童晨曦 楊雪婷 周恩俊 曾 艷 陳昌蓉 宋銀宏三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院三峽大學(xué)感染與炎癥損傷研究所宜昌443002

白藜蘆醇(resveratrol,RES)是一種廣泛存在于植物中的多酚化合物,已展示出很強(qiáng)的抗腫瘤效應(yīng)而沒有常規(guī)化學(xué)療法的毒副作用[1-2]。RES對(duì)多種骨肉瘤細(xì)胞系具有抗增殖作用也已得到證實(shí)[3-4]。然而,RES是否具有增強(qiáng)骨肉瘤細(xì)胞免疫原性,從而改善腫瘤免疫微環(huán)境的作用還未知。此前有研究報(bào)道,RES能增強(qiáng)小鼠腎癌細(xì)胞免疫原性,同時(shí)改善腫瘤微環(huán)境以達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的效應(yīng)[5]。RES通過增強(qiáng)腎癌細(xì)胞免疫原性成功發(fā)揮免疫治療作用有下述機(jī)制:誘導(dǎo)和增強(qiáng)更多相關(guān)免疫細(xì)胞正確識(shí)別和破壞腫瘤細(xì)胞的能力[6]；克服腫瘤的免疫逃逸機(jī)制,讓腫瘤細(xì)胞表達(dá)在逃逸過程中喪失的抗原,克服抗原呈遞、加工過程中的缺陷[7]。本課題組前期探討RES對(duì)體外骨肉瘤細(xì)胞系的抗增殖作用時(shí)發(fā)現(xiàn),RES除了具有誘導(dǎo)K7M2細(xì)胞凋亡和阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程的作用外,亦有增強(qiáng)體內(nèi)外骨肉瘤細(xì)胞免疫原性的潛力；通過增加MHCⅠ和MHCⅡ類分子的表達(dá)來提高抗原提呈能力、減弱骨肉瘤的免疫逃逸現(xiàn)象[8]。在此基礎(chǔ)上,本研究通過構(gòu)建荷K7M2骨肉瘤BALB/c鼠移植瘤模型,首先探討了RES對(duì)荷骨肉瘤小鼠移植瘤的生長(zhǎng)抑制作用,通過觀察處理后小鼠肝腎器官形態(tài)學(xué)的變化來判斷RES的毒性作用。此外,本研究在體外和體內(nèi)檢測(cè)了腫瘤細(xì)胞表面PD-L1的表達(dá)變化,以及荷瘤小鼠腫瘤微環(huán)境中各種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)比例的改變；并對(duì)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)變化在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行驗(yàn)證,以期為RES臨床治療骨肉瘤提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 18只SPF級(jí)BALB/c小鼠(雌性,6～8周齡,體重16～18 g),購(gòu)于三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào):42010200001767；在三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)小鼠飼養(yǎng)室常規(guī)飼養(yǎng)。

1.1.2 細(xì)胞株 鼠骨肉瘤K7M2細(xì)胞購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)。

