包昆鷺，許 琪，曹宏梅，劉 星，陳 奇*

(1.海南大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，海南 海口 570228；2.海南省食品營養(yǎng)與功能食品重點實驗室， 海南 海口 570228)

共振能量轉(zhuǎn)移(Resonance energy transfer，RET)是一種發(fā)生在供體-受體之間的非輻射能量轉(zhuǎn)移過程，該過程的發(fā)生需要滿足以下特定條件：第一，供體-受體間的距離必須足夠小，研究表明，10 nm以內(nèi)才能有效地發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，且距離是影響RET效率的最主要因素(效率和供體-受體間距離的六次方成反比)；第二，供體的發(fā)射光譜和受體的吸收光譜必須有效重疊，其重疊程度對能量轉(zhuǎn)移效率有較大影響；第三，供體-受體偶極間要有一定取向，其相對位置也會影響能量轉(zhuǎn)移效率[1]。共振能量轉(zhuǎn)移類型按發(fā)光方式可以分為以下3種：熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET)、生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移(Bioluminescence resonance energy transfer，BRET)和化學(xué)發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移(Chemiluminescence resonance energy transfer，CRET)。上述3種類型的共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)，近年來得到了廣泛關(guān)注，并被應(yīng)用于醫(yī)學(xué)診斷[2]、生命科學(xué)研究[3]、環(huán)境監(jiān)控[4]以及食品安全[5]等領(lǐng)域。

近年來，隨著食品行業(yè)的逐步發(fā)展，食品安全問題備受關(guān)注。食品中常見的危害因子主要包括非法添加劑、激素、致病菌、農(nóng)獸藥殘留、生物毒素、重金屬及有毒化合物等。現(xiàn)有檢測技術(shù)如色譜技術(shù)、光譜技術(shù)、免疫分析等已得到廣泛應(yīng)用。其中，基于儀器的色譜技術(shù)和光譜技術(shù)因準(zhǔn)確度高通常作為確證方法，免疫分析等技術(shù)操作簡單、成本低廉，通常作為篩查方法。為改善傳統(tǒng)分析方法存在的靈敏度低和耗時久等不足，越來越多的新技術(shù)被引入食品安全分析領(lǐng)域。其中基于RET的新型生物傳感分析技術(shù)，因具有靈敏度高、操作簡便及速度快等優(yōu)點而備受關(guān)注。本文依據(jù)能量供體的不同，對3種類型的RET在食品安全領(lǐng)域的研究進行綜述，同時展望了其應(yīng)用前景和發(fā)展趨勢。

1 FRET在食品安全檢測中的應(yīng)用

FRET又稱福斯特共振能量轉(zhuǎn)移，由F?rster在1948年提出，指受激發(fā)的供體與受體之間通過偶極-偶極相互作用以非輻射形式進行能量傳遞的過程[6]。FRET是一種均相光學(xué)檢測技術(shù)，具有操作簡便、靈敏度高、反應(yīng)速度快等優(yōu)點，近年來在生物毒素、非法添加劑、激素、致病菌、農(nóng)獸藥殘留、生物毒素、重金屬及有毒化合物等食品危害因子快速檢測中得到了廣泛應(yīng)用。

圖1 基于FRET檢測雞蛋中氟蟲腈殘留的工作原理圖[7]Fig.1 The principle diagram of detecting fipronil residue in eggs based on FRET[7]

1.1 有機熒光染料在FRET中的應(yīng)用

在早期FRET中，常使用有機熒光染料作為供體-受體對，有機熒光染料具有成本低、無毒性等優(yōu)點，典型的有Cy系列菁染料如Cy3和Cy5，以及羧基熒光素(FAM)等。Kim等[7]利用FRET技術(shù)檢測農(nóng)藥氟蟲腈殘留，其工作原理如圖1所示。在氟蟲腈適配子的3’端標(biāo)記上FAM，并在與適配子互補的cDNA的5’端標(biāo)記猝滅基團羧基四甲基羅丹明(TAMRA)。樣品中無氟蟲腈時，適配子與cDNA互補形成雙鏈，使得FAM與TAMRA距離足夠近，導(dǎo)致發(fā)生FRET，從而使FAM的熒光被TAMRA猝滅。而當(dāng)樣品中存在氟蟲腈時，適配子識別并結(jié)合氟蟲腈，雙鏈DNA解離,TAMRA遠(yuǎn)離FAM，被猝滅的FAM熒光恢復(fù)，且熒光強度隨氟蟲腈濃度的增加而增強，從而可實現(xiàn)對氟蟲腈的定量檢測。該方法操作簡單，無需洗滌，可在30 min內(nèi)完成檢測，對雞蛋樣品的線性范圍為25～300 ng/mL，最低檢測限為53.8 ng/mL。FAM是一種被廣泛使用的熒光染料，其猝滅基團也有很多選擇，如叔丁基對苯二酚1(BHQ1)[8]、金屬-有機骨架材料(Metal-organic frameworks，MOFs)[9]等。

