施寧雪 張燁 倪歡 韋永淑 靳晶豪 陳孝仁

摘要：研究草莓體內能夠分離培養(yǎng)的微生物的群落組成和結構，對健康草莓穩(wěn)態(tài)菌群的構建和保持具有重要意義。以健康草莓為研究樣本，對其根、莖、葉內的真菌和細菌進行分離培養(yǎng)，分別利用真菌rDNA-ITS引物和細菌16S rRNA引物進行PCR擴增，然后基于測序及其生物信息學分析鑒定微生物種類。結果表明，從健康草莓根、莖、葉部獲得了真菌1個門4個屬中的14株菌株和細菌3個門6個屬中的14株菌株，其中細菌內生菌的多樣性高于真菌類群;3個器官中根部內生菌的多樣性程度最高;芽孢桿菌（Bacillus）和葡萄孢屬（Botrytis）是豐度較高的2個內生菌屬。本研究初步明確了草莓不同部位可培養(yǎng)內生菌的分布特點和規(guī)律，為探索利用這些內生菌以促進草莓健康生長奠定了基礎。

關鍵詞：草莓;內生菌;根;莖;葉;多樣性;促生作用

中圖分類號：S668.401;S182文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）07-0130-05

收稿日期：2020-07-27

基金項目：國家自然科學基金（編號：31671971、31871907）;2016年度江蘇高校青藍工程項目;2018年度揚州大學“高端人才支持計劃”（拔尖人才成長計劃）。

作者簡介：施寧雪（1996—），女，江蘇南京人，碩士研究生，主要從事植物真菌病害研究，E-mail：whoilove1996@163.com;

共同第一作者：張 燁（1995—），男，江蘇南通人，碩士研究生，主要從事植物真菌病害研究，E-mail：424396702@qq.com。

通信作者：陳孝仁，博士，教授，主要從事植物真菌病害研究。E-mail：xrchen@yzu.edu.cn。

內生微生物（endophytic microorganisms）是植物微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，是一大類能夠在健康植物活組織內生存而不引起明顯寄主植物病變的微生物，主要包括細菌、真菌、放線菌和病毒[1-4]。內生微生物一生或在生活史的某個階段生活于植物活組織內，在長期的進化過程中與寄主植物建立了和諧聯(lián)合的關系，是植物微生態(tài)系統(tǒng)中巨大而寶貴的資源庫[5-6]。自20世紀90年代以來，植物內生微生物逐漸成為微生物學研究的熱點，對它的認識逐漸深入。首先，內生微生物種類多樣，最常見的是細菌、真菌和放線菌，亦被合稱為內生菌（endophytes）。已經(jīng)明確地球上所有科的植物都含有內生真菌[7]。其次，內生微生物不僅可以提高植物抗生物逆境（抗病、抗蟲及其他食草動物）和抗非生物逆境能力，還可以幫助植物吸收磷、氮、硫及微量元素[8-9]。此外，內生菌能夠降解環(huán)境中的有害污染物，具有生物修復能力[6]。

深入了解植物內生微生物，尤其是內生菌的種類、生活史、新陳代謝及其與寄主植物的相互關系，對其在農(nóng)業(yè)上的應用具有重要意義。目前，尚不清楚植物內生菌的具體種類和數(shù)量。一般而言，不同地理環(huán)境下生長的植物具有的內生菌可能不一樣。例如，高緯度地區(qū)的植物內生菌種類較少，且多來自子囊菌門;而熱帶地區(qū)植物的內生菌種類則更加豐富[10]。此外，在相似環(huán)境下生長的不同植物可能擁有不同的內生菌[11]。隨著分子生物學技術的不斷發(fā)展，利用高通量測序等技術分析微生物的核糖體RNA （rRNA）序列可對植物內生菌進行全面而快速的鑒定[12]，微生物組學（microbiome）也應運而生。盡管如此，這些分子生物學手段未涉及到植物內生菌的分離培養(yǎng)，因此也就無法進行下一步的內生菌開發(fā)利用工作。

