陶 濤

（蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，安徽 蚌埠 233004）

肺癌的發(fā)生可受到多種因素的影響，其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)境污染、長(zhǎng)時(shí)間接觸致癌物等都是引發(fā)肺癌的重要原因[1]。近年來(lái)，人參皂苷Rg3 和蘇拉明被廣泛地應(yīng)用于肺癌的治療中。本次研究主要是分析聯(lián)用人參皂苷Rg3 和蘇拉明對(duì)Lewis 肺癌小鼠進(jìn)行治療對(duì)其移植瘤的抑制作用及相關(guān)基因表達(dá)的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本次研究的對(duì)象是40 只小鼠，包括4 只Lewis 肺癌荷瘤小鼠和36 只C57BL/6 雌性小鼠。這些小鼠的平均鼠齡為（4.1±0.5）周，平均的體質(zhì)量為（17.05±2.05）g。這些小鼠均購(gòu)自于醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所。

1.2 研究方法

本次實(shí)驗(yàn)使用的藥物是人參皂苷Rg3 和蘇拉明。人參皂苷Rg3 購(gòu)自于成都曼斯特生物公司，蘇拉明購(gòu)自于美國(guó)Sigma 公司。對(duì)研究對(duì)象中的4 只荷瘤小鼠進(jìn)行腫瘤接種。在接種后的2 周，提取移植瘤組織，嚴(yán)格遵循無(wú)菌操作的原則處死小鼠。剝離移植瘤，取1 g 的腫瘤組織作為標(biāo)本，放到4 mL 的生理鹽水勻漿器中進(jìn)行研磨，經(jīng)組織勻漿液過(guò)360 目鋼網(wǎng)得到單細(xì)胞懸液。取出腫瘤組織標(biāo)本，在顯微鏡下觀察腫瘤細(xì)胞的數(shù)量。在腫瘤組織標(biāo)本中加入適量的生理鹽水，以確保腫瘤細(xì)胞的密度達(dá)到2×106個(gè)/mL。取0.2 mL的懸液注射到C57BL/6 小鼠右側(cè)大腿的內(nèi)側(cè)，建立移植瘤小鼠模型。接種腫瘤的36 只C57BL/6 小鼠均成瘤。在腫瘤接種的第4 天，將36 只C57BL/6 小鼠分為對(duì)照組、人參皂苷Rg3 組、蘇拉明組、聯(lián)合組，每組各有9 只小鼠。在對(duì)照組小鼠的腹腔內(nèi)注射0.2 mL 的生理鹽水，在其胃內(nèi)灌注0.2 mL 的生理鹽水，1 次/d。在人參皂苷Rg3 組小鼠的胃內(nèi)灌注0.2 mL、含5 mg/kg 人參皂苷Rg3 的藥液，在其腹腔內(nèi)注射0.2 mL 的生理鹽水，1 次/d。在蘇拉明組小鼠的腹腔內(nèi)注射0.2 mL、含10 mg/kg 蘇拉明的藥液，在其胃內(nèi)灌注0.2 mL 的生理鹽水，1 次/d。在聯(lián)合組小鼠的腹腔內(nèi)灌注0.2 mL、含10 mg/kg 蘇拉明的藥液，在其胃內(nèi)灌注0.2 mL、含5 mg/kg 人參皂苷Rg3 的藥液，1 次/d。對(duì)四組小鼠均給藥15 d。

1.3 觀察指標(biāo)及抑制腫瘤效果的評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)

1）治療后，采用原位末端凋亡法（TUNEL）進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)，嚴(yán)格參照檢測(cè)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。將已知的陽(yáng)性切片作為參照。陽(yáng)性細(xì)胞（腫瘤細(xì)胞）的評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)是：在細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。選擇陽(yáng)性細(xì)胞分布密集的區(qū)域。統(tǒng)計(jì)每個(gè)切片中10 個(gè)高倍視野中陽(yáng)性細(xì)胞及正常細(xì)胞的總數(shù)。若腫瘤細(xì)胞凋亡，可判定抑制腫瘤有效。抑瘤率= 抑制腫瘤有效的小鼠數(shù)/ 小鼠的總數(shù)×100%。2）取出移植瘤后，對(duì)腫瘤進(jìn)行稱(chēng)重，記錄腫瘤的質(zhì)量。3）對(duì)四組小鼠的腫瘤組織切片進(jìn)行染色，選擇4 個(gè)視野，在高倍視野范圍內(nèi)統(tǒng)計(jì)染色腫瘤微血管的數(shù)量，取其均值作為切片中腫瘤微血管密度（MVD）值。4）采用RT-PCR 法測(cè)定四組小鼠腫瘤細(xì)胞中MEK1/2 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量，采用蛋白質(zhì)印跡法測(cè)定其腫瘤細(xì)胞中MEK1/2 蛋白的表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

對(duì)本次研究中的數(shù)據(jù)均采用SPSS21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料用±s表示，用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用%表示，采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四組小鼠移植瘤的質(zhì)量、抑瘤率、MVD 值的比較

