秦少強(qiáng) 梁惠清 王曉元 張占帥 李會賢 張鵬祥 王 蕊 李方江河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科張家口075000

急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是最常見、最嚴(yán)重的心臟病,是導(dǎo)致心血管疾病死亡的主要原因。心肌缺血再灌注(ischemiareperfusion,I/R)損傷是AMI后冠狀動脈恢復(fù)血液供應(yīng)加重心肌損傷的重要病理過程[1]。氧化應(yīng)激在I/R損傷的發(fā)病機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用[2]。此外,在I/R損傷后心肌細(xì)胞凋亡明顯增加[3]。因此,如何有效降低氧化應(yīng)激和凋亡水平對減少I/R后的心肌損傷具有重要意義。miRNA是一類通過與靶mRNA的3′端非翻譯區(qū)結(jié)合調(diào)控靶基因表達(dá)的短鏈非編碼RNA,其表達(dá)異常與人類的多種心血管疾病有關(guān),包括心肌損傷[4]。最近研究顯示,I/R大鼠模型和缺氧誘導(dǎo)的乳鼠原代心肌細(xì)胞中miR-202-5p表達(dá)下調(diào),過表達(dá)miR-202-5p可減少心肌梗死面積,緩解心肌酶失調(diào),對大鼠心肌缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用[5]。SOX6基因是Y染色體的性別決定基因相關(guān)高遷移率蛋白(SRY related HMG box gene,SOX)基因家族SOX D亞族成員,研究發(fā)現(xiàn)SOX6可調(diào)控晚期心臟分化過程中的心肌細(xì)胞增殖和凋亡[6]。此外,下調(diào)SOX6表達(dá)還可改善心梗后心肌功能[7]。生物信息學(xué)分析顯示,SOX6是miR-202-5p的潛在靶基因,但miR-202-5p能否靶向SOX6參與對I/R損傷后心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的調(diào)控尚未可知。因此,本研究構(gòu)建缺氧復(fù)氧模型模擬心肌細(xì)胞I/R損傷過程,初步探討miR-202-5p對缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的影響和機(jī)制,以期為預(yù)防I/R損傷提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠胚胎心肌細(xì)胞H9C2(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(美國Gibco公司)；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑和TRIzol試劑(美國Invitrogen公司)；細(xì)胞計(jì)數(shù)(cell counting kit-8,CCK-8)試劑盒(美國APExBIO公司)；熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)(美國Promega公司)；活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)檢測試劑盒、丙二醛(malondialdehyde,MDA)檢測試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathion peroxidase,GSH-Px)檢測試劑盒(北京索萊寶生物科技有限公司)；cDNA第一鏈合成試劑盒(武漢愛博泰克生物科技有限公司)；qPCR SYBR?Green Master Mix(上海翊圣生物科技有限公司)；膜聯(lián)蛋白V異硫氰酸熒光素(Annexin V fluorescein isothiocyanate,Annexin V-FITC)/碘化丙啶(propidium iodide,PI)試劑盒(美國Sigma公司)；miR-con、miR-202-5p mimics、anti-miR-con、anti-miR-202-5p、pcDNA、pcDNA-SOX6、WT-SOX6、MUT-SOX6的構(gòu)建和測序(上海吉瑪制藥有限公司)；RIPA裂解液(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)；兔源SOX6多克隆抗體、兔源Cyclin D1單克隆抗體、兔源Cleaved Caspase-3多克隆抗體以及辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗(美國Abcam公司)；紫外分光光度計(jì)(德國Eppendorf公司)。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型 采用高糖DMEM培養(yǎng)基(10%胎牛血清和1%青鏈霉素雙抗)培養(yǎng)H9C2心肌細(xì)胞,培養(yǎng)條件:37℃、5%CO2培養(yǎng)箱。取對數(shù)生長期心肌細(xì)胞,采用無糖DMEM培養(yǎng)基于37℃缺氧培養(yǎng)心肌細(xì)胞6 h,然后將心肌細(xì)胞用新鮮高糖DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)6 h,記為缺氧復(fù)氧組。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和實(shí)驗(yàn)分組 細(xì)胞轉(zhuǎn)染采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法利用LipofectamineTM2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染48 h時(shí)進(jìn)行缺氧復(fù)氧處理。將H9C2心肌細(xì)胞隨機(jī)分為以下幾組:空白組(正常培養(yǎng)的H9C2細(xì)胞)、缺氧復(fù)氧組(缺氧6 h,復(fù)氧6 h)、缺氧復(fù)氧+miR-con組(轉(zhuǎn)染miR-con后,缺氧復(fù)氧處理)、缺氧復(fù)氧+miR-202-5p組(轉(zhuǎn)染miR-202-5p mimics后,缺氧復(fù)氧處理)、缺氧復(fù)氧+miR-202-5p+pcDNA組(共轉(zhuǎn)染miR-202-5p mimics和pcDNA后,缺氧復(fù)氧處理)、缺氧復(fù)氧+miR-202-5p+pcDNA-SOX6組(共轉(zhuǎn)染miR-202-5p mimics和pcDNA-SOX6后,缺氧復(fù)氧處理)。