早期的FRET中供體及受體多使用有機熒光染料，然而，傳統(tǒng)有機熒光染料存在光化學(xué)穩(wěn)定性差、光漂白及光降解現(xiàn)象嚴(yán)重、熒光壽命短、吸收光譜窄且易發(fā)生光譜重疊等缺陷[10]，因此正逐步被新型的熒光材料替代。

1.2 量子點在FRET中的應(yīng)用

半導(dǎo)體量子點(Quantum dot，QD)是一種由Ⅱ～Ⅵ族或Ⅲ～Ⅴ族元素組成的納米顆粒，與傳統(tǒng)有機熒光染料相比，QD的激發(fā)光譜寬，可被紫外到遠(yuǎn)紅外區(qū)的任意波長光激發(fā)，作為FRET供體時具有很大的可選擇性，可避免受體被直接激發(fā)。而當(dāng)QD作為FRET受體時，窄且對稱的發(fā)射光譜可減少與供體發(fā)射光譜的重疊，避免相互間的干擾。此外，QD還具有發(fā)光強度高、熒光量子產(chǎn)率較高、不易光漂白等獨特的光學(xué)特性[11]，比傳統(tǒng)熒光染料更適合用于構(gòu)建FRET體系。

圖2 用于檢測BoNT的QD-FRET生物 傳感器工作原理圖[12]Fig.2 The principle diagram of QD-FRET biosensor for detecting BoNT[12]

圖3 用于檢測OTA和OTB的基于納米抗體的 QD-FRET免疫檢測工作原理圖[14]Fig.3 The diagram of nanobody-based QD-FRET immunoassay for detecting OTA and OTB[14]

Wang等[12]開發(fā)了一種基于QD的FRET生物傳感器用于檢測肉毒桿菌神經(jīng)毒素(BoNT)，其工作原理如圖2所示。首先將含有酶切位點的多肽與熒光猝滅劑結(jié)合，并通過多聚組氨酸結(jié)合到QD表面實現(xiàn)FRET,QD發(fā)光減弱；BoNT存在時，多肽被毒素切割，猝滅劑與QD分離，F(xiàn)RET狀態(tài)關(guān)閉,QD熒光增強。該生物傳感器可在3 h內(nèi)實現(xiàn)對兩種不同類型BoNT(LcA和LcB)的檢測，檢測限分別為0.2 ng/mL及2 ng/mL。與Sapsford等[13]的研究相比，該研究通過使用熒光猝滅劑將靈敏度提高約兩個數(shù)量級。

本實驗室開發(fā)了基于納米抗體同時檢測赭曲霉毒素A(Ochratoxin A，OTA)和赭曲霉毒素B(Ochratoxin B，OTB)的FRET免疫分析方法[14]，其工作原理如圖3所示。該研究利用抗體中色氨酸殘基有固有熒光這一特點，將其作為供體，并以與抗原偶聯(lián)的量子點作為受體，在抗體識別抗原的過程中即可完成FRET。與完整抗體相比，納米抗體尺寸較小[15]，有助于縮短抗體中色氨酸殘基與抗原之間的距離，提高FRET效率，該方法對OTA和OTB的檢測限分別達0.06 ng/mL和0.12 ng/mL。

在FRET體系中，由于QD激發(fā)光譜寬，為避免對受體的直接激發(fā)，QD通常被用作供體，但同時利用兩種QDs作為供體-受體對的研究報道并不多見。Xu等[16]利用兩種不同尺寸的QDs成功構(gòu)建FRET體系，并探討了供體-受體偶聯(lián)物標(biāo)記比率對能量轉(zhuǎn)移效率的影響，最終用于大米中黃曲霉毒素B1(AFB1)的免疫檢測，其定量范圍為0.06～5.0 ng/mL，最低檢測限為0.04 ng/mL。檢測結(jié)果與商業(yè)化試劑盒具有良好的相關(guān)性，顯示出廣闊的應(yīng)用前景。

QDs優(yōu)越的性能使其作為熒光標(biāo)記物得到了快速發(fā)展，但依然存在一些需要解決的問題，如具有生物毒性、價格昂貴、與傳統(tǒng)有機熒光染料一樣需要高能量的外源激發(fā)光、組織穿透能力較低、易受生物組織自發(fā)熒光的干擾等。上述缺陷在一定程度上限制了基于QDs的FRET技術(shù)的應(yīng)用范圍。