草莓是薔薇科（Rosaceae）草莓屬（Fragaria）的多年生草本植物，其果實酸甜可口、營養(yǎng)豐富，是一種具有較高經(jīng)濟價值的水果。目前，針對草莓的微生物組研究主要是圍繞草莓根際土壤、果實表面或者葉片表面的微生物類群，針對其內生菌的研究報道很少，不利于草莓內生菌的開發(fā)利用[13-20]。開發(fā)利用植物內生菌，首要條件就是可以人工分離、培養(yǎng)這些微生物，以進一步分析其生活史、生理生化性狀以及與植物的關系。有鑒于此，本試驗從健康草莓的根、莖、葉不同部位分離內生真菌和細菌，并利用分子生物學技術進行快速鑒定，分析草莓不同部位內生菌的分布特點和規(guī)律，以期為探索利用這些內生菌以促進草莓健康生長奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2017年5月在江蘇省揚州市施橋鎮(zhèn)揚子村任橋露地草莓園（119°43′7.00′′E，32°31′7.00′′N）采集草莓品種章姬（Akihime）為試材。在無病田選取3處進行“S”形取樣，共采集15株草莓，整株挖出，用無菌袋低溫保存帶回實驗室。利用自來水沖洗掉植株根部和表面的土壤和殘屑，再用無菌水徹底沖洗植株，晾干待用。

1.2 內生菌的分離

分離健康草莓根、莖、葉部的內生真菌和細菌。葉片取樣分3個部位（從葉片邊緣切取的約5 mm×5 mm的組織、主葉脈中間段2側切取的約5 mm×5 mm 的組織、5～8 mm的葉柄中段）。根狀莖取樣分2個部位：韌皮部和木質部各取5 mm×5 mm的組織。根取樣分3個部位進行：表皮、皮層和維管束各取5 mm×5 mm的組織。

1.2.1 內生真菌的分離 植物組織置于0.5%次氯酸鈣溶液中消毒0.5～1 min，然后在無菌水中漂洗3次，晾干后置放在含0.5 μL/mL 96%乳酸的PDA平板（馬鈴薯200 g，葡萄糖16.0～20.0 g，瓊脂16.0～20.0 g，蒸餾水1 000 mL）上。平板靜置于霉菌培養(yǎng)箱（22±2） ℃內培養(yǎng)3 d，長出的菌絲尖端轉入新的PDA平板。利用分生孢子進行菌株純化，獲得的單孢株保存于4 ℃。

1.2.2 內生細菌的分離 將植物組織用0.5%次氯酸鈣消毒0.5～1 min，然后用無菌水沖洗3次，將組織塊加入無菌水中搗碎制成懸浮液，然后吸取100 μL懸浮液用劃線法涂布于NA固體培養(yǎng)基（牛肉浸膏3.0 g，蛋白胨5.0 g，NaCl 5.0 g，蒸餾水 1 000 mL，pH值7.0，瓊脂16.0 g）上，晾干后將培養(yǎng)皿置于30 ℃條件下培養(yǎng)3 d，挑取單菌落進行劃線純化。

1.3 分子生物學鑒定

1.3.1 基因組DNA的提取 在PDA平板表面鋪上滅菌的玻璃紙，將真菌菌株接種到玻璃紙上，置于25 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～4 d，再利用金屬鏟收集玻璃紙上的菌絲。利用杭州愛思進公司基因組DNA試劑盒（AP-MN-MS-GDNA-250）提取菌絲的基因組DNA。

挑取細菌單菌落加入到含有5 mL KB培養(yǎng)液的試管中，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)過夜。取1.5 mL菌液離心收集菌體，利用CTAB/NaCl法[21]提取細菌基因組DNA。

1.3.2 PCR擴增 利用細菌16S rDNA通用引物進行PCR擴增，引物序列為16S 33F：5′-ATGAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，16S 1387R：5′-TATTGGTGTGACGGGGGGTGT-3′。利用真菌rDNA-ITS （internal transcribed spacer，核糖體基因轉錄間隔區(qū)）通用引物進行PCR擴增，引物序列為ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，ITS5：5′-GGAAGGTAAAAGTCAAGG-3′。

PCR擴增體系：2 μL 1×PCR buffer、1.2 μL 25 mmol/L Mg2+、100～300 ng DNA、上下游引物（10 μmol/L）各1 μL、2 μL 2.5 mmol/L dNTPs、0.2 μL 5 U/μL Taq DNA聚合酶，無菌水補齊到 20 μL。PCR反應程序：94 ℃預變性5 min;95 ℃變性30 s，55 ℃復性30 s，72 ℃延伸 1 min，31個循環(huán);72 ℃延伸5 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，通過膠回收、TA載體克隆，送往上海生工生物工程有限公司進行序列測定。