1.2.3 qRT-PCR檢測 利用TRIzol法提取各組H9C2細(xì)胞總RNA,采用紫外分光光度計(jì)測定RNA濃度,采用cDNA第一鏈合成試劑盒合成cDNA,按照qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒說明書配置反應(yīng)體系,利用ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測miR-202-5p和SOX6 mRNA的相對表達(dá)量。

1.2.4 熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 利用TargetScan預(yù)測miR-202-5p靶基因,發(fā)現(xiàn)miR-202-5p與SOX6存在部分特異性合位點(diǎn)。構(gòu)建含有SOX6 3′-UTR的野生型WT-SOX6和突變型MUT-SOX6熒光素酶報(bào)告基因載體,分別將WT-SOX6、MUT-SOX6與miR-202-5p mimics共轉(zhuǎn)染至H9C2心肌細(xì)胞,轉(zhuǎn)染48 h后,收集細(xì)胞并檢測各組細(xì)胞中熒光素酶活性。

1.2.5 CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞增殖 取對數(shù)期H9C2心肌細(xì)胞按照2×103個(gè)/孔細(xì)胞密度接種于96孔板,按照實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行相應(yīng)處理后,每個(gè)孔中加入10μl的CCK8溶液,培養(yǎng)箱孵育4 h,用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度值(A),計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率(%)=(A處理組/A對照組)×100%。

1.2.6 檢測ROS、MDA、GSH-Px水平 收集進(jìn)行相應(yīng)處理的各組H9C2心肌細(xì)胞,加入RIPA裂解液,冰上裂解30 min,4℃12 000 r/min離心15 min,收集上清液,按照試劑盒說明書檢測ROS、MDA、GSHPx水平。

1.2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 收集進(jìn)行相應(yīng)處理的各組H9C2心肌細(xì)胞,用預(yù)冷的PBS洗滌3次,離心后棄上清液。用1×binding buffer重懸細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/ml。取100μl的細(xì)胞懸液加入流式管內(nèi),分別加入5μl的Annexin VFITC和10μl的PI溶液,混勻后,避光孵育15 min,補(bǔ)加PBS至500μl后,流式細(xì)胞儀檢測心肌細(xì)胞凋亡情況。

1.2.8 Western blot檢測 收集進(jìn)行相應(yīng)處理的各組H9C2心肌細(xì)胞,加入RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白,BCA試劑盒檢測蛋白濃度,取30μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離細(xì)胞蛋白,經(jīng)濕法轉(zhuǎn)膜、封閉后,加入各蛋白已稀釋的Ⅰ抗,洗膜后,分別加入稀釋的Ⅱ抗,ECL顯影后,放入自動凝膠成像系統(tǒng)拍照,Image J軟件分析各蛋白條帶灰度值。

1.3 數(shù)據(jù)處理 用SPSS18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,所有數(shù)據(jù)均用表示,采用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較,采用單因素方差分析進(jìn)行多組間比較,以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 缺氧復(fù)氧處理對心肌細(xì)胞miR-202-5p和SOX6表達(dá)的影響 與空白組相比,缺氧復(fù)氧組心肌細(xì)胞miR-202-5p的表達(dá)水平顯著降低,SOX6 mRNA和SOX6蛋白的表達(dá)水平顯著升高(P＜0.05),見圖1。

圖1 缺氧復(fù)氧處理心肌細(xì)胞影響miR-202-5p和SOX6表達(dá)Fig.1 Hypoxia-reoxygenation treatment affects miR-202-5p and SOX6 expression in cardiomyocytes

2.2 上調(diào)miR-202-5p表達(dá)促進(jìn)缺氧復(fù)氧處理心肌細(xì)胞增殖 與空白組相比,缺氧復(fù)氧組心肌細(xì)胞miR-202-5p的表達(dá)水平顯著降低,Cyclin D1的表達(dá)水平顯著降低,細(xì)胞存活率顯著降低；與缺氧復(fù)氧+miR-con組比較,缺氧復(fù)氧+miR-202-5p組心肌細(xì)胞miR-202-5p的表達(dá)水平顯著升高,Cyclin D1的表達(dá)水平顯著升高,細(xì)胞存活率顯著升高(P＜0.05),見圖2。

