劉志偉,李 欣,張慧超,孫艷瑞,安眾一

(煙臺(tái)大學(xué)土木工程學(xué)院,山東 煙臺(tái) 264005)

隨著全球能源需求的增加,石油勘探與開發(fā)加速發(fā)展,催生了以聚合物驅(qū)油為代表的第3代驅(qū)采油技術(shù)[1-2],但同時(shí)產(chǎn)生了大量含高分子聚丙烯酰胺(PAM)的廢水[3]。由于PAM加入水中可以提高溶液的黏度從而強(qiáng)化油田的采收率[4],因此被廣泛應(yīng)用于石油開采行業(yè)[5-7]。雖然PAM毒性較低不會(huì)對(duì)環(huán)境造成巨大污染[8-11],但PAM降解過程中會(huì)產(chǎn)生較多中間體,特別是具有累積性神經(jīng)毒性并被歸類為“可能對(duì)人類致癌的物質(zhì)”的丙烯酰胺單體(AM),若不能將其妥善處置,這類含聚廢水將直接威脅受納水體周邊。因此,如何將含聚廢水徹底無害化處理變得緊迫而重要[12]。

含聚廢水的高黏度和強(qiáng)乳化性是處理過程中需要面對(duì)的難題[13-14]。目前可用來處理含聚廢水的方法包括物理法、化學(xué)法[15-20]、生物法[21-23]以及耦合處理手段[24]。盡管物化處理具有較高的降解效率,但處理過程中很容易產(chǎn)生有毒的AM,而且需要能源供應(yīng)或藥劑投加,增加了其處理成本。生物法降解PAM已顯示出低成本、環(huán)保且不產(chǎn)生有毒底物的優(yōu)勢(shì)[25-26]。

先前的研究表明,PAM是微生物碳或氮的來源,并且PAM生物降解的代謝途徑在厭氧和好氧條件下均可發(fā)生。如果碳源充足,土壤微生物可將PAM作為唯一氮源,這表明此類微生物可以分解PAM上的酰胺基支鏈,但不能降解碳碳長(zhǎng)鏈[27-28]。厭氧菌包括硫酸鹽還原菌[29-30]和產(chǎn)甲烷菌[31]都可以使用PAM作為氮源。有研究表明,從油田驅(qū)采廢水中獲得的微生物在培養(yǎng)時(shí)可以利用PAM作為氮源或碳源[32]。WEN等[33]從活性污泥和油污土壤中分離出了2種可以利用PAM作為唯一碳源的菌株,發(fā)現(xiàn)酰胺基可被微生物水解。同時(shí),BAO等[32]推導(dǎo)了生物降解酶的作用機(jī)理:特種微生物分泌酰胺酶將氨基水解為羧基,然后通過酶的作用切斷側(cè)鏈末端的甲基[33,34]。最后,甲基被單一加氧酶催化氧化為酸,PAM鏈骨架斷裂,從不同位置形成乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸和異戊酸等小分子有機(jī)物[35]。

目前所有針對(duì)PAM的生物強(qiáng)化手段均采用PAM作為底物直接篩選降解菌,未考慮針對(duì)PAM代謝途徑中不同步驟的產(chǎn)物進(jìn)行微生物篩選,所以現(xiàn)有的研究論文中獲得的復(fù)配菌劑能夠提高PAM的降解率,但總有機(jī)碳(TOC)下降率較低?，F(xiàn)今使用的淀粉-碘化鎘測(cè)定PAM濃度的方法,其原理是檢測(cè)PAM溶液中酰胺基的含量,酰胺基脫落、測(cè)得數(shù)值降低,則認(rèn)為PAM濃度降低[36]。然而,酰胺基脫落后形成的聚丙烯酸、長(zhǎng)碳鏈聚合物等,則被忽視掉了。而TOC的降低,才能夠代表溶液中有機(jī)碳類物質(zhì)被礦化、轉(zhuǎn)變?yōu)镃O2和H2O。ZHANG等[26]將以PAM為底物分離到的3株菌應(yīng)用于反應(yīng)器中,發(fā)現(xiàn)這3種菌均具有穩(wěn)定的強(qiáng)化效果,但處理后的TOC去除率最高只能達(dá)到40%。SANG等[12]將以PAM為底物獲得的2株菌PAM-2和PAM-F1混合投加到厭氧折流板反應(yīng)器中,以蔗糖作為共代謝底物,通過變性梯度凝膠電泳(DGGE)的分析發(fā)現(xiàn),2株菌能夠很好的存在于反應(yīng)器中,對(duì)PAM和黏度的降解率分別可達(dá)89.8%和75.8%,而TOC降解率僅為32.9%。