1.3 貴金屬納米材料在FRET中的應(yīng)用

隨著納米科學(xué)的不斷發(fā)展，多種新型、性能更加優(yōu)越的貴金屬納米材料被深入地運用到檢測領(lǐng)域中。貴金屬納米顆粒的尺寸一般在100 nm以內(nèi)，顆粒表面的等離子使金屬表面產(chǎn)生電荷聚集，導(dǎo)致表面電荷密度增大，局域場增強，從而引發(fā)增強效應(yīng)。同時，貴金屬納米顆粒還有特殊的光學(xué)性質(zhì)如光致發(fā)光效應(yīng)和表面等離子共振等，已成為當(dāng)前的研究熱點[17-18]。銀納米顆粒(AgNPs)具有強消光性，其摩爾消光系數(shù)大于1010cm-1·M-1，是納米金顆粒(AuNPs)的100倍，同時還具有吸收光譜寬、穩(wěn)定性和生物相容性好等優(yōu)良性能，是一種理想的熒光猝滅劑，可在FRET體系中作為受體有效地猝滅被激發(fā)供體所發(fā)射的熒光[19]。Carneiro等[20]以碳量子點(CQDs)為供體，AgNPs為受體構(gòu)建了用于檢測食品中農(nóng)藥殘留的FRET生物傳感器，通過檢測大米、胡蘿卜、桔子和胡椒中不同的農(nóng)藥殘留(丙二醇、對硫磷、樂果、毒死蜱和嘧咪卡卜)證實了該生物傳感器的實用性。熒光金屬納米簇由幾個到幾百個原子組成，尺寸通常在2 nm之內(nèi)，特性則介于單個原子與較大的納米粒子之間[21-22]。Khan等[23]將適配體與銀納米簇結(jié)合作為能量供體，其熒光會被Mo2C受體猝滅，而在加入靶標(biāo)競爭時熒光恢復(fù)。這種動態(tài)定量檢測方法對T-2毒素的檢測范圍為0.005～500 ng/mL，檢測限為0.93 pg/mL，在方法學(xué)評價中展現(xiàn)出良好的實用性。

1.4 上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料在FRET中的應(yīng)用

除貴金屬納米材料外，上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料(UCNPs)也是當(dāng)前研究的熱點，其具有較低的聲子能量和較高的化學(xué)穩(wěn)定性，是目前公認(rèn)的發(fā)光效率最高的納米材料之一[24]。上轉(zhuǎn)換發(fā)光是反-斯托克斯發(fā)光，材料受到低能量的光激發(fā)后，發(fā)射出高能量的光。Wu等[25]使用紅色和綠色的UCNPs為供體，AuNPs為受體構(gòu)建了一種新型的雙FRET檢測系統(tǒng)，實現(xiàn)了海產(chǎn)品等樣品中Hg2+和Pb2+的同步檢測。該生物傳感器對Hg2+和Pb2+的檢測范圍分別為0.5～500 nmol/L和0.1～100 nmol/L，檢測限分別為150 pmol/L和50 pmol/L。上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料因形貌可控、尺寸可調(diào)、粒徑均一、有良好的化學(xué)穩(wěn)定性和光穩(wěn)定性而得到應(yīng)用，但增大發(fā)光強度及轉(zhuǎn)換效率仍將會是以后的研究重點。

2 BRET在食品安全檢測中的應(yīng)用

BRET是基于海洋生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一種自然現(xiàn)象，即以熒光生物體內(nèi)的熒光素酶作為供體，為實現(xiàn)供體-受體的能量非輻射轉(zhuǎn)移過程而開發(fā)的一種新型RET技術(shù)[26]。與FRET相比，BRET能量供體為可催化底物發(fā)射熒光的熒光素酶，因此無需外界光源激發(fā)，可避免外源光激發(fā)所引起的諸多副作用，如受體被外源光直接激發(fā)產(chǎn)生“假陽性”信號以及復(fù)雜樣品基質(zhì)的背景熒光及散射光干擾導(dǎo)致信噪比降低和靈敏度下降等問題[27]。因此，在一些需要低背景和高靈敏度的研究中，BRET顯示出巨大的優(yōu)勢，并日益受到研究者的關(guān)注。

