胡西洲，洪 偉，張 仙，彭茂民，夏 虹，彭西甜*

(1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所/農(nóng)產(chǎn)品營養(yǎng)品質(zhì)與安全湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430064；2.長江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

二苯甲酮類化合物如4-羥基苯甲酮(HB)、2，4-二羥基苯甲酮(DB)、苯甲酮(BP)和2-羥基-4-甲氧基苯甲酮(HMB)是一類紫外屏蔽劑。該類物質(zhì)已批準(zhǔn)用于防曬產(chǎn)品配方中，還可用于塑料、涂料等工業(yè)產(chǎn)品的生產(chǎn)。然而，國際癌癥研究機構(gòu)數(shù)據(jù)表明，HMB在防止紫外線輻射時會引起動物模型的DNA損傷，同時在某些條件下也會引起光毒性，已被列為低優(yōu)先使用等級[1]。由于該類物質(zhì)在日常生活和工業(yè)生產(chǎn)中使用廣泛，易對環(huán)境水樣產(chǎn)生污染，給水生生物和人類健康帶來嚴(yán)重威脅。因此，建立快速、高效、靈敏的環(huán)境水樣中二苯甲酮類紫外屏蔽劑的分析方法具有重要意義。目前，該類物質(zhì)的檢測方法有液相色譜法[2-4]、氣相色譜-質(zhì)譜法[5-6]、液相色譜-質(zhì)譜法[7-9]，其中質(zhì)譜法成本高，而液相色譜法具有操作簡單、成本低、易普及等特點。

近年來，樣品制備技術(shù)正朝著高效、快速、環(huán)保、經(jīng)濟、微型化的方向發(fā)展。傳統(tǒng)樣品制備技術(shù)存在有機溶劑用量大、步驟繁瑣、耗時費力等缺點，微萃取技術(shù)是順應(yīng)時代要求而發(fā)展起來的快速萃取技術(shù)，備受廣大分析工作者的青睞[10]。2006年，Berijani等[11]提出了分散液液微萃取技術(shù)(Dispersive liquid-liquid microextraction,DLLME)。該技術(shù)在三相溶劑體系中，基于分散劑的作用(與萃取劑和水溶液均互溶)將不溶于水的微量萃取劑快速分散在溶液中，從而實現(xiàn)高效、快速萃取，現(xiàn)已廣泛用于生物以及醫(yī)藥分析等領(lǐng)域。然而，傳統(tǒng)的DLLME中萃取劑的用量少，回收較為困難。為提高微量萃取劑收集的便利性，凝固-漂浮分散液液微萃取(SFO-DLLME)應(yīng)運而生，其主要利用萃取溶劑的凝固點較高且密度小于水的特點，經(jīng)萃取后無需離心步驟，萃取劑在低溫下迅速凝固，非常容易進(jìn)行轉(zhuǎn)移，常用的萃取劑有十二醇、十一醇、壬酸、辛酸等[12-14]。Shih等[15]以脂肪酸為萃取劑，通過調(diào)節(jié)溶液的pH值改變飽和中鏈脂肪酸的存在形式，高pH值時萃取劑以陰離子形式分散于溶液中完成萃取，低pH值時可利用中性脂肪酸具有強疏水性實現(xiàn)油水分離，從而對環(huán)境水樣中的壬基酚和4-叔辛基酚進(jìn)行快速萃取，整個萃取過程無需有機試劑。付博等[16]也利用該技術(shù)實現(xiàn)對酒類中4-乙基愈創(chuàng)木酚、4-乙基苯酚的快速萃取，整個過程非?？焖?、環(huán)保。

本研究以飽和中鏈脂肪酸(辛酸)為萃取劑，結(jié)合SFO-DLLME和高效液相色譜，建立了水樣中上述4種紫外屏蔽劑的分析方法。在單因素條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)曲面優(yōu)化法，獲取最優(yōu)的萃取效率。本方法簡便快速，以辛酸為萃取劑，僅通過調(diào)節(jié)溶液pH值完成萃取過程，無需有機試劑和離心步驟，方法綠色環(huán)保，靈敏度和準(zhǔn)確度高，具有良好的實用性。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

辛酸(98%)、氨水(25%～28%)、濃硫酸(98%)(國藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司)；甲醇、乙腈(色譜純，Sigma-Aldrich上海公司)；4-羥基苯甲酮、2，4-二羥基苯甲酮、苯甲酮、2-羥基-4-甲氧基苯甲酮(99%，阿法埃莎(天津)化學(xué)有限公司)。實驗用水由Millipore凈水器(貝德福德，美國)制備。