目前所有的報(bào)道中,PAM降解菌的篩選全部以PAM作為底物,而并未針對(duì)PAM脫酰胺基后形成的長(zhǎng)碳鏈降解菌進(jìn)行篩選。針對(duì)于上述問題,本研究的2組試驗(yàn)中,分別以PAM作為氮源,液體石蠟作為碳源;聚丙烯酸(PAM脫酰胺基后形成的主要長(zhǎng)碳鏈聚合物)作為碳源,氯化銨作為氮源,篩選不同功能的降解菌群。并將兩者復(fù)配獲得功能相輔的復(fù)合菌劑,用以提高PAM的礦化率。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)中使用的PAM種類為陰離子型,其相對(duì)分子質(zhì)量為1600×104,由勝利油田相關(guān)公司提供;聚丙烯酸鈉(SPA)購自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司;實(shí)驗(yàn)室模擬含聚廢水成分參照勝利油田出水水質(zhì)成分配制而成。

1.2 培養(yǎng)基成分

培養(yǎng)基Ⅰ成分組成(以1 L計(jì)):2 mL液體石蠟,0.3 g PAM,0.2 g KH2PO4,0.1 g CaCl2,0.1 g MgCl2,1 g NaCl,0.1 g FeCl3,0.1 g MgSO4及微量元素液(各類微量元素痕量配制成溶液)1 mL[33]。

培養(yǎng)基Ⅱ成分組成(以1 L計(jì)):1 g SPA,0.1 g NH4Cl,0.2 g KH2PO4,0.1 g CaCl2,0.1 g MgCl2,1 g NaCl,0.1 g FeCl3,0.1 g MgSO4,及微量元素液(各類微量元素痕量配制成溶液)1 mL,加入去離子水定容至1 L。

上述2種培養(yǎng)基可通過添加1.5%～2.0%瓊脂,制備成固體培養(yǎng)基。文中所述濃度均為質(zhì)量濃度。

1.3 菌種的篩選及鑒定

PAM酰胺基降解菌種的篩選:以勝利油田長(zhǎng)期接觸PAM的土壤作為篩種來源,首先以PAM為唯一氮源的液體培養(yǎng)基作為篩選及富集培養(yǎng)基Ⅰ,將土壤稱取5～10 g,加入到100 mL無菌水中,加入玻璃珠1 g,120～150 r/min搖床震蕩1 h。取1 mL上清液加入到上述培養(yǎng)基Ⅰ內(nèi),30 ℃培養(yǎng)5 d;再取培養(yǎng)后的菌液1 mL,加入到新的100 mL培養(yǎng)基Ⅰ內(nèi),30 ℃培養(yǎng)48 h。取上述培養(yǎng)液1 mL,加入到9 mL無菌水中,采用梯度稀釋法,最終稀釋質(zhì)量濃度至10-6。取稀釋后的菌液,涂布在固體培養(yǎng)基Ⅰ表面,30 ℃培養(yǎng)48 h,獲得單菌落。分別挑取單菌落,在新的固體培養(yǎng)基表面劃線分離5次后,獲得純菌種。

PAM長(zhǎng)碳鏈降解菌種的篩選:以長(zhǎng)期處理含聚廢水的生物接觸氧化反應(yīng)器中填料表面的生物膜作為微生物篩選的來源,首先以培養(yǎng)基Ⅱ(SPA為唯一碳源)的液體培養(yǎng)基作為篩選及富集培養(yǎng)基。將生物接觸氧化反應(yīng)器內(nèi)的生物膜稱取5 g,加入到100 mL無菌水中,加入玻璃珠1 g,120 rpm搖床震蕩1 h。取上述培養(yǎng)液1 mL,加入到9 mL無菌水中,采用梯度稀釋法,最終稀釋質(zhì)量濃度至10-6。取稀釋后的菌液,涂布在固體培養(yǎng)基Ⅱ表面,30 ℃培養(yǎng)48 h,獲得單菌落。分別挑取單菌落,在新的固體培養(yǎng)基表面劃線分離5次后,獲得純菌種。