1.1.3 主要試劑和儀器 白藜蘆醇(成都克洛瑪生物科技有限公司)；DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清(Gibco)；TRIzol(Reagent Invitrogen)；PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PowerUpTMSYBR Green Master Mix(Thermo Scientific)；PD-L1純化的抗小鼠CD274抗體(貨號(hào):124301)、AlexaFluor?488山羊抗大鼠IgG抗體(貨號(hào):405418)、CD45-APC/Cy7熒光單克隆抗體(貨號(hào):103112)、NK1.1-PE熒光單克隆抗體(貨號(hào):108708)、CD8-BV510熒光單克隆抗體(貨號(hào):100710)、CD16/32(貨號(hào):101302)購(gòu)自Biolegend公司；β-actin兔抗鼠單克隆抗體(貨號(hào):RLT0099)、CyclinE1兔抗鼠單克隆抗體(貨號(hào):RLT1176)、XIAP兔抗鼠單克隆抗體(貨號(hào):RLT4913)購(gòu)自Ruiying Biological；CD3-APC熒光單克隆抗體(貨號(hào):553061)、CD11b-FITC熒光單克隆抗體(貨號(hào):557396)、Ly-6G/Ly-6C-PerCP Cy5.5熒光單克隆抗體(即Gr1,貨號(hào):552093)、CD4-FITC熒光單克隆抗體(貨號(hào):557307)、CD25-APC熒光單克隆抗體(貨號(hào):558643)、FoxP3-PE熒光單克隆抗體(貨號(hào):563101)購(gòu)自美國(guó)BD公司；Mcl-1兔抗鼠單克隆抗體(貨號(hào):#94296)、Bcl-2兔抗鼠單克隆抗體(貨號(hào):#3498)、Bax兔抗鼠單克隆抗體(貨號(hào):#2772)購(gòu)自美國(guó)CST公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(貨號(hào):GB23303)購(gòu)自武漢谷歌生物科技有限公司；Kras兔抗鼠單克隆抗體(貨號(hào):ab180772)購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。蛋白提取試劑盒(索萊寶科技有限公司)；BCA蛋白定量試劑盒(Thermo Scientific)；細(xì)胞破膜/固定試劑盒(BD公司)；FACSVerse流式細(xì)胞儀(BD公司)；Multiskan Spectrum全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(Thermo Scientific)；StepOnePlus實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Applied Biosystems公司)；GelX凝膠成像系統(tǒng)(上海歐翔科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 骨肉瘤K7M2細(xì)胞用含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的高糖DMEM,放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。隔天換液,每隔2 d傳代1次。荷瘤前24 h對(duì)細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)換液,保證細(xì)胞融合度＞80%。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)體外K7M2細(xì)胞表面PDL1表達(dá) K7M2細(xì)胞用RES(20μmol/L、40μmol/L)處理48 h,對(duì)照組加入藥物處理組等體積的DMSO。收集細(xì)胞并用PBS洗滌2次,首先加入1∶100的PD-L1純化的抗小鼠CD274抗體,冰上避光孵育60 min,隨后PBS洗滌3次,加入1∶100的AlexaFluor?488山羊抗大鼠IgG抗體,冰上避光孵育30 min,流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組PD-L1表達(dá)變化。

1.2.3 動(dòng)物模型建立及分組 小鼠按照隨機(jī)對(duì)照原則分為DMSO組、RES低劑量組(50 mg/kg)、RES高劑量組(100 mg/kg)。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K7M2細(xì)胞消化離心,用PBS調(diào)整細(xì)胞濃度為2.5×106個(gè)/ml,注射器吸取200μl接種于小鼠右側(cè)腹皮下。接種腫瘤細(xì)胞第9天,觀察到注射處有肉眼可見腫塊形成,用游標(biāo)卡尺測(cè)量體積,長(zhǎng)徑及短徑均≥0.3 cm,判斷荷瘤成功。

1.2.4 給藥方法 溶于DMSO中的藥物儲(chǔ)液,用PBS溶液稀釋后,按小鼠體重分別進(jìn)行相應(yīng)濃度藥物瘤周注射；對(duì)照組注射含有藥物相應(yīng)體積DMSO的PBS溶液。注射前將藥物充分混勻,每日注射1次。注射用藥16 d后,頸椎脫臼法處死小鼠,并收集部分移植瘤用于免疫細(xì)胞分析；另一部分移植瘤組織用于基因和蛋白的檢測(cè)；收集肝腎組織用10%甲醛固定,用于HE染色法染色,觀察其有無結(jié)構(gòu)性改變,以判斷RES的藥物毒副作用。

1.2.5 主要指標(biāo)檢測(cè)

1.2.5.1 RES對(duì)荷骨肉瘤小鼠移植瘤生長(zhǎng)抑制的測(cè)定 每日用游標(biāo)卡尺測(cè)量小鼠移植瘤長(zhǎng)短徑并記錄數(shù)值,計(jì)算移植瘤體積,腫瘤體積=長(zhǎng)徑×短徑2/2,按照所得腫瘤體積數(shù)值繪制腫瘤生長(zhǎng)抑制曲線。

1.2.5.2 RT-qPCR檢測(cè)移植瘤組織中細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá)量變化 將移植瘤組織放入適量TRIzol溶液中,用電動(dòng)勻漿器研磨提取RNA,將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用SYBRGreen Master Mix在StepOnePlus Real-Time PCR System儀器上進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)。β-actin作為內(nèi)參,用2-ΔΔCt法計(jì)算Xiap、Kras、Bcl-2、Mcl-1、CyclinE1、BAX相對(duì)表達(dá)量。RT-qPCR反應(yīng)條件:95℃45 s,56℃30 s,72℃3 min,40個(gè)循環(huán)。所有引物序列及相關(guān)信息見表1。