1.3.3 生物信息學分析 序列提交到NCBI數(shù)據(jù)庫，進行BlastN比對，并登錄GenBank。將獲得的所有序列進行多重比對，再用MEGA7的Neighbor-Joining法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，采用自舉法（bootstrap）對系統(tǒng)發(fā)育樹進行檢驗，共1 000次循環(huán)，以保證系統(tǒng)樹的可靠性。

2 結果與分析

2.1 菌株分離結果

本研究從健康草莓根、莖、葉這3個器官的8個部位采樣，分成兩等份分別進行細菌和真菌的分離，最后共獲得14株真菌菌株和14株細菌菌株（表1）。其中，來自葉片的真菌菌株有8株，細菌菌株有5株;來自莖的真菌菌株有1株，細菌菌株有4株;來自根部的真菌和細菌菌株各有5株。菌株數(shù)目的不同可能與不同器官分離的部位數(shù)量有一定關系。

2.2 屬水平上內生菌的多樣性

對細菌菌株的16S rDNA、真菌菌株的rDNA-ITS序列進行擴增、克隆與測序，獲得了長度分別為1 455～1 519、563～615 bp的片段序列， 提交GenBank進行登記（表1）。基于這些序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中的比較，將菌株鑒定到屬或者種水平。由表1可知，分離獲得的真菌菌株來自真菌界的4個屬：葡萄孢屬（Botrytis）、枝穗霉屬（Clonostachys）、新擬盤多毛孢屬（Neopestalotiopsis）和小不整球殼屬（Plectosphaerella）。分離獲得的細菌菌株來自原核生物界的6個屬：芽孢桿菌屬（Bacillus）、新鞘氨醇桿菌屬（Novosphingobium）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、微桿菌屬（Microbacterium）。細菌的多樣性高于真菌。

進一步對分離的菌株進行分析，發(fā)現(xiàn)草莓不同部位中可培養(yǎng)內生菌在屬水平上呈現(xiàn)出多樣性的特點。按照內生菌多樣性的豐富度從高到低排列，根部>葉部>莖部。其中，根部分離出3個屬的真菌和4個屬的細菌，多樣性程度最高（圖1）。

在分離的真菌類群中，獲得葡萄孢屬菌株的比例最高，達到43% （6/14）;其次是枝穗霉屬，分離比為36%。在細菌類群中，芽孢桿菌屬出現(xiàn)的頻率最高，達到43%;其次是新鞘氨醇桿菌屬，分離比為21%。真菌中1個屬、細菌中3個屬各分離獲得1株菌株，代表性最低（圖2）。

2.3 屬以上階元內生菌的多樣性

對獲得的內生菌進行進一步的分類階元梳理，結果（表2）發(fā)現(xiàn)，真菌內生菌均來自真菌界子囊菌門（Ascomycota），而細菌來自原核生物界的3個門：厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteria）;在綱（Class）水平上，真菌來自2個綱：錘舌菌綱（Leotiomycetes）和糞殼菌綱（Sordariomycetes），細菌則來自4個綱：芽孢桿菌綱（Bacilli）、α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）、γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）和放線菌綱

（Actinobacteria）?？梢?，在高級分類階元上細菌內生菌的多樣性也高于真菌類群。

3 討論

植物內生微生物定殖于健康植物體內，與寄主植物在長期進化過程中形成了和諧共生的關系，對寄主植物具有防病、促生、固氮和生物修復等生物學作用，具有廣泛的應用價值[4，11]。目前，內生細菌和真菌不僅應用于植物病蟲害的生物防治，還用來促進植物生長[8-9，22]。深入了解植物內生菌資源，是其開發(fā)利用中的重要一步。草莓作為一種重要的作物，2018年在世界范圍內的種植面積約為 37萬hm2，產(chǎn)量約為834萬t（世界糧農(nóng)組織，http：//www.fao.org/faostat/）。目前并不清楚草莓內生微生物，尤其是細菌和真菌的種類以及分布情況。已有的關于草莓微生物組的研究主要是調研草莓根際土壤、果實或者葉片表面的微生物類群，針對其內生菌的研究報道很少，影響了草莓內生菌的開發(fā)利用[13-20]。針對該問題，本研究同時對草莓根、莖、葉3個部位的內生菌進行分離純化，獲得了真菌界子囊菌門4個屬中的14株菌株、原核生物界3個門6個屬中的14株菌株。這是首次分析草莓不同器官內生菌（真菌和細菌）的分布特點，為下一步分析內生菌的侵染定殖規(guī)律、生物學性狀及其開發(fā)利用奠定了基礎。