利用E.Z.N.A.SQ Tissue DNA Kit基因組DNA提取試劑盒提取功能菌株的DNA,以細(xì)菌的通用引物Primer A-27F(Primer A-27F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和Primer B-1492R(5'-AAGGAGGTGATCCAG CCGCA-3')擴(kuò)增16S rDNA片段進(jìn)行測(cè)序比較分析。PCR反應(yīng)體系:總DNA 1 μL,Primer A-27F 1 μL,Primer B-1492R 1 μL,10×Buffer 5 μL,dNTP 4 μL,Taq DNA聚合酶 0.25 μL,ddH2O 32.5 μL;以及擴(kuò)增程序:94 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變1 min,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,循環(huán)35次后將PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程公司進(jìn)行測(cè)序,之后將測(cè)序得到的16S rDNA進(jìn)行Blast序列分析比對(duì)。

1.4 菌種的馴化

將篩選到的PAM酰胺基降解菌及長(zhǎng)碳鏈降解菌分別加入到表1和表2的特異性馴化培養(yǎng)基中,放置于30 ℃的搖床中震蕩培養(yǎng)。每隔3 d移取5 mL前一個(gè)培養(yǎng)基溶液加入到下一個(gè)馴化培養(yǎng)基中,依次進(jìn)行,直到降解菌在④ 號(hào)馴化培養(yǎng)基中穩(wěn)定生長(zhǎng)后停止馴化。將經(jīng)過馴化的菌種進(jìn)行富集培養(yǎng)以進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

表1 酰胺基降解菌特異性馴化培養(yǎng)基

表2 碳鏈降解菌特異性馴化培養(yǎng)基

1.5 菌種性能及降解效果測(cè)定

配制500 mg/L的模擬PAM溶液并進(jìn)行高溫高壓滅菌,在PAM溶液中接種經(jīng)深度馴化的酰胺基降解菌、C—C長(zhǎng)鏈降解菌以及2種菌進(jìn)行組合的混合菌作為菌液。將菌液放置于搖床中進(jìn)行恒溫培養(yǎng),觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)情況,并采用淀粉-碘化鎘法測(cè)定PAM的濃度。

1.6 功能菌復(fù)配方法

將馴化完成的單株菌按照S組與G組兩兩組合、三三組合和全部混合的方式進(jìn)行復(fù)配,共9組。每種菌液離心濃縮至OD600=1，分別取1 mL加入到500 mg/L的PAM溶液中,其他營(yíng)養(yǎng)成分還包括(g/L):0.1 KH2PO4,1 NaHCO3,0.1 MgSO4,0.1 CaCl2,1 NaCl,微量元素母液1 mL。

1.7 FT-IR圖譜分析

采用紅外圖譜法檢測(cè)PAM及其生物降解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu),考察不同時(shí)期的基團(tuán)變化。樣品分析前需均先經(jīng)過24 h真空冷凍干燥處理,用光譜純KBr制作壓片測(cè)定,采用傅里葉-紅外光譜儀進(jìn)行分析。

2 結(jié)果分析與討論

2.1 降解菌的分離與鑒定

在含有PAM和SPA的固體培養(yǎng)基上劃線純化后共獲得23株單菌,16S rDNA測(cè)序分析后,將基因序列提交到NCBI GenBank進(jìn)行比對(duì)分析,發(fā)現(xiàn)23株菌分別屬于的4個(gè)不同的菌屬,其中能夠高效降解酰胺基的菌種有2株,分別命名為S-1(Ochrobactrumanthropi,相似度99%)、S-2(Acinetobactervenetianus,相似度99%);高效降解長(zhǎng)碳鏈的菌有2株,分別命名為G-1(Pseudochrobatrumsp.,相似度100%)、G-2(Bacilluscereus,相似度100%)。其中,G-2所屬的芽孢桿菌有大量研究數(shù)據(jù)表明可應(yīng)用于PAM的降解,而其他3種菌尚未有應(yīng)用于PAM的降解的報(bào)道[33]。