2.3 上調(diào)miR-202-5p表達(dá)抑制缺氧復(fù)氧處理心肌細(xì)胞凋亡 與空白組相比,缺氧復(fù)氧組心肌細(xì)胞Cleaved Caspase-3蛋白的表達(dá)水平顯著升高,細(xì)胞凋亡率顯著增加；與缺氧復(fù)氧+miR-con組比較,缺氧復(fù)氧+miR-202-5p組心肌細(xì)胞Cleaved Caspase-3蛋白的表達(dá)水平顯著降低,細(xì)胞凋亡率顯著降低(P＜0.05),見圖3。

2.4 上調(diào)miR-202-5p表達(dá)抑制缺氧復(fù)氧處理心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激 與空白組相比,缺氧復(fù)氧組心肌細(xì)胞ROS水平顯著升高,MDA的含量顯著升高,GSHPx的含量顯著降低；與缺氧復(fù)氧+miR-con組比較,缺氧復(fù)氧+miR-202-5p組心肌細(xì)胞ROS水平顯著降低,MDA的含量顯著降低,GSH-Px的含量顯著升高(P＜0.05),見圖4。

圖2 上調(diào)miR-202-5p促進(jìn)缺氧復(fù)氧處理心肌細(xì)胞存活率和Cyclin D1蛋白表達(dá)Fig.2 Up-regulation of miR-202-5p promotes the survival rate and Cyclin D1 protein expression of cardiomyocytes treated with hypoxia and reoxygenation

2.5 miR-202-5p靶向調(diào)控SOX6的表達(dá) 生物信息學(xué)軟件在線預(yù)測顯示,miR-202-5p和SOX6存在部分連續(xù)互補(bǔ)的核苷酸序列,見圖5A。與miR-con和WT-SOX6共轉(zhuǎn)染組比較,miR-202-5p和WT-SOX6共轉(zhuǎn)染組心肌細(xì)胞的熒光素酶活性顯著降低(P＜0.05)；與miR-con和MUT-SOX6共轉(zhuǎn)染組比較,miR-202-5p和MUT-SOX6共轉(zhuǎn)染組心肌細(xì)胞的熒光素酶活性無顯著變化,見圖5B。與miR-con組比較,miR-202-5p組心肌細(xì)胞SOX6蛋白表達(dá)水平顯著降低；與anti-miR-con組比較,anti-miR-202-5p組心肌細(xì)胞SOX6蛋白表達(dá)水平顯著升高(P＜0.05),見圖5C。

圖3 上調(diào)miR-202-5p抑制心肌細(xì)胞中Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)和心肌細(xì)胞凋亡Fig.3 Up-regulation of miR-202-5p inhibits Cleaved Caspase-3 protein expression and cardiomyocyte apoptosis in cardiomyocytes

圖4 上調(diào)miR-202-5p對缺氧復(fù)氧處理心肌細(xì)胞ROS水平、GSH-Px和MDA的含量的影響Fig.4 Up-regulation of miR-202-5p on ROS level，GSHPx and MDA content in myocardial cells treated with hypoxia and reoxygenation

圖5 miR-202-5p靶向調(diào)控SOX6表達(dá)Fig.5 miR-202-5p targets and regulates SOX6 expression

圖6 上調(diào)SOX6部分逆轉(zhuǎn)miR-202-5p對缺氧復(fù)氧處理心肌細(xì)胞的保護(hù)作用Fig.6 Up-regulation of SOX6 partially reverses protective effect of miR-202-5p on myocardial cells treated with hypoxia and reoxygenation

2.6 上調(diào)SOX6部分逆轉(zhuǎn)miR-202-5p對缺氧復(fù)氧處理心肌細(xì)胞的保護(hù)作用 與缺氧復(fù)氧+miR-202-5p+pcDNA組比較,缺氧復(fù)氧+miR-202-5p+pcDNASOX6組心肌細(xì)胞SOX6和Cleaved Caspase-3蛋白的表達(dá)水平顯著升高,Cyclin D1蛋白的表達(dá)水平顯著降低,ROS水平顯著升高,MDA含量顯著增加,GSH-Px的含量顯著降低,細(xì)胞存活率顯著降低,凋亡率顯著增加(P＜0.05),見圖6。

