4 AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測腫瘤細胞凋亡 取1.2.1 MDA-MB-231細胞,調整濃度為1×105個/ml,接種6孔板,每孔2 ml,待細胞生長至覆蓋板底約80%時,棄上清,加入終濃度為1.0、1.5、2.0、3.0 mg/ml的山蒼子油,每孔200μl,另設不含山蒼子油的陰性對照組,分別培養(yǎng)3 h、6 h、9 h。收集孔內培養(yǎng)液(便于收集懸浮的乳腺癌細胞)裝入對應的流式上樣管內,每孔加入胰酶200μl,消化4 min,將消化的細胞懸液加入到對應的流式管內1 500 r/min離心5 min收集；用PBS洗滌細胞2次(1 500 r/min離心5 min),各管加入85μl的Binding Buffer懸浮細胞；加入10μl AnnexinV-FITC混勻后,加入5μl Propidium Iodide,混勻；室溫、避光、反應15 min；流式細胞儀檢測分析。

1.2.5 Western blot檢測細胞凋亡相關蛋白的表達取1.2.1的人乳腺癌細胞MDA-MB-231,調整細胞濃度為1×105個/ml,接種于100 mm直徑的細胞培養(yǎng)皿中,每皿8 ml,待細胞生長至覆蓋板底約80%時,加入終濃度為1.0、1.5、2.0、2.5 mg/ml的山蒼子油,每孔800μl,另設不含山蒼子油的陰性對照組,置于37℃、5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)3 h、6 h、9 h,用PBS洗3次,加入細胞裂解液(RIPA:PMSF:Phrosphatose Inhibitor:Protoase Inhibitor=100∶1∶1∶1)冰上裂解30 min,4℃、12 000 r/min、20 min,用BCA法檢測蛋白濃度,加入上樣蛋白緩存液,置于沸水高溫變性7 min,取25μg蛋白質,經(jīng)10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后,轉移至PVDF膜上,室溫5%BSA封閉60 min,一抗孵育,4℃過夜,二抗室溫孵育60 min,最后用蛋白凝膠成像系統(tǒng)掃膜并采集圖像。

1.2.6 檢測山蒼子油對MDA-MB-231細胞EGFR/PI3K/Akt信號通路相關蛋白的表達 取對數(shù)生長期的人乳腺癌細胞MDA-MB-231接種于直徑為100 mm的培養(yǎng)皿中,設陰性對照組、山蒼子油(2.5 mg/ml)組、Akt激活劑組和山蒼子油Akt激活劑共處理組,待細胞生長至覆蓋板底約80%時,向各組加入相應試劑,置于37℃、5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)9 h,后續(xù)處理同1.2.5。

1.3 統(tǒng)計學處理 實驗結果數(shù)據(jù)以表示,經(jīng)Graphpad 7.0軟件進行統(tǒng)計分析,組間均數(shù)比較采用t檢驗,兩組以上均數(shù)比較采用單因素方差分析；P＜0.05為差異,具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 山蒼子油對人乳腺癌細胞MDA-MB-231增殖的抑制作用 結果顯示,在相同作用時間內,山蒼子油對MDA-MB-231細胞增殖的抑制率隨著濃度的增加而增強。3 h處理組各濃度抑制率分別為17.80%±1.91%、31.40%±2.12%、36.20%±2.40%、45.00%±2.21%、64.30%±1.72%,與對照組比較差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。隨著藥物作用時間的延長,相同藥物濃度組內,山蒼子油對細胞的抑制作用隨之增強。3.0 mg/ml濃度組各時間段的抑制率分別為,64.30%±1.72%、71.70%±3.10%、83.50%±2.67%、89.10%±3.78%,與3 h組比較,差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。實驗結果表明3%DMSO溶劑組抑制率與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。說明山蒼子油對人乳腺癌細胞MDA-MB-231增殖的抑制作用具有濃度和時間依賴性(表1)。

2.2 山蒼子油對人乳腺癌細胞MDA-MB-231增殖周期的影響 結果顯示,隨著山蒼子油作用濃度的增加,細胞各期的細胞比例發(fā)生變化,G2/M期比例明顯的降低而S期比例明顯升高,對照組(S期占比29.90%±0.62%,G2/M占比38.81%±1.22%)、1.0 mg/ml(S期占比34.96%±1.52%,G2/M占比34.73%±2.11%)、2.0 mg/ml(S期占比37.93%±1.02%,G2/M占比31.78%±1.41%)、3.0 mg/ml(S期占比43.08%±2.13%,G2/M占比28.96%±1.82%),與對照組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。結果表明,山蒼子油能誘導MDA-MB-231細胞周期發(fā)生S期阻滯(圖1)。

表1 不同作用時間和藥物濃度對人乳腺癌細胞MDA-MB-231增殖的影響(，%，n=6)Tab.1 Effects of different time and drug concentration on proliferation of human breast cancer cell MDA-MB-231(，%，n=6)

表1 不同作用時間和藥物濃度對人乳腺癌細胞MDA-MB-231增殖的影響(，%，n=6)Tab.1 Effects of different time and drug concentration on proliferation of human breast cancer cell MDA-MB-231(，%，n=6)

Note:1)P＜0.05,2)P＜0.01,3)P＜0.001 vs control；4)P＜0.05,5)P＜0.01,6)P＜0.001 vs 3 h.