2.2 酰胺基降解菌的降解效果

分別取1 mL馴化前后的S-1、S-2菌液加入到經(jīng)高溫高壓滅菌后的PAM基本培養(yǎng)基中,將其放置于搖床中30 ℃恒溫震蕩培養(yǎng),每隔4 h取樣進(jìn)行檢測(cè),共培養(yǎng)120 h。圖1(a)和圖1(b)為馴化前后S-1、S-2的生長(zhǎng)曲線和PAM降解效果,可以看出,生長(zhǎng)曲線符合微生物生長(zhǎng)繁殖的S型曲線規(guī)律,并且馴化后的S-1、S-2降解菌的生長(zhǎng)情況要優(yōu)于馴化之前,降解PAM的效果也更強(qiáng)。馴化之前S-1、S-2降解菌對(duì)500 mg/L的PAM溶液的降解率為37.28%和42.14%,經(jīng)過馴化之后,提高到了46.7%和51.54%,說明經(jīng)過馴化顯著提高了降解菌在PAM溶液中的生存能力。

圖1 馴化前后S-1、S-2的生長(zhǎng)曲線和PAM降解效果

2.3 C—C長(zhǎng)鏈降解菌的降解效果

分別取1 mL馴化前后的G-1和G-2菌液加入到經(jīng)高溫高壓滅菌后的不加外加碳源的SPA液體培養(yǎng)基中,將其放置于搖床中30 ℃恒溫震蕩培養(yǎng),每隔4 h取樣進(jìn)行檢測(cè),共培養(yǎng)120 h。圖2(a)和圖2(b)為馴化前后G-1、G-2的生長(zhǎng)曲線和COD去除情況,可以看出,生長(zhǎng)曲線符合微生物生長(zhǎng)繁殖的S型曲線規(guī)律,并且隨著降解菌的生長(zhǎng),COD去除率也在逐步提高,最終趨于穩(wěn)定,說明G-1、G-2這2種降解菌能夠以SPA作為唯一碳源進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖,從而可以推出這2種降解菌對(duì)PAM的長(zhǎng)鏈態(tài)的碳有去除效果。

圖2 馴化前后G-1、G-2的生長(zhǎng)曲線和COD去除情況

2.4 2類降解菌制備復(fù)配菌劑的降解效果

在本實(shí)驗(yàn)中,選用勝利油田長(zhǎng)期接觸含聚廢水的土壤來篩選酰胺基降解菌,采用生物接觸氧化反應(yīng)器中已長(zhǎng)期降解含聚廢水的生物膜篩選長(zhǎng)碳鏈降解菌。2種降解菌的篩選來源不同,有利于菌株間更好的協(xié)同作用,提高降解效率。從圖3來看,最佳混合菌劑的降解效果明顯高于單一細(xì)菌。PAM的去除率大大提高,有利于降低PAM的分子質(zhì)量,降解C—C長(zhǎng)鏈將大大降低含聚廢水的黏度。此外,混合菌劑對(duì)PAM的降解效果呈現(xiàn)多種狀態(tài),或增強(qiáng)或減弱,這是菌種間存在的協(xié)同以及競(jìng)爭(zhēng)所導(dǎo)致,從而影響了菌種對(duì)PAM的降解效果。其中S-2&G-2混合菌劑對(duì)PAM的降解效果最為顯著,能達(dá)到69%,說明S-2和G-2之前存在著良好的協(xié)同關(guān)系,而S-1&S-2&G-2混合菌劑對(duì)PAM的降解效果較單菌種而言降低了,只有35%,說明這3種菌劑之間存在著競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。此外,本實(shí)驗(yàn)也對(duì)混合菌劑對(duì)含PAM廢水黏度的降低效果進(jìn)行了探究,研究發(fā)現(xiàn),S-2&G-2混合菌劑仍然是最優(yōu)的降解菌組,實(shí)驗(yàn)室配制的500 mg/L的PAM模擬廢水黏度在1.61 mPa·s(14 ℃下水的黏度為1.17 mPa·s),如圖4,經(jīng)過84 h降解,黏度下降至1.24 mPa·s,與水的黏度十分接近,從側(cè)面顯示出混合菌劑對(duì)PAM有顯著的降解效果。圖5為混合菌劑對(duì)不同濃度PAM溶液TOC的降解效果,PAM質(zhì)量濃度越低,去除率越高,針對(duì)100 mg/L PAM溶液的TOC去除率可達(dá)60%以上,遠(yuǎn)高于已有報(bào)道[26]。