3 討論

經(jīng)皮冠狀動脈介入治療能在最短時(shí)間內(nèi)重新打開閉塞的冠狀動脈,顯著降低急性心肌梗死的死亡率,是AMI最重要的治療手段[8]。然而,AMI再灌注治療后引起的I/R問題也變得越來越突出。心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡在I/R損傷中起著至關(guān)重要作用。本研究以大鼠心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型模擬心肌I/R損傷,探索與心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡有關(guān)的基因,以期為治療心肌I/R損傷提供理論依據(jù)。

miR-202-5p在I/R大鼠模型模型和缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的乳鼠原代心肌細(xì)胞中表達(dá)水平顯著降低,上調(diào)miR-202-5p可降低血清中心肌酶濃度,降低心肌細(xì)胞ROS水平,減少減輕心肌細(xì)胞鈣超載,減少心肌梗死面積,減輕大鼠I/R損傷[5]。miR-202-5p在氨誘導(dǎo)的雞心肌細(xì)胞損傷中表達(dá)下調(diào),并通過調(diào)控PTEN/AKT/mTOR途徑影響心臟氧化應(yīng)激和自噬[9]。本研究表明在缺氧復(fù)氧條件下,心肌細(xì)胞的存活率顯著降低,細(xì)胞凋亡率顯著增加,miR-202-5p的表達(dá)水平顯著降低,上調(diào)miR-202-5p表達(dá)可顯著促進(jìn)心肌細(xì)胞存活,抑制心肌細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)缺氧復(fù)氧條件下心肌細(xì)胞上清液中ROS和MDA的水平顯著升高,而GSH-Px水平顯著降低。氧化應(yīng)激是ROS生成與抗氧化系統(tǒng)清除ROS能力之間的平衡失調(diào)引起的機(jī)體一系列適應(yīng)性反應(yīng),過量的ROS可引起細(xì)胞不可逆損傷,導(dǎo)致MDA的積累,MDA含量是反應(yīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷程度的重要指標(biāo)[10]。GSH-Px是機(jī)體重要的抗氧化酶,GSH-PX可有效清除自由基,減輕ROS對機(jī)體的進(jìn)一步損傷[11]。本研究結(jié)果顯示上調(diào)miR-202-5p可顯著降低心肌細(xì)胞ROS和MDA的水平,升高GSH-Px水平。提示上調(diào)miR-202-5p可減輕缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡。此外,本研究結(jié)果顯示缺氧復(fù)氧條件下心肌細(xì)胞中Cyclin D1的表達(dá)水平顯著降低,Cleaved Caspase-3蛋白的表達(dá)水平顯著升高,而上調(diào)miR-202-5p表達(dá)后Cyclin D1表達(dá)水平升高,Cleaved Caspase-3蛋白的表達(dá)水平降低,與功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。提示上調(diào)miR-202-5p可通過減輕缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡發(fā)揮保護(hù)作用。

SOX基因家族是一種轉(zhuǎn)錄因子編碼基因,具有高度保守的HMG盒序列。SOX基因家族可分為10個(gè)亞族(A-J),SOX6是SOX D亞組的重要成員[12]。SOX6最初是從成年小鼠睪丸cDNA文庫中分離出來,在心肌細(xì)胞發(fā)育和心臟分化過程中發(fā)揮著重要作用[13-14]。在心肌細(xì)胞P19CL6分化晚期,SOX6可促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡,miR-19b通過靶向干擾SOX6基因表達(dá),促進(jìn)P19CL6細(xì)胞的增殖抑制細(xì)胞凋亡[6,15]。脂多糖刺激可促進(jìn)心肌細(xì)胞中SOX6表達(dá),miR-499通過調(diào)控SOX6表達(dá)激活Bcl-2通路促進(jìn)脂多糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡[16]。miR-499-5p通過抑制SOX6表達(dá)還可減輕缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷[17]。本研究結(jié)果顯示,在缺氧復(fù)氧條件下心肌細(xì)胞中SOX6的表達(dá)水平顯著降低,與SHI等[17]研究發(fā)現(xiàn)一致。同時(shí)本研究通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)SOX6是miR-202-5p的靶基因,且Western blot顯示miR-202-5p可負(fù)性調(diào)控SOX6的表達(dá)。此外,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)SOX6可部分逆轉(zhuǎn)miR-202-5p對心肌細(xì)胞增殖、凋亡和氧化應(yīng)激水平的影響。提示過表達(dá)miR-202-5p通過靶向下調(diào)SOX6對缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡發(fā)揮保護(hù)作用。

綜上所述,缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中miR-202-5p表達(dá)下調(diào),SOX6表達(dá)上調(diào)。上調(diào)miR-202-5p通過靶向SOX6抑制心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激水平和缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)為心肌I/R損傷治療提供了新的思路。