E2695高效液相色譜儀，配 2998型二極管陣列檢測器和自動進(jìn)樣器(美國Waters 公司)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱取上述4種紫外屏蔽劑標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各25 mg，用甲醇溶解并稀釋定容至25 mL容量瓶中，制成1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。使用時以水稀釋至所需質(zhì)量濃度。所有溶液均保存于4 ℃冰箱中。

1.3 SFO-DLLME過程

取10 mL水樣置于15 mL離心管中，加入3 g氯化鈉和100 μL辛酸，渦旋形成乳濁液。隨后向水樣中加入100 μL氨水，渦旋萃取1 min，樣品溶液立即變澄清。再加入1.2 mL濃硫酸，溶液恢復(fù)至乳濁液，振搖30 s后置于-20 ℃冰箱中，10 min后取出已固化的上層萃取劑，在室溫下放置，待其融化后取出與等體積乙腈混合，進(jìn)行HPLC分析。

1.4 色譜條件

色譜柱：Shim-pack VP-ODS柱(150 mm×4.6 mm×5 μm)；流動相：1%乙酸水溶液-乙腈(40∶60，體積比)，等度洗脫；流速為0.8 mL/min；進(jìn)樣體積為10 μL；柱溫為40 ℃；檢測波長為254 nm。

1.5 計算公式

富集倍數(shù)(PF)是指經(jīng)萃取后4種紫外屏蔽劑的最終濃度與萃取前樣品溶液中濃度的比值。計算公式如下：PF=Corg/Caq，其中Corg是指經(jīng)校正曲線直接得到4種紫外屏蔽劑的濃度；Caq是指萃取前樣品中4種紫外屏蔽劑的初始濃度。

萃取回收率(ER%)由以下公式得到：ER%=PF×Vorg×100/Vaq，其中Vorg和Vaq分別為萃取前后樣品溶液的體積。

2 結(jié)果與討論

2.1 SFO-DLLME條件的優(yōu)化

SFO-DLLME的萃取溶劑需有合適的熔點和密度，滿足凝固漂浮的要求，且便于萃取溶劑的回收。本研究對影響SFO-DLLME萃取效率的因素(萃取劑種類、萃取劑體積、氨水和濃硫酸的用量、離子強度及水樣體積)分別進(jìn)行考察，每組實驗重復(fù)3次。

2.1.1 萃取劑種類的選擇脂肪酸包含疏水性烷基和可電離的羧基，脂肪烷基的碳原子數(shù)決定了萃取劑的疏水性。當(dāng)溶液的pH值高于其pKa時，脂肪酸電離成具有兩親性的脂肪酸鹽；而當(dāng)溶液的pH值低于其pKa時，化合物電離被抑制而增強其疏水性，導(dǎo)致油水相分離。因此，在高pH值時，脂肪酸相當(dāng)于分散劑，與分析物形成油包水的膠束完成對分析物的萃??；而低pH值時，萃取劑的疏水性增強從而實現(xiàn)萃取。此外，熔點和密度對于萃取劑的回收非常重要。因此，本研究考察了凝固點較高且密度小于水的中鏈飽和脂肪酸壬酸(熔點9 ℃)和辛酸(熔點16 ℃)對4種紫外屏蔽劑的萃取性能，同時以常見的SFO-DLLME萃取試劑十二醇(熔點22～26 ℃)作為對照。

如圖1A所示，辛酸的萃取性能高于十二醇，而壬酸的萃取性能與十二醇相當(dāng)。此外，十二醇不受溶液pH值的影響，在溶液中不易分散，需要數(shù)十倍的渦旋(萃取)時間才獲得較好的萃取效果。因此，選擇辛酸作為萃取劑。

2.1.2 萃取劑體積的選擇吸取10 mL水溶液置于15 mL離心管中，分別加入60、80、100、120、140 μL的辛酸，考察了萃取劑體積對萃取性能的影響。如圖1B所示，萃取效率隨著萃取劑體積的增加先增加而后逐漸減小，當(dāng)萃取劑體積為100 μL時，萃取效率達(dá)到最高。這可能是由于隨著萃取劑體積的增加，分析物與萃取劑接觸的量增多，增加了分析物的萃取效率，而過多的萃取劑會導(dǎo)致稀釋效應(yīng)。所以選擇萃取劑體積為100 μL。