1.2.5.3 Western blot檢測(cè)移植瘤組織中細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)量變化 將移植瘤組織放入適量體積的RIPA裂解液中,電動(dòng)勻漿器研磨提取腫瘤細(xì)胞總蛋白,BCA法測(cè)定蛋白濃度。用SDSPAGE凝膠電泳分離蛋白,濕轉(zhuǎn)90 min至PVDF膜上,置于5%脫脂牛奶中室溫封閉1 h,相應(yīng)條帶分別加入1∶2 000的β-actin兔抗鼠單克隆抗體、CyclinE1兔抗鼠單克隆抗體和XIAP兔抗鼠單克隆抗體；以1∶2 000比例稀釋的Mcl-1兔抗鼠單克隆抗體、Bcl-2兔抗鼠單克隆抗體和BAX兔抗鼠單克隆抗體；以1∶500比例稀釋的Kras兔抗鼠單克隆抗體；于4℃孵育過夜,TBST洗膜3次,加入1∶4 000的辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗,室溫孵育1 h,ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色。IPP6.0對(duì)顯影出來的條帶進(jìn)行分析。

1.2.5.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)移植瘤細(xì)胞表面PD-L1表達(dá)量和移植瘤組織中CD8+T細(xì)胞、NK和NKT細(xì)胞百分比變化 獲取的移植瘤組織,去除結(jié)締組織,放入含2%胎牛血清的PBS溶液中,剪碎、研磨擠壓成單細(xì)胞懸液。96孔U型微孔板上設(shè)置空白對(duì)照組、抗體單標(biāo)記組、DMSO組、RES 50 mg/kg組、RES100 mg/kg組,每孔加入250μl單細(xì)胞懸液,300 g離心5 min后棄上清收集細(xì)胞。三種處理組首先加入50μl(1∶100)PD-L1抗體冰上避光孵育60 min,各管加入250μl PBS重懸,300 g離心5 min后棄上清,重復(fù)2次；加入50μl(1∶100)AlexaFluor?488山羊抗大鼠IgG抗體冰上避光孵育30 min,PBS洗滌2次；再加入50μl(1∶100)熒光單克隆抗體組合CD45-APC/Cy7、CD3-APC、NK1.1-PE、CD8-BV510、CD16/32；單標(biāo)記組分別加入單個(gè)熒光抗體,空白對(duì)照組不加入任何抗體,混勻4℃避光60 min,各管加入250μl PBS重懸,300 g離心5 min后棄上清,重復(fù)2次；用300μl PBS重懸后上流式細(xì)胞儀分析不同組移植瘤組織中CD8+T(表型為CD3+CD8+)細(xì)胞、NK(表型為CD3-NK1.1+)和NKT(表型為CD3+NK1.1+)細(xì)胞百分比變化以及腫瘤細(xì)胞表面PD-L1表達(dá)量變化。

表1 PCR引物Tab.1 PCR primers

1.2.5.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)移植瘤組織中髓源抑制性細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)百分比變化 同上法制備各處理組小鼠移植瘤的單細(xì)胞懸液,三種處理組分別加入熒光標(biāo)記的單克隆抗體組合CD11b-FITC和Ly-6G/Ly-6C-PerCP Cy5.5(Ly-6G/Ly-6C即Gr1)并在冰上避光孵育,同時(shí)設(shè)置單標(biāo)和空白對(duì)照,孵育結(jié)束后用PBS洗滌并重懸,最后用流式細(xì)胞儀分析不同組移植瘤組織中MDSCs(表型為CD11b+Gr1+)百分比變化。

