鐘 薇,蘇 穎,李志明,王愛(ài)萍, 2,孟慶國(guó),梁榮財(cái), 2

(1.煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院,煙臺(tái)大學(xué)新型制劑與生物技術(shù)藥物研究山東省高校協(xié)同創(chuàng)新中心,分子藥理和藥物評(píng)價(jià)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(煙臺(tái)大學(xué)),山東 煙臺(tái) 264005;2.山東綠葉制藥有限公司長(zhǎng)效和靶向制劑國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 煙臺(tái) 264003)

全世界曾經(jīng)感染過(guò)乙肝病毒的人高達(dá)13億人,其中約2.57億人發(fā)展為慢性乙型肝炎[1-2]。恩替卡韋作為治療慢性乙肝的一線用藥,具有很好的抗病毒治療效果以及較低的耐藥率,但其不能直接消滅乙肝病毒,只能抑制乙肝病毒DNA復(fù)制[3],因此,患者需長(zhǎng)期用藥來(lái)控制疾病發(fā)展。另外,恩替卡韋需要每日空腹服藥,這會(huì)引起胃腸道副反應(yīng),導(dǎo)致患者依從性差,常有患者自行停藥的情況發(fā)生,這可能會(huì)導(dǎo)致乙肝病毒反跳,進(jìn)一步加重肝臟損害[4],造成病情惡化。因此,將恩替卡韋開(kāi)發(fā)成長(zhǎng)效緩釋制劑很有意義。

微球是目前研究較多的藥物控釋系統(tǒng),與口服劑型相比,其優(yōu)勢(shì)明顯,如減少給藥次數(shù)、提高患者依從性、延長(zhǎng)藥物作用時(shí)間、提高藥效等[5-7]。聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)是微球給藥系統(tǒng)中最常用的生物可降解材料,由于其具有良好的生物相容性、可調(diào)節(jié)的機(jī)械性能以及良好的成膜性[8],使這種聚合物適用于藥物控釋系統(tǒng)。

在本研究中,以PLGA為微球載體材料,采用S/O/W乳化-溶劑揮發(fā)法制備恩替卡韋PLGA微球,采用Box-Behnken響應(yīng)面法對(duì)工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,篩選出最優(yōu)處方;對(duì)微球的載藥量、包封率、粒徑以及其表面形貌進(jìn)行評(píng)價(jià),并考察其體外釋放行為。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

恩替卡韋一水合物(濟(jì)南宏方德醫(yī)藥科技有限公司);PLGA(8515 DLG 5A,Lakeshore公司);二氯甲烷(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,分析純);甲醇(德國(guó)Merck公司,色譜純); PVA(德國(guó)EMD公司);吐溫80(南京威爾化工有限公司);磷酸鹽緩沖液(PBS, 福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)。

1.2 恩替卡韋微球的制備

將PLGA溶于10 mL二氯甲烷中,攪拌使其溶解,形成油相(O),加入恩替卡韋原料藥,形成S/O懸浮液, 6000 r/min均質(zhì)20 s使其充分混勻后,緩慢加入到PVA水溶液中, 1000 r/min高速剪切3 min形成軟球,轉(zhuǎn)移至機(jī)械攪拌器內(nèi)繼續(xù)以300r/min的速度攪拌5 h以固化微球,將所得溶液以100目+1200目過(guò)濾收集微球,并用去離子水沖洗3遍,放入冷凍干燥機(jī)中凍干即得恩替卡韋微球。

1.3 Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化微球制備

在本課題組之前實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用三因素三水平優(yōu)化處方。將PLGA質(zhì)量濃度、PVA體積分?jǐn)?shù)、水油比作為自變量,將載藥量、包封率、粒徑作為響應(yīng)。每個(gè)自變量選取三個(gè)水平,編碼為-1(低)、0(中)、+1(高),如表1所示。

表1 響應(yīng)面法的自變量選取及其水平

1.4 高效液相色譜法條件

使用Agilent C18分析柱(4.6 mm×25 cm,5 μm),流動(dòng)相A(甲醇)∶流動(dòng)相B(水)=20∶80,流速為1 mL·min-1,進(jìn)樣體積為20 μL,柱溫為40 ℃,紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。恩替卡韋的保留時(shí)間為5 min,記錄其峰面積。

1.5 微球載藥量及包封率的測(cè)定

精密稱(chēng)取恩替卡韋微球10 mg,置于50 mL離心管中,加入2 mL二氯甲烷,超聲使其溶解,加入30 mL流動(dòng)相,以3600 r/min的速度離心10 min,吸取上清液,按“1.4”項(xiàng)下高效液相色譜法進(jìn)行微球載藥量的測(cè)定。微球的載藥量和包封率分別以下式計(jì)算:

載藥量=微球中恩替卡韋的質(zhì)量/微球總質(zhì)量×100%,

包封率=實(shí)際載藥量/理論載藥量×100%.