目前BRET在分子成像[28]、醫(yī)學(xué)標(biāo)志物檢測[29]等方面已有較廣泛的應(yīng)用，但在食品安全檢測中的應(yīng)用還較為少見。Yu等[30]以海腎熒光素酶(Renilla luciferase，Rluc)為供體，量子點為受體，建立的QD-BRET體系實現(xiàn)了牛奶樣品中諾氟沙星(NOR)的定量檢測，方法的IC50為1 ng/mL，線性范圍為0.023～25.60 ng/mL，覆蓋4個數(shù)量級，顯示出優(yōu)越的性能。

3 CRET在食品安全檢測中的應(yīng)用

CRET是化學(xué)發(fā)光反應(yīng)產(chǎn)生的能量以非輻射的方式轉(zhuǎn)移給受體，不需要外源激發(fā)光[31]。目前常見的有魯米諾化學(xué)發(fā)光體系、吖啶酯化合物化學(xué)發(fā)光體系及二氧雜環(huán)丁烷類化學(xué)發(fā)光體系等，其中魯米諾化學(xué)發(fā)光體系應(yīng)用最為廣泛。Jo等[32]利用魯米諾發(fā)光體系構(gòu)建了用于檢測赭曲霉毒素A(OTA)的CRET生物傳感器，檢測范圍為0.1～100 ng/mL，最低檢測限為0.22 ng/mL，顯示出良好的應(yīng)用潛力。Ma等[33]建立了基于免疫競爭法的QDs-CRET生物傳感器用于檢測獸藥磺胺二甲嘧啶(SMZ)，檢測限為9 pg/mL，靈敏度比酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)和熒光偏振免疫分析法(FPIA)高出2～4個數(shù)量級，顯示出優(yōu)越的分析性能。

電化學(xué)發(fā)光(Electrochemiluminescence，ECL)具有高靈敏、反應(yīng)體系可控等優(yōu)點[34-35]，電化學(xué)發(fā)光生物傳感器則融合了ECL和生物傳感器的優(yōu)點，成為食品分析領(lǐng)域中強有力的分析手段[36-37]。Feng等[38]設(shè)計了一種基于雙齒輪轉(zhuǎn)換、電化學(xué)發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移(Electrochemiluminescence resonance energy transfer,ERET)和表面等離子體共振(Surface plasmon resonance,SPR)的多重選擇性測定卡那霉素和新霉素的雙齒輪電化學(xué)發(fā)光法。通過雙齒輪上供體-受體間的ERET過程，改變ECL強度，達到卡那霉素和新霉素檢測的目的。該傳感器對于卡那霉素(10-10～10-6mol/L)和新霉素(10-9～10-5mol/L)的檢測范圍較寬，檢測限分別達1.7×10-11mol/L和3.5×10-10mol/L。

隨著納米材料研究的進步，一些新型的納米材料也被用于構(gòu)建CRET體系。Sun等[39]構(gòu)建了基于MOFs的CRET生物傳感器用于飲用水中氟離子的檢測，檢測范圍為0.5～80.0 μmol/L，最低檢測限為0.05 μmol/L。雖然目前CRET在食品安全檢測中的應(yīng)用并不多見，但其靈敏多樣的檢測體系正在吸引大批學(xué)者的目光。

近年來RET在食品危害因子快速檢測中的相關(guān)應(yīng)用見表1。

表1 3種RET在食品安全檢測中的應(yīng)用Table 1 The application of three kinds of RETs in food safety detection

4 結(jié)論及展望

基于RET的生物傳感器作為一種均相光學(xué)檢測技術(shù)，具有操作簡便、靈敏度高、快速等優(yōu)點，其中FRET更是得到了廣泛應(yīng)用。為了減少FRET外源激發(fā)光帶來的干擾，也有學(xué)者合成了具有雙光子激發(fā)特性的熒光探針，并以其為能量供體構(gòu)建雙光子激發(fā)-FRET[55]。與FRET相比，BRET及CRET無需外界光源激發(fā)，可避免外源光激發(fā)所引起的諸多副作用，極大地減少背景干擾以及“假陽性”問題，在檢測領(lǐng)域顯示出巨大的優(yōu)勢，并日益受到研究者的關(guān)注。此外一些新型生物識別元件，包括核酸適配體及納米抗體等，由于具有尺寸小，能顯著提高RET能量轉(zhuǎn)移效率的特點，在構(gòu)建RET體系時顯示出巨大的優(yōu)勢。均相檢測方法具有快速、操作簡便且易于自動化等優(yōu)點，已經(jīng)成為檢測分析領(lǐng)域研究的熱點，其中基于RET的生物傳感器更是備受關(guān)注。但將其用于現(xiàn)場快檢時，檢測儀器的小型化、集成化及多功能化以及檢測結(jié)果的可視化、分析簡化也將是今后工作的研究重點。