1.2.5.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)移植瘤組織中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells,Tregs)細(xì)胞百分比變化 同上法制備各處理組小鼠移植瘤的單細(xì)胞懸液,各組分別加入熒光標(biāo)記的單克隆抗體組合CD4-FITC和CD25-APC,混勻4℃避光60 min；各管加入250μl PBS重懸,300 g離心5 min后棄上清,重復(fù)2次；加入1×固定/穿膜液100μl,4℃避光孵育30 min,加入250μl 1×洗滌緩沖液300 g離心5 min,洗滌2次,棄上清液；每孔加入固定/穿膜液配置的(1∶100)Foxp3-PE抗體50μl,4℃避光孵育60 min,加入250μl 1×洗滌緩沖液300×g離心5 min,洗滌2次,各管加入300μl PBS重懸。同時(shí)設(shè)置各種熒光抗體單標(biāo)對(duì)照及空白對(duì)照,最后上流式細(xì)胞儀分析不同組移植瘤組織中Treg細(xì)胞(表型為CD25+CD4+Foxp3+)百分比變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism 6.02軟件,運(yùn)用獨(dú)立樣本雙尾t檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有數(shù)據(jù)均用表示。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RES對(duì)荷骨肉瘤小鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響及藥物毒副作用的測(cè)定 如圖1A所示,RES注射用藥16 d后,與DMSO組相比較,50 mg/kg及100 mg/kg兩個(gè)處理組的小鼠腫瘤體積顯著減小(P＜0.05,P＜0.01),表明50 mg/kg及100 mg/kg的RES均能顯著抑制小鼠K7M2移植瘤生長(zhǎng)。另外,HE染色結(jié)果顯示,50 mg/kg及100 mg/kg RES處理組小鼠肝腎組織與DMSO組無顯著結(jié)構(gòu)性差異,說明50 mg/kg及100 mg/kg RES并無明顯藥物毒性。

2.2 RES在體內(nèi)外對(duì)骨肉瘤細(xì)胞表面PD-L1表達(dá)量的影響 如圖1B、C所示,與DMSO組相比較,RES 20μmol/L處理組PD-L1表達(dá)無顯著變化(NS),而RES 40μmol/L處理組PD-L1表達(dá)顯著增高(P＜0.001)。與體外結(jié)果相反,在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中(如圖1D、E),與DMSO組相比較,RES 100 mg/kg組PD-L1表達(dá)顯著降低(P＜0.05)。

2.3 RES在體內(nèi)對(duì)與骨肉瘤細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期相關(guān)的基因和蛋白表達(dá)量的影響 如圖2所示,用RT-qPCR和Western blot檢測(cè)mRNA和蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn),與DMSO組相比較,RES 100 mg/kg處理組Xiap、Kras、Mcl-1、Bcl-2和CylclinE1 mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低(均P＜0.05),而BAX mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著升高(均P＜0.05)。

圖1 RES對(duì)體內(nèi)外腫瘤細(xì)胞PD-L1表達(dá)及荷骨肉瘤小鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effect of RES on expression of PD-L1 on osteosarcoma cells and growth of transplanted osteosarcoma

2.4 RES對(duì)移植瘤組織中CD8+T細(xì)胞、NK和NKT細(xì)胞比例的影響 RES注射用藥16 d后,與DMSO組相比較,50 mg/kg及100 mg/kg兩處理組的小鼠移植瘤組織中CD8+T細(xì)胞百分比均顯著增多(P＜0.01,P＜0.001,圖3A、B)；NK細(xì)胞百分比均顯著增多(P＜0.001,P＜0.001,圖3C、D)；NKT細(xì)胞百分比亦顯著增多(P＜0.01,P＜0.05,圖3C、D)。說明RES處理能募集更多的抗腫瘤的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)到腫瘤中,調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境,增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤能力。

圖2 RES體內(nèi)處理對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期相關(guān)的基因和蛋白表達(dá)量的影響Fig.2 Effect of RES on expression of mRNAs and proteins involved in apoptosis and cell cycle in tumor cells

圖3 RES對(duì)移植瘤組織中浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞比例的影響Fig.3 Effect of RES on percentage of immune cells infiltrated in transplanted tumor tissues

2.5 RES對(duì)腫瘤組織中MDSCs比例的影響 如圖3E、F所示,RES注射用藥16 d后,與DMSO組相比較,50 mg/kg及100 mg/kg兩個(gè)處理組的小鼠腫瘤組織中MDSCs百分比顯著減少(P＜0.05,P＜0.001),說明RES能改善荷骨肉瘤小鼠移植瘤組織中的腫瘤微環(huán)境,通過減少具有顯著抑制免疫應(yīng)答能力的MDSCs的浸潤(rùn)來增強(qiáng)免疫作用。

2.6 RES對(duì)腫瘤組織中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例的影響如圖3G、H所示,RES注射用藥16 d后,與DMSO組相比較,50 mg/kg及100 mg/kg兩個(gè)處理組的小鼠腫瘤組織中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞顯著減少(P＜0.01,P＜0.01),說明RES可以減少發(fā)揮免疫抑制性作用的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的浸潤(rùn),解除對(duì)其他免疫細(xì)胞的抑制作用,增強(qiáng)抗腫瘤免疫。