人參皂苷Rg3 組小鼠、蘇拉明組小鼠、聯(lián)合組小鼠移植瘤的質(zhì)量均小于對(duì)照組小鼠，P＜0.05。人參皂苷Rg3組小鼠、蘇拉明組小鼠移植瘤的質(zhì)量均大于聯(lián)合組小鼠，P＜0.05。人參皂苷Rg3 組小鼠、蘇拉明組小鼠、聯(lián)合組小鼠的抑瘤率均高于對(duì)照組小鼠，P＜0.05。人參皂苷Rg3 組小鼠、蘇拉明組小鼠的抑瘤率均低于聯(lián)合組小鼠，P＜0.05。參皂苷Rg3 組小鼠、蘇拉明組小鼠、聯(lián)合組小鼠的MVD 值均小于對(duì)照組小鼠，P＜0.05。人參皂苷Rg3 組小鼠、蘇拉明組小鼠的MVD 值均大于聯(lián)合組小鼠，P＜0.05。詳見(jiàn)表1。其中，對(duì)照組小鼠和聯(lián)合組小鼠MVD 值的表達(dá)情況見(jiàn)圖A 和圖B。

2.2 四組小鼠腫瘤細(xì)胞中MEK1/2mRNA 的相對(duì)表達(dá)量及MEK1/2 蛋白表達(dá)量的比較

對(duì)照組小鼠腫瘤細(xì)胞中MEK1/2 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量高于人參皂苷Rg3 組小鼠、蘇拉明組小鼠、聯(lián)合組小鼠，P＜0.05。人參皂苷Rg3 組小鼠、蘇拉明組小鼠腫瘤細(xì)胞中MEK1/2 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量均高于聯(lián)合組小鼠，P＜0.05。對(duì)照組小鼠、人參皂苷Rg3 組小鼠、蘇拉明組小鼠、聯(lián)合組小鼠腫瘤細(xì)胞中MEK1/2 蛋白的表達(dá)量相比，P＞0.05。詳見(jiàn)表2。

表1 四組小鼠移植瘤的質(zhì)量、抑瘤率、MVD 值的比較（± s）

表1 四組小鼠移植瘤的質(zhì)量、抑瘤率、MVD 值的比較（± s）

注：* 表示與對(duì)照組小鼠相比，P ＜0.05；&表示與聯(lián)合組小鼠相比，P ＜0.05。

MVD 值（條/0.732 mm2）對(duì)照組 9 5.58±2.15& 0& 24.15±3.68&人參皂苷Rg3 組 9 3.61±1.08*& 35.26±5.08&* 13.24±2.18*&蘇拉明組 9 3.59±1.04*& 35.26±5.57&* 12.35±2.04*&聯(lián)合組 9 2.81±0.35* 49.68±5.47* 6.15±2.07*組別 例數(shù) 移植瘤的質(zhì)量（g）抑瘤率（%）

注：圖A 為對(duì)照組小鼠移植瘤的MVD 圖，圖B 為聯(lián)合組小鼠移植瘤的MVD 圖

表2 四組小鼠腫瘤細(xì)胞中MEK1/2 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量及MEK1/2 蛋白表達(dá)量的比較（%，± s）

表2 四組小鼠腫瘤細(xì)胞中MEK1/2 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量及MEK1/2 蛋白表達(dá)量的比較（%，± s）

對(duì)照組（n=9） 人參皂苷Rg3 組（n=9） 蘇拉明組小鼠（n=9） 聯(lián)合組（n=9）MEK1/2 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量 71.25±15.26 45.26±10.36 43.15±8.34 28.67±5.19 MEK1/2 蛋白的表達(dá)量 0.32±0.14 0.33±0.11 0.35±0.14 0.33±0.05

3 討論

肺癌患者腫瘤內(nèi)的血管較為豐富，生長(zhǎng)速度較快，導(dǎo)致多數(shù)晚期肺癌患者失去了進(jìn)行手術(shù)的最佳時(shí)機(jī)[2]。對(duì)于不同分型的肺癌患者，需要采用不同的靶向藥物進(jìn)行治療。腫瘤細(xì)胞易出現(xiàn)耐藥性，較易出現(xiàn)基因突變的情況。部分靶向藥物僅對(duì)某個(gè)基因突變的腫瘤細(xì)胞有效，且單一用藥的效果有限[3]。人參皂苷Rg3 是人參中的有效活性成分。對(duì)于心腦血管疾病、四肢乏力、腿腳不便、記憶力減退等中老年人常見(jiàn)疾病都有很好的治療效果。近年來(lái)，臨床上常用人參皂苷Rg3 對(duì)惡性腫瘤患者進(jìn)行治療，以抑制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。在不同分型的人參皂苷中，人參皂苷Rg3 的調(diào)節(jié)免疫和抗腫瘤作用最為顯著。蘇拉明屬于尿素衍生物，是近年來(lái)臨床應(yīng)用范圍較廣的一種抗腫瘤藥。聯(lián)用蘇拉明和人參皂苷Rg3 治療肺癌的效果有待臨床上的進(jìn)一步研究[4]。

研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴(lài)于新生血管的形成。MVD 與腫瘤的侵襲性有關(guān)，是預(yù)測(cè)癌細(xì)胞是否發(fā)生轉(zhuǎn)移及患者預(yù)后的可靠指標(biāo)[5]。本次研究的結(jié)果顯示，與對(duì)照組小鼠相比，聯(lián)合組小鼠的MVD 值更小。這說(shuō)明，將人參皂苷Rg3和蘇拉明聯(lián)合應(yīng)用，可發(fā)揮較為明顯的抑制移植瘤作用。

本次研究的結(jié)果證實(shí)，聯(lián)用人參皂苷Rg3 和蘇拉明對(duì)Lewis 肺癌小鼠進(jìn)行治療，可明顯抑制其移植瘤的生長(zhǎng)，并可降低其腫瘤細(xì)胞中MEK1/2 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。