A.S-1&G-1，B.S-1&G-2，C.S-2&G-1，D.S-2&G-2，E.S-1&G-1&G-2，F(xiàn).S-2&G-1&G-2，G.S-2&G-1，H.S-1&G-2，I.S-1&S-2&G-1&G-2。

圖4 S-2和G-2混合菌劑對(duì)降低含聚合物廢水黏度的影響

圖5 S-2和G-2混合菌劑對(duì)不同濃度PAM溶液TOC的降解效果

2.5 FT-IR圖譜分析

S-2&G-2混合菌劑降解PAM樣品的紅外圖譜如圖6所示,對(duì)比降解前后的PAM紅外光譜可以發(fā)現(xiàn)經(jīng)過復(fù)配菌劑降解之后,PAM的結(jié)構(gòu)發(fā)生了很大的變化,紅外光譜中原有的一部分特征吸收峰消失,同時(shí)出現(xiàn)了新的特征吸收峰,如位于3300～3500 cm-1區(qū)域內(nèi)游離的-NH2的特征吸收峰消失變?yōu)?OH的尖銳吸收帶,2929 cm-1處的亞甲基反對(duì)稱吸收峰消失,同時(shí)位于1666 cm-1處的羰基(C=O)的特征吸收峰消失,說明降解菌可以利用PAM上的碳作為生長(zhǎng)繁殖的碳源,并且于1000～1475 cm-1區(qū)域內(nèi)出現(xiàn)新的特征吸收峰,此處出現(xiàn)的新的特征吸收峰屬于醇類;位于1408 cm-1處的C-N特征吸收峰消失,說明氨基從主鏈脫落,而在650～1000 cm-1區(qū)域內(nèi)新出現(xiàn)芳香烴類化合物的特征吸收峰,從而進(jìn)一步證明:復(fù)合菌劑能夠降解PAM并利用其長(zhǎng)鏈態(tài)的碳以及酰胺基作為自身生長(zhǎng)發(fā)育的碳源和氮源;實(shí)驗(yàn)結(jié)果與鄭忠環(huán)等[37]的研究結(jié)果相符合,WEN等[33]的研究也表明,生物降解能夠?qū)AM側(cè)鏈上的氨基斷裂下來,成為微生物生長(zhǎng)繁殖不可或缺的氮源。

圖6 PAM降解前后的紅外光譜

3 結(jié) 論

(1)經(jīng)16S rDNA鑒定,從勝利油田含聚污泥中篩選出的4種PAM降解菌S-1、S-2、G-1、G-2分別屬于人蒼白桿菌(Ochrobactrumanthropi),威尼斯不動(dòng)桿菌(Acinetobactervenetianus),假蒼白桿菌(Pseudochrobatrumsp.)和蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)。

(2)降解菌經(jīng)過馴化培養(yǎng),生長(zhǎng)情況與對(duì)PAM的降解能力優(yōu)于馴化培養(yǎng)之前。2類降解菌復(fù)配成復(fù)配菌劑,其中S-2&G-2復(fù)配菌劑對(duì)PAM的降解效果最為顯著,降解率能達(dá)到69%;混合菌劑對(duì)含聚廢水的黏度的降低也有較好的效果,經(jīng)過84 h降解,最優(yōu)復(fù)配菌劑能夠?qū)⒑蹚U水的黏度從1.61 mPa·s降至1.24 mPa·s(14 ℃下水的黏度為1.17 mPa·s),同時(shí),混合菌劑對(duì)于TOC也有較強(qiáng)的去除作用,對(duì)于質(zhì)量濃度為300 mg/L以內(nèi)的PAM溶液的TOC去除率能達(dá)到50%以上。這表明復(fù)配菌劑可以降解PAM的碳鏈?zhǔn)蛊浞肿淤|(zhì)量下降,并將部分長(zhǎng)碳鏈礦化。

(3)對(duì)復(fù)配菌劑降解PAM前后的紅外圖譜進(jìn)行分析顯示,降解菌能夠降解并利用PAM的氨基和碳作為生長(zhǎng)繁殖的氮源和碳源。