3 討論

骨肉瘤是一種惡性程度極高的骨腫瘤,是最常見于兒童的三種腫瘤之一,其中全世界15歲以下患有骨肉瘤的患者約有5萬例[9-10]。骨肉瘤患者通常采用化療和手術(shù)聯(lián)合的方式進(jìn)行治療。對(duì)于非轉(zhuǎn)移性骨肉瘤而言,接受術(shù)后輔助化療,其5年生存率為60%～70%[11]。但骨肉瘤的治療還是面臨著復(fù)發(fā)和化療耐藥的巨大挑戰(zhàn),腫瘤復(fù)發(fā)的患者中80%存在腫瘤轉(zhuǎn)移,這些患者的5年生存率僅為15%～30%[12-15]。因此,骨肉瘤迫切需要新的治療策略。

免疫治療近年發(fā)展迅速,通過免疫方式來對(duì)抗腫瘤已經(jīng)展現(xiàn)出巨大的潛力[16-17]。在79%的尤文肉瘤中也觀察到完全或部分缺乏MHCⅠ類分子表達(dá),反映其免疫逃逸機(jī)制的存在。而基于腫瘤反應(yīng)性的T細(xì)胞或NK細(xì)胞的免疫治療策略也可以改善晚期尤文肉瘤的治療效果[18]。RES同樣展現(xiàn)具有免疫調(diào)節(jié)作用的潛力,除了上述所提到其增強(qiáng)腎細(xì)胞癌免疫原性的作用外[5],在本課題組前期的研究中也發(fā)現(xiàn)RES在顯著抑制體外骨肉瘤K7M2細(xì)胞系增殖的同時(shí),能顯著增強(qiáng)體內(nèi)外骨肉瘤K7M2細(xì)胞的MHC分子的表達(dá)[8]。本研究中通過構(gòu)建荷骨肉瘤K7M2小鼠移植瘤模型,首先發(fā)現(xiàn)RES在50 mg/kg和100 mg/kg兩個(gè)劑量連續(xù)注射16 d能夠顯著抑制荷骨肉瘤小鼠移植瘤生長(zhǎng),進(jìn)而對(duì)這種抑制效應(yīng)的分子和免疫機(jī)制進(jìn)行了探索。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,骨肉瘤細(xì)胞中與細(xì)胞凋亡和周期相關(guān)的基因和蛋白的表達(dá)在RES注射給藥后,同樣發(fā)生了改變。發(fā)揮抑制凋亡作用的X連鎖凋亡抑制蛋白(Xlinked inhibitor of apoptosis protein,XIAP)[19],在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起作用的Kras以及Bcl-2家族中發(fā)揮抗凋亡作用的Bcl-2和Mcl-1 mRNA和蛋白表達(dá)均下調(diào),Bcl-2家族中起促凋亡作用的BAX mRNA和蛋白表達(dá)則升高[20-21]；另外,在大多數(shù)人類腫瘤中過表達(dá)并與腫瘤發(fā)生相關(guān)的CyclinE1 mRNA和蛋白表達(dá)也同樣顯著降低[22]。這些結(jié)果表明RES處理后誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡發(fā)生和細(xì)胞周期的變化在小鼠移植瘤的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)中同樣發(fā)揮重要作用。而在探索腫瘤細(xì)胞免疫原性改變方面,除了之前研究中發(fā)現(xiàn)的MHC分子的表達(dá)變化之外[8],本課題組在體內(nèi)外對(duì)腫瘤細(xì)胞表面PD-L1的表達(dá)也進(jìn)行了檢測(cè)。但需要注意的是,整個(gè)研究中有兩處出現(xiàn)了體內(nèi)和體外結(jié)果表達(dá)不一致,其一就是RES體外處理后,K7M2細(xì)胞表面PD-L1的表達(dá)變化不明顯甚至出現(xiàn)表達(dá)升高,而體內(nèi)用藥后,腫瘤細(xì)胞表面PD-L1表達(dá)明顯下降。實(shí)際上,腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)的PD-L1通過與活化T細(xì)胞表面的PD-1受體結(jié)合而發(fā)揮免疫抑制作用[23],而單純?cè)隗w外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)PD-L1這種免疫效應(yīng)難以產(chǎn)生,而出現(xiàn)此種表達(dá)變化差異；另外一處則是CyclinE1蛋白表達(dá)在體外檢測(cè)為顯著升高,而在體內(nèi)給藥后,腫瘤細(xì)胞CyclinE1蛋白表達(dá)顯著降低,活體動(dòng)物具有更復(fù)雜的分子調(diào)控機(jī)制,同樣,完善的免疫系統(tǒng)所發(fā)揮的效應(yīng)也是細(xì)胞實(shí)驗(yàn)所無法模擬的；免疫抗腫瘤效應(yīng)在體內(nèi)增強(qiáng)也可能影響信號(hào)分子表達(dá)的變化?？傊?雖然PDL1和CylinE1體內(nèi)外表達(dá)結(jié)果不相同,但本研究的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中都觀察到了腫瘤細(xì)胞顯著的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)。而到底是何種機(jī)制導(dǎo)致上述表達(dá)變化的差異將是我們未來的研究?jī)?nèi)容,如在各自機(jī)制中影響體內(nèi)體外表達(dá)的可能因素,如其他周期蛋白的表達(dá)變化,亦或是免疫機(jī)制和分子機(jī)制之間的相互作用影響。