Groups Inhibition rate at different time intervals 3 h 6 h 9 h 12 h Control 3.70±0.09 4.41±0.12 5.15±0.08 5.53±0.03 DDP 14.60±1.70 45.20±3.22 61.10±3.61 82.30±4.50 3%DMSO 5.70±0.90 4.40±0.60 6.00±0.20 7.80±0.31 1.0 mg/ml 17.80±1.911) 26.60±2.511)4) 45.10±1.643)5) 53.80±2.773)6)1.5 mg/ml 31.40±2.122) 36.50±1.732) 53.70±2.403)4) 61.60±4.363)5)2.0 mg/ml 36.20±2.402) 52.60±2.033)4) 63.60±2.011)5) 71.90±1.683)4)2.5 mg/ml 45.00±2.213) 62.70±3.243)4) 74.80±3.933)4) 80.60±3.403)5)3.0 mg/ml 64.30±1.723) 71.70±3.103)4) 83.50±2.673)5) 89.10±3.783)5)

2.3 山蒼子油對人乳腺癌細胞MDA-MB-231凋亡的影響 實驗結果顯示,隨著山蒼子油濃度的增加,3 h各濃度組細胞中晚期凋亡所占的比例逐漸增加,與對照組(中晚期凋亡占比2.92%±0.25%)比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。在相同濃度下,隨著作用時間的延長,細胞中晚期凋亡所占的比例也逐漸增加。如3.0 mg/ml組在3 h、6 h、9 h細胞中晚期凋亡占比分別為25.42%±0.75%、92.30%±2.77%、98.97%±3.42%。與3 h組比較均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01,圖2)。上述結果說明,山蒼子油能夠促進人乳腺癌細胞MDA-MB-23凋亡的發(fā)生,并且具有濃度和時間依賴性。

圖1 山蒼子油對人乳腺癌細胞MDA-MB-231周期的影響Fig.1 Effect of Litsea cubeba oil on MDA-MB-231 cycle of human breast cancer cells

2.4 山蒼子油對人乳腺癌細胞MDA-MB-231凋亡相關蛋白表達的影響 山蒼子油可抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達,增加促凋亡蛋白Bax、casepase-3的表達,隨著濃度的增加,Bcl-2的表達量逐漸降低,Bax、casepase-3的表達量逐漸增加,與對照組比較均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。相同濃度情況下,抗凋亡蛋白Bcl-2的表達量,隨作用時間的延長,其表達量呈遞減趨勢,促凋亡蛋白Bax、casepase-3的表達量呈逐漸增加趨勢,與3 h處理組比較,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05,圖3)。

2.5 山蒼子油對MDA-MB-231細胞EGFR/PI3K/Akt通路蛋白表達的影響 山蒼子油呈濃度依賴性抑制EGFR、Akt、P-Akt蛋白的表達,與對照組相比,有統(tǒng)計學意義(P＜0.01,圖4)。與對照組相比,加入Akt激活劑胰島素(100μg/L)可以激活上調Akt、p-Akt蛋白表達水平(P＜0.01),在胰島素基礎上加入山蒼子油(2.5 mg/ml),可明顯降低Akt和P-Akt蛋白的表達(P＜0.01,圖5),提示山蒼子油可以抑制EGFR/PI3K/Akt信號通路。

圖2 山蒼子油對人乳腺癌細胞MDA-MB-231凋亡的影響Fig.2 Effect of Litsea cubeba oil on apoptosis of human breast cancer cell MDA-MB-231

圖3 三蒼子油對MDA-MB-231細胞Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達的影響Fig.3 Effect of Litsea cubeba oil on expression of Bcl-2，Bax and Caspase-3 in MDA-MB-231 cells

圖4 三蒼子油對MDA-MB-231細胞EGFR、Akt、p-Akt蛋白表達的影響Fig.4 Effect of Litsea cubeba oil on expression of EGFR，Akt and p-Akt in MDA-MB-231 cells

3 討論

圖5 Western blot檢測MDA-MB-231細胞Akt，p-Akt蛋白的表達Fig.5 Western blot detection of Akt，p-Akt protein expression in MDA-MB-231 cells