目前，分子生物學技術已應用于植物內生菌種類的分析研究。直接以植物組織中提取的總DNA為材料，通過構建文庫、測序等方法可獲得內生菌的種類信息[4]。這些方法不需要對內生菌進行分離培養(yǎng)，減少了復雜的分離過程，而且其高通量測序可快速、全面地了解植物內生菌多樣性的真實水平。但是，盡管用分子手段得到的植物內生菌的多樣性較為豐富，然而植物內生菌的開發(fā)利用仍然離不開對內生菌的定殖、生理生化性狀以及寄主植物和其他微生物的相互作用等方面的認識，這必然要求首先要獲得可人工培養(yǎng)的內生菌菌株以進行相關研究。例如，Marian等從草莓組織中分離獲得了226個放線菌菌株，利用離體葉片分析試驗最終篩選出一株能夠抑制草莓炭疽病的菌株MBFA-172;在隨后的溫室防控試驗中，該菌株顯示出類似于殺菌劑甲基代森鋅的防控效果，表明該菌株具有作為草莓炭疽病生防制劑的應用潛力[20]。當然，分離培養(yǎng)的方法也存在一定的局限性。首先，由于難以模擬一些內生菌的生長條件而不能獲得其純培養(yǎng)，導致內生菌多樣性被低估;其次，分離內生菌時對植物組織表面的消毒以及消毒時長可能會影響內生菌調查的準確性;再次，分離時所選用的培養(yǎng)基以及所用抗生素、乳酸等對內生菌的數(shù)量和種類也存在一定的影響[8]。這些問題需要在后續(xù)的研究中加以思考。結合分子生物學技術，對傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法進行優(yōu)化調整，有助于解決這些問題。

研究發(fā)現(xiàn)，不同的寄主植物擁有不同的內生菌，植物不同器官內生菌的分布也存在較大差異?，F(xiàn)有研究表明，根內生細菌數(shù)量遠遠超過其他植物器官的內生細菌，具有寄主植物多樣性和種屬多樣性特征，這是多種生物因素和非生物因素共同作用的結果[1，22]。本研究從根部分離出3個屬的真菌和4個屬的細菌，其多樣性程度高于葉和莖部;進一步發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌屬（Bacillus）是細菌類群中豐度最高的屬。這與大豆、玉米、小麥、水稻、馬鈴薯等多種作物的組織中分離的結果[23]一致。

本研究發(fā)現(xiàn)，健康的草莓體內也攜帶有多種病原真菌，如灰葡萄孢（Botrytis cinereal）、新擬盤多毛孢屬（Neopestalotiopsis）和小不整球殼屬（Plectosphaerella）。灰葡萄孢是一種典型的死體營養(yǎng)型病原真菌，寄主范圍很廣。研究發(fā)現(xiàn)，在多花報春（Primulax polyantha）的幼苗上接種灰葡萄孢，一般在植株開花之前不會表現(xiàn)出癥狀;附著在種子表面的灰葡萄孢孢子侵入植物體內后可以在萵苣體內生長，但不引起癥狀;入侵植物矢車菊（Centaurea stoebe）中也發(fā)現(xiàn)了內生性生長的灰葡萄孢[24-26]?？梢姡参锊≡婢谥参矬w內進行內生性生長的現(xiàn)象是普遍存在的，也許可以將它們視為一類特殊的“內生真菌”;但在特定條件下，尤其是植物的抗性受到削弱時，它們就會促使植物產(chǎn)生癥狀[9]。

本研究采用傳統(tǒng)的病菌分離方法從健康草莓根、莖、葉部獲得了真菌1個門4個屬中的14株菌株和細菌3個門6個屬中的14株菌株，其中細菌內生菌的多樣性高于真菌類群;3個器官中根部內生菌的多樣性程度最高;芽孢桿菌（Bacillus）和葡萄孢屬（Botrytis）是豐度較高的2個內生菌屬。本研究分析了草莓體內可培養(yǎng)真菌和細菌的分布情況、菌群結構及生物多樣性間的差異和豐富度，為草莓內生菌的開發(fā)利用奠定了基礎。

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