Model Builder在建設(shè)用地報(bào)批線狀地物面積自動(dòng)扣除中的應(yīng)用 張海龍，趙耀龍，葉 璐(3-8)

1.6 微球表面形態(tài)及粒徑的測(cè)定

使用掃描電子顯微鏡觀察微球的表面形貌。將微球固定于導(dǎo)電膠上,噴金后放入掃描電子顯微鏡中觀察。

使用馬爾文3000粒度分析儀測(cè)定粒徑。以0.1%吐溫20溶液為分散介質(zhì),加入微球后使其分散混勻。平行測(cè)定3次,取其平均值作為測(cè)量結(jié)果。

1.7 微球體外釋放的測(cè)定

將10 mg恩替卡韋微球置于15 mL離心管中,加入10 mL PBS緩沖液(pH值7.4，10 mmol/L)。將離心管放入37 ℃恒溫水浴振蕩器中,以50 r/min的速度震蕩。分別在30 min、1 h、3 h、6 h、10 h、1 d、2 d、3 d、4 d、6 d、8 d、10 d、13 d、15 d、17 d、20 d、23 d、27 d、31 d、34 d、38 d、41 d、45 d、50 d、55 d、59 d取出離心管,以3600 r/min的速度離心10 min,取出9 mL上清液,同時(shí)補(bǔ)入等量的新鮮釋放介質(zhì)。按“1.4”項(xiàng)下高效液相色譜法測(cè)定上清液中的藥物含量,計(jì)算其釋放度。以累計(jì)釋放百分比對(duì)其時(shí)間作圖,得到藥物的累計(jì)釋放曲線。

1.8 微球的釋放動(dòng)力學(xué)研究

分別使用零級(jí)、一級(jí)、Higuchi方程和Korsmeyer-Peppas方程對(duì)釋藥曲線進(jìn)行擬合,以確定恩替卡韋微球的釋藥機(jī)理。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 微球處方優(yōu)化及結(jié)果

采用三因素三水平Box-Behnken設(shè)計(jì)對(duì)處方參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,17次實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。使用Design-Expert軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合,其多項(xiàng)式模型如下所示:

表2 Box-Behnken設(shè)計(jì)及其結(jié)果

(1)載藥量模型Y1:

Y1=19.74+0.38A+0.40B-0.28C-1.02AB-0.25AC-0.45BC-1.11A2-1.12B2-2.62C2。

(2)包封率模型Y2:

Y2=78.99+1.52A+1.60B-1.12C-4.07AB-1.00AC-1.79BC-4.45A2-4.52B2-10.51C2。

(3)粒徑模型Y3:

Y3=96.26+24.64A-0.79B+14.63C-0.93AB+8.75AC+1.1BC+1.73A2+2.08B2-5.64C2。

采用方差分析檢驗(yàn)?zāi)Ｐ褪欠窬哂薪y(tǒng)計(jì)學(xué)意義,在0.05顯著性水平下進(jìn)行檢驗(yàn),其結(jié)果如表3所示。F值越大,P值越小,說(shuō)明該模型越具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。從表3可知,Y1、Y2、Y3的F值均較大,P值均小于0.000 1,說(shuō)明該模型極具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。模型失擬項(xiàng)的P值均大于0.05(分別為0.054 6、0.074 6、0.065 6),表明失擬項(xiàng)不顯著,由此證明該模型可信度較高。Y1、Y2、Y3的R2值均大于0.8(分別為0.988 3、0.987 9、0.998 0),說(shuō)明實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)測(cè)結(jié)果之間有良好的相關(guān)性。綜上所述,該模型精密度和可靠性較高。

表3 Box-Behnken設(shè)計(jì)的方差分析

圖1為載藥量模型的三維響應(yīng)曲面圖。由圖1可知,載藥量隨著ρ(PLGA)和φ(PVA)的升高而增加。這可能是因?yàn)楫?dāng)ρ(PLGA)增加時(shí),有機(jī)相的粘度也增加,較高的有機(jī)相粘度會(huì)使PLGA液滴快速凝固,從而減少藥物向水相中滲漏[9-10]。PVA作為O/W的乳化劑,濃度的增加確保了更穩(wěn)定的乳化體系生成,減少藥物的損失。

圖1 載藥量模型的三維響應(yīng)面圖

圖2為包封率模型的三維響應(yīng)曲面圖。由圖2可知,其變化趨勢(shì)與載藥量模型基本一致。因?yàn)榘饴实臏y(cè)定是以實(shí)際載藥量與理論載藥量的比值確定的,而在17次實(shí)驗(yàn)中理論載藥量均不變。