乳腺癌是發(fā)生在乳腺上皮組織的惡性腫瘤,發(fā)病率和死亡率均較高,嚴重危害女性生命健康。因此,尋求有效的治療方法和藥物具有重要意義。細胞凋亡又稱為細胞程序性死亡,是指在自身或外界因素作用下,由細胞自身基因調控的一種主動的、有序性細胞死亡形式[11]。大量研究已證實Bcl-2基因家族是與細胞凋亡關系最密切的家族之一[12-13]。Bcl-2家族成員包括Bcl-2、Bcl-XL、Bax和Bad等。Bcl-2是重要的抑制細胞凋亡的基因,其同源基因Bax則可誘導細胞凋亡。Bax表達增強時,可誘導細胞凋亡,而Bcl-2表達增強時,則抑制細胞凋亡。細胞凋亡后期的共同途徑是Caspases的激活,Caspase-3是細胞凋亡過程中關鍵的執(zhí)行蛋白,在各種因素誘導的凋亡程序中起最后的樞紐作用。

表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)家族主要由EGFR、HER2、HER3和HER4等4個不同的受體酪氨酸激酶組成,是一種大分子跨膜糖蛋白[14]。現(xiàn)已證實,在人類多種惡性腫瘤組織和腫瘤細胞株中,存在著EGFR表達和功能的異常[15]。研究顯示,PI3K/Akt是細胞生長、代謝、凋亡等生物學行為的重要調節(jié)通路,有越來越多證據(jù)表明PI3K/Akt參與許多惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[16]。而PI3K/Akt是EGFR跨膜傳遞信號的其中一條下游通路。因此本實驗主要以EGFR/PI3K/Akt這條信號通路為基礎,初步探討山蒼子油的體外抗腫瘤的可能機制。

本研究以山蒼子油為研究對象,通過其作用于體外培養(yǎng)的人乳腺癌細胞MDA-MB-231,了解山蒼子油對MDA-MB-231細胞增殖的影響。研究表明山蒼子油對人乳腺癌細胞增殖有抑制作用,隨著作用濃度的增加及時間的延長,其抑制效果也隨之增強,與對照組相比,差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。臧文霞等[10]報道利用山蒼子油作用于體外培養(yǎng)的人肺腺癌細胞、肝癌細胞,結果顯示出對這兩種腫瘤細胞增殖的抑制作用,并呈現(xiàn)劑量依賴性,但在上述報告中,研究者并未對抑制作用的可能機制做進一步的探討。本實驗結果說明山蒼子油對體外培養(yǎng)的MDA-MB-231細胞也有相似的增殖抑制效果。山蒼子油對MDA-MB-231細胞增殖的抑制作用是否通過誘導細胞凋亡起作用、是否對細胞的分裂周期產(chǎn)生影響,本課題組通過進一步實驗對上述假設加以驗證。結果表明:山蒼子油能夠誘導人乳腺癌細胞MDA-MB-231發(fā)生凋亡,隨著作用濃度的增加及時間的延長,其誘導細胞凋亡的作用也隨之增強,同時結果顯示,山蒼子油阻滯MDA-MB-231細胞于S期,隨著藥物濃度增加,各實驗組細胞中S期所占的比例隨之增加。SHUN等[11]在研究EGFR/PI3K/Akt通路與惡性腫瘤凋亡的報道中指出乳腺癌、胃癌等多種惡性腫瘤細胞內Akt及p-Akt蛋白的表達量均明顯高于正常細胞,提示該通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。本研究結果表明,山蒼子油呈濃度依賴性抑制EGFR、Akt、p-Akt蛋白的表達(P＜0.01),與對照組相比,胰島素(100μg/L)可以激活上調Akt、p-Akt蛋白表達水平(P＜0.01),在胰島素基礎上加入山蒼子油(2.5 mg/ml),可明顯降低Akt和P-Akt蛋白的表達強度(P＜0.01),提示山蒼子油可以抑制EGFR/PI3K/Akt信號通路。韋立群等[7]在研究金雀異黃酮對MDA-MB-231細胞凋亡及其與EGFR/PI3K/Akt通路的關系報道中,Akt和P-Akt蛋白表達受抑制的程度與本實驗結果較為一致。綜上所述,本研究顯示山蒼子油可顯著抑制體外條件下人乳腺癌細胞MDA-MB-231的增殖,且抑制作用呈濃度和時間依賴性。山蒼子油阻滯MDA-MB-231細胞分裂周期于S期并能誘導細胞凋亡,其誘導MDA-MB-231細胞凋亡的機制可能與抑制EGFR/PI3K/Akt信號通路有關。細胞凋亡的信號通路十分復雜,在山蒼子油誘導人乳腺癌細胞MDA-MB-231凋亡的過程中是否還存在其它可能的作用機制,需要繼續(xù)研究。山蒼子油在體外實驗中顯示出對MDA-MB-231細胞增殖的抑制作用,在動物實驗中是否有相同的效果將進一步進行探究。