2.1.3 氨水及濃硫酸體積的選擇由于樣品溶液的pH值會影響脂肪酸在溶液中的存在形態(tài)，通過加入氨水促使脂肪酸離子化?？疾炝税彼w積(70、90、110、130、150 μL)對萃取性能的影響，結(jié)果顯示當(dāng)氨水體積為90 μL時，萃取效率達(dá)到最大；繼續(xù)增加氨水用量則會造成萃取效率降低。一方面，過高的pH會使部分分析物發(fā)生電離導(dǎo)致萃取效率降低；另一方面可能是因為加入過量的氨水，需要更多的酸來中和，而后續(xù)操作中濃硫酸的體積保持不變，會造成部分辛酸仍以離子形式保留于水溶液中而不利于萃取。所以選擇氨水體積為90 μL。

辛酸的pKa值為4.9，為將陰離子形式轉(zhuǎn)變?yōu)槠浞肿訝顟B(tài)，所加酸的量至少要將溶液的pH值降低至比辛酸的pKa值小3[15-16]。相比于鹽酸和硝酸，濃硫酸屬于不揮發(fā)性二元酸，對環(huán)境污染小且用量小，所以選擇濃硫酸為反應(yīng)試劑?？疾炝瞬煌w積(0.4 ～1.4 mL)濃硫酸對萃取效率的影響，結(jié)果表明當(dāng)濃硫酸的體積為1.2 mL時，4種紫外屏蔽劑的萃取效率達(dá)到最高，繼續(xù)增加濃硫酸用量，回收率略有下降?？赡苁怯捎陔S著濃硫酸用量的增加，辛酸逐漸恢復(fù)至中性狀態(tài)，可收集萃取劑體積的增加引起稀釋效應(yīng)所致。因此，選擇濃硫酸體積為1.2 mL。

2.1.4 離子強度的影響在樣品萃取過程中，通常在溶液中加入無機鹽以增加離子強度，降低分析物在樣品溶液中的溶解度，提高萃取效率?？疾炝寺然c加入量(0～4 g)對萃取效率的影響。如圖1C所示，4種紫外屏蔽劑的萃取效率隨著鹽濃度的增加而增大，當(dāng)氯化鈉加入量為3 g時萃取效率達(dá)到最高，而氯化鈉加入量大于3 g時會導(dǎo)致萃取效率降低。原因可能是鹽析效應(yīng)可促進(jìn)萃取效率的提高，而過高的鹽濃度導(dǎo)致溶液粘度變大，阻礙分析物的傳質(zhì)。因此，萃取前在溶液中添加3 g氯化鈉。

2.1.5 樣品溶液體積的選擇在一定范圍內(nèi)，增加樣品溶液的體積可以提高富集倍數(shù)。分別取7、9、10、11、13 mL添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的水樣，置于15 mL離心管中，考察了樣品溶液體積對萃取性能的影響。結(jié)果如圖1D所示，萃取量隨樣品溶液體積的增加而增加，萃取回收率反而降低。綜合考慮，選擇樣品溶液體積為10 mL。

2.2 響應(yīng)曲面實驗結(jié)果分析

表1 Box-Behnken實驗設(shè)計和響應(yīng)結(jié)果Table 1 Experimental design and response result of Box-Behnken

2.2.1 回歸模型的建立與分析在上述單因素實驗的基礎(chǔ)上，選擇萃取劑體積(60、100、140 μL)、氨水體積(60、90、120 μL)、濃硫酸體積(1.0、1.2、1.4 mL)3個對峰面積有顯著影響的因素，設(shè)計了3因素3水平的響應(yīng)曲面分析實驗，以獲得最佳萃取效率。Box-Behnken實驗設(shè)計和響應(yīng)結(jié)果見表1。

通過Minitab 17(Pennsylvania,USA)軟件對表1的響應(yīng)曲面實驗結(jié)果進(jìn)行分析，得到實驗條件與響應(yīng)值間的回歸模型：

Y=4.63×105+2.46×104X1+6.96×104X2+2.32×104X3-5.5×104X1X1-5.25×104X2X2-6.88×104X3X3-5.5×103X1X2-1.125×104X1X3-8.25×103X2X3

式中：Y為待測物的總峰面積；X1為萃取劑體積(μL)；X2為氨水體積(μL)；X3為濃硫酸體積(mL)。

對回歸模型進(jìn)行方差分析(見表2)，得到的回歸模型極顯著(P<0.01)，失擬項不顯著(P=0.289>0.05)，說明所建模型可靠。相關(guān)系數(shù)(R2)為0.981 2，說明該模型擬合程度較好，預(yù)測值與實測值之間有較好的相關(guān)性。

由表2方差分析結(jié)果可知，X2極顯著(P<0.01)，X1、X3均顯著(P<0.05)，X1X2、X1X3、X2X3均不顯著(P>0.05)，X1X1、X2X2、X3X3均極顯著(P<0.01)。表明各因素與響應(yīng)值之間不是簡單的線性關(guān)系。