圖2 包封率模型的三維響應(yīng)面圖

圖3為粒徑模型的三維響應(yīng)曲面圖,由圖3可知,微球的粒徑隨著ρ(PLGA)和水油比的增加而增大。當(dāng)ρ(PLGA)較高時(shí),形成初乳所需的能量大。這意味著當(dāng)均質(zhì)速度相同時(shí),ρ(PLGA)高的處方將產(chǎn)生更大的粒徑[11]。此外,由于ρ(PLGA)的增加,在乳化和微粒形成的過(guò)程中可能會(huì)發(fā)生碰撞,導(dǎo)致液滴聚集,粒徑增大[12]。由于油相體積不變,當(dāng)水油比增加時(shí),溶液的整體體積增加,在均質(zhì)速率不變的情況下,剪切效率下降,從而產(chǎn)生較大粒徑的微球。

圖3 粒徑模型的三維響應(yīng)面圖

載藥量、包封率、粒徑是微球評(píng)價(jià)的重要指標(biāo),從響應(yīng)面分析結(jié)果來(lái)看,伴隨著微球載藥量的提高,粒徑也相應(yīng)的增大,以至于不能滿足注射要求。因此,選擇最大載藥量和包封率、最小的粒徑作為優(yōu)化指標(biāo),得到的最優(yōu)制備處方為:PLGA質(zhì)量濃度(A)為0.13 g·mL-1,PVA體積分?jǐn)?shù)(B)為1.2%,水油比(C)為91∶1,載藥量為19.56%,包封率為78.28%,粒徑為85.3 μm。

制備了3批以最優(yōu)條件為處方的平行樣品,其結(jié)果如表4所示。由表4可以看出,驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其預(yù)測(cè)值非常接近,誤差較小,由此證明了該模型的準(zhǔn)確性,說(shuō)明可以利用此模型進(jìn)行恩替卡韋微球的優(yōu)化。

表4 模型的實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值的比較

2.2 微球的表面形態(tài)

使用掃描電子顯微鏡對(duì)優(yōu)化后的恩替卡韋微球的表面形態(tài)進(jìn)行了觀察,其表面形態(tài)如圖4所示。恩替卡韋微球呈球形,結(jié)構(gòu)致密無(wú)孔,表面附著的微晶粒子可能是在制備過(guò)程中沒(méi)有被包載的原料藥,球體表面呈光滑態(tài)。

圖4 恩替卡韋微球的表面形態(tài)

2.3 微球的體外釋放

恩替卡韋微球在PBS緩沖液中的釋放情況如圖5所示。恩替卡韋微球的釋放呈雙相,先是一段快速釋放時(shí)期,在13 d后進(jìn)入緩慢釋放階段,一直持續(xù)到第59天,釋放結(jié)束。第一階段的快速釋放可能是因?yàn)橹苽溥^(guò)程中溶劑對(duì)流導(dǎo)致微球表面附近藥物濃度增加[13]。第二階段的釋放較第一階段相對(duì)緩慢,因?yàn)檫@一階段的釋放主要是由PLGA降解所控制的。隨著時(shí)間的延長(zhǎng),PLGA逐漸水解為低聚物或單體產(chǎn)物,微球表面和內(nèi)部形成孔道,這為微球內(nèi)部的藥物通過(guò)擴(kuò)散和侵蝕釋放提供了條件[8]。

圖5 恩替卡韋微球在37 ℃ PBS緩沖液中的釋放情況

2.4 微球的釋放動(dòng)力學(xué)研究

為了研究恩替卡韋微球的釋藥機(jī)理,分別采用零級(jí)動(dòng)力學(xué)方程、一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程、Higuchi模型以及Korsmeyer-Peppas模型對(duì)釋藥曲線進(jìn)行擬合,其結(jié)果如表5所示。R2越接近于1,說(shuō)明該模型能更好地?cái)M合微球的釋放行為。一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程、Higuchi模型以及Korsmeyer-Peppas模型均能較好地?cái)M合釋放曲線,但相比而言,一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程更適合解釋恩替卡韋微球的釋藥機(jī)理(R2=0.990 1)。說(shuō)明恩替卡韋在微球中的轉(zhuǎn)運(yùn)速率是有限的且呈濃度依賴性[14-15]。

表5 恩替卡韋微球的釋放動(dòng)力學(xué)參數(shù)

3 結(jié) 論

本研究成功制備了恩替卡韋微球,并對(duì)其制備工藝參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。最終得到的最優(yōu)處方為:PLGA質(zhì)量濃度為0.13 g·mL-1,PVA體積分?jǐn)?shù)為1.2%,水油比為91∶1。對(duì)該實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行驗(yàn)證,制備的3批微球載藥量為(19.23±0.32)%,包封率為(76.91±1.28)%,平均粒徑為84.5 μm。在最佳條件下制備的微球的實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值基本接近,說(shuō)明響應(yīng)面法可用于優(yōu)化恩替卡韋微球的制備條件。掃描電子顯微鏡顯示微球呈球形,結(jié)構(gòu)致密,表面光滑。恩替卡韋微球釋放一直持續(xù)到第59天,表明該微球具有很好的緩釋效果。