RES具有改變腫瘤細(xì)胞免疫原性的潛力[5,8],因此課題組通過流式檢測(cè)了移植瘤組織中免疫細(xì)胞的數(shù)量變化,發(fā)現(xiàn)較DMSO組小鼠而言,50 mg/kg和100 mg/kg RES組的小鼠移植瘤組織中CD8+T、NK和NKT細(xì)胞數(shù)量顯著增多,而MDSCs和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量顯著減少。CD8+T細(xì)胞可以識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)增強(qiáng)的MHCⅠ類分子抗原肽復(fù)合物,CD8+T細(xì)胞、NKT和NK細(xì)胞參與攻擊腫瘤細(xì)胞,在抑制腫瘤增殖中發(fā)揮重要的作用[24]。在腫瘤發(fā)展過程中,具有CD4+CD25+Foxp3+表型的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞以及有類似作用的MDSCs等免疫細(xì)胞可以共同拮抗保護(hù)性的免疫反應(yīng),加速腫瘤進(jìn)展[25-26]。而本研究的結(jié)果表明,RES顯著減少了腫瘤組織中的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和MDSCs浸潤(rùn),可逆轉(zhuǎn)這些免疫細(xì)胞對(duì)骨肉瘤的免疫抑制作用。這些變化與增加的CD8+T細(xì)胞、NK-T細(xì)胞和NK細(xì)胞共同作用,改善腫瘤免疫微環(huán)境,抑制了移植瘤的生長(zhǎng)。

需要強(qiáng)調(diào)的是,本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分并未設(shè)置陽性對(duì)照組,主要原因是RES作用于骨肉瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用已得到廣泛研究[27-29],而前期也并未查詢到調(diào)節(jié)荷骨肉瘤小鼠移植瘤免疫細(xì)胞的藥物。缺乏陽性對(duì)照組無法比較與目前臨床用藥的藥效強(qiáng)度,同時(shí),實(shí)驗(yàn)也可能出現(xiàn)假陽性。此研究再次驗(yàn)證其他報(bào)道中RES對(duì)體內(nèi)外骨肉瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用,而對(duì)免疫調(diào)節(jié)作用進(jìn)行的是初步的探索,因?yàn)槿鄙訇栃詫?duì)照組可能出現(xiàn)的影響主要通過合理的實(shí)驗(yàn)操作和檢測(cè)方法來規(guī)避。

綜上所述,RES能抑制荷骨肉瘤K7M2小鼠移植瘤生長(zhǎng),這也與既往報(bào)道的RES體外抗K7M2細(xì)胞系增殖結(jié)論相一致[8]。RES能調(diào)控與細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期相關(guān)基因及蛋白表達(dá)；并且,RES能顯著增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞免疫原性,調(diào)控多種免疫細(xì)胞參與抗腫瘤,即抗腫瘤免疫細(xì)胞比例顯著增多,而抑制性免疫細(xì)胞浸潤(rùn)顯著減少；兩種機(jī)制共同發(fā)揮作用,達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的效應(yīng)?？傊?本研究結(jié)果提示,RES對(duì)骨肉瘤細(xì)胞具有生長(zhǎng)抑制和免疫調(diào)節(jié)作用,值得繼續(xù)深入研究探索。