表2 方差分析結(jié)果Table 2 Result of variance analysis

**：extremely significant(P<0.01);*：significant(P<0.05);-：not obvious(P>0.05)

2.2.2 響應(yīng)曲面交互作用分析根據(jù)上述回歸方程繪制響應(yīng)曲面圖(圖略)，結(jié)果顯示總峰面積隨3個因素的變化均為開口向下的拋物線，即4種紫外屏蔽劑的總峰面積最初隨3個因素的增大而逐漸升高，在超過各因素的中心值后，4種紫外屏蔽劑的總峰面積隨各因素的增大而下降。

2.2.3 最佳工藝條件的確定以及驗證實驗由響應(yīng)曲面圖獲得最佳提取條件：萃取劑體積為102.28 μL，氨水體積為98.76 μL，濃硫酸體積為1.21 mL，此條件下4種紫外屏蔽劑的總峰面積為489 618?？紤]到操作便利性和萃取效率，確定萃取劑體積為100 μL，氨水體積為100 μL，濃硫酸體積為1.2 mL。在該條件下得到的總峰面積約為478 787，與理論值接近，說明本研究優(yōu)化得到的萃取條件可靠。

2.3 方法學(xué)評價

配制質(zhì)量濃度分別為0.01、0.05、0.2、0.5、2.0、5.0、10.0 mg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在優(yōu)化條件下進(jìn)行測定，以4種紫外屏蔽劑的峰面積(y)對其質(zhì)量濃度(x，mg/L)進(jìn)行線性擬合。結(jié)果表明，4種紫外屏蔽劑在0.01～10.0 mg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r)為0.994 6～0.999 6。HB、DB、BP和HMB的方法檢出限(S/N=3)分別為0.18、0.37、0.46、0.76 μg/L，富集倍數(shù)分別為42、49、46和47倍。

配制0.1 mg/L的4種分析物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，同日內(nèi)測定6次，連續(xù)測定3 d，以日內(nèi)和日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)評估方法精密度；在空白水樣中加入0.05、0.5、5 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行回收率實驗，每組設(shè)置3個平行。如表3所示，日內(nèi)與日間RSD為1.9%～9.6%，加標(biāo)回收率為73.8%～103%，表明方法具有很好的準(zhǔn)確度和精密度。

表3 4種紫外屏蔽劑的回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 3 Recoveries and relative standard deviations of four ultraviolet filters

2.4 方法比較

將本方法與文獻(xiàn)方法進(jìn)行了比較，結(jié)果如表4所示。本方法檢出限低于文獻(xiàn)[8]，與其他方法相當(dāng)。該法與纖維相吸附萃取法(FPSE)[3]、固相微萃取法(SPME)[5]相比操作簡便、快捷；與以離子液體[2]作為萃取劑的方法相比，本文所用萃取劑的價格低且綠色環(huán)保；樣品制備過程中有機溶劑用量極少(100 μL)，且省去離心步驟，具有良好的操作性和實用性。

表4 與其他萃取方法的比較Table 4 Comparison with other extraction procedures

圖2 實際廢水樣品的色譜圖Fig.2 Chromatograms of ultraviolet filters in waste water sample a,b and c represent waste water sample before extraction,after extraction and spiked samples after extraction,respectively

2.5 實際樣品分析

為進(jìn)一步驗證方法的適用性，在武漢周邊地區(qū)采集3種水樣，包括生活廢水、涂料廠廢水與湖水，采用本方法進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，在涂料廠廢水中檢出DB和HMB的質(zhì)量濃度分別為0.82、0.36 mg/L，另兩種樣品中均未檢出4種分析物。在3種水樣中添加0.1 mg/L的紫外屏蔽劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，結(jié)果表明，4種紫外屏蔽劑的回收率為76.8%～102%，RSD為3.8%～8.7%，表明該方法適用于水樣中4種紫外屏蔽劑的定量分析。涂料廠廢水萃取前、后及加標(biāo)的色譜圖見圖2。

3 結(jié) 論

本研究建立了一種基于飽和中鏈脂肪酸的凝固-漂浮分散液液微萃取方法，并用于水樣中4種紫外屏蔽劑的高效液相色譜測定。通過調(diào)整溶液的pH值改變脂肪酸的存在形式，進(jìn)而實現(xiàn)高效、快速萃取。整個萃取過程只需使用氨水和濃硫酸，符合綠色化學(xué)發(fā)展的要求；萃取時間短，無需離心。該方法線性關(guān)系良好，具有良好的精密度和準(zhǔn)確度，可作為水樣中有機物萃取制備傳統(tǒng)技術(shù)的重要補充方法。