竇越超 張亞奎（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京潞河醫(yī)院，北京101100）

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種慢性退行性關(guān)節(jié)疾病，表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)和功能完整性的破壞以及炎癥反應(yīng)［1］。隨著全球人口老齡化的加劇，OA發(fā)病率逐年上升，已成為世界范圍內(nèi)疼痛、殘疾、縮短成人工作壽命的主要原因。目前尚無有效的防治方法，關(guān)節(jié)置換術(shù)是終末期OA的主要治療方法。大量研究表明在OA進(jìn)展過程中，過度的炎癥反應(yīng)與細(xì)胞凋亡相關(guān)，導(dǎo)致軟骨細(xì)胞的減少和內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡［2］。因此，如何提高軟骨細(xì)胞活力，抑制細(xì)胞凋亡，減輕炎癥反應(yīng)對(duì)OA防治意義重大。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類較保守的短鏈非編碼RNA，是細(xì)胞增殖、分化、炎癥反應(yīng)和凋亡等多種功能的關(guān)鍵調(diào)控因子，目前miR-195-5p、miR-206等多種miRNA已被證實(shí)參與OA的發(fā)生發(fā)展［3-4］。最近研究顯示，OA患者關(guān)節(jié)軟骨組織miR-31表達(dá)下調(diào)，然而其在OA進(jìn)展中的作用并未完全闡明［5］。IL-34是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新型炎癥細(xì)胞因子，已有研究顯示OA患者滑膜液中IL-34高表達(dá)與疾病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，阻斷IL-34功能可以減輕炎性關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度［6］。生物信息學(xué)分析顯示IL-34是miR-31的潛在功能性靶基因，但miR-31能否靶向IL-34參與OA進(jìn)展尚未可知。本研究通過IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞構(gòu)建OA細(xì)胞模型，探討miR-31靶向IL-34在OA軟骨細(xì)胞增殖、凋亡和炎癥反應(yīng)中的確切作用，以期為OA的防治提供新的理論依據(jù)［7］。

1 材料與方法

1.1 材料 健康SD大鼠購(gòu)自南京君科生物工程有限公司；DMEM-F12培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；IL-1β購(gòu)自美國(guó)Peprotech公司；TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Premix Ex Taq購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；miRNA模擬物陰性對(duì)照（miR-NC）、miR-31模擬物（miR-31 mimics）、miRNA抑制物陰性對(duì)照（anti-miR-NC）、miR-31抑制物（anti-miR-31）、空載體（pcDNA3.1）、IL-34過表達(dá)載體（pcDNA3.1-IL-34）由上海吉瑪制藥有限公司提供；LipofectamineTM2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；MTT試劑、二甲基亞砜、RIPA裂解液、Annexin V-FITC/PI雙染法細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒北京索萊寶生物科技有限公司；兔源P21、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）、IL-34和磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；TNF-α和IL-6 ELISA試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、模型構(gòu)建和實(shí)驗(yàn)分組［7］于超凈工作臺(tái)內(nèi)取正常大鼠雙側(cè)膝關(guān)節(jié)軟骨，采用含青鏈霉素雙抗的PBS液清洗，離心后棄去上清，用含20%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基于37℃、含5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。將正常軟骨細(xì)胞分為以下幾組：對(duì)照組，正常培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞；模型組，用10 ng/L的IL-1β處理軟骨細(xì)胞24 h；模型+miR-NC組，轉(zhuǎn)染miR-NC 48 h后再用IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞；模型+miR-31組，轉(zhuǎn)染miR-31 mimics 48 h后再用IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞。

為證實(shí)miR-31是通過調(diào)控IL-34表達(dá)進(jìn)而影響OA軟骨細(xì)胞的增殖、凋亡和炎癥因子表達(dá)，將miR-31 mimics分別與pcDNA3.1、pcDNA3.1-IL-34共轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞，再用IL-1β誘導(dǎo)24 h，依次記為模型+miR-31+pcDNA3.1組、模型+miR-31+pcDNA3.1-IL-34組。

1.2.2 RT-qPCR檢測(cè)miR-31和IL-34 mRNA的表達(dá) 收集按照實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行處理的各組細(xì)胞，Trizol法提取各組細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度和純度。利用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA，按照熒光定量試劑盒SYBR Premix Ex Taq說明書配置反應(yīng)體系，利用2-ΔΔCt法分析miR-31和IL-34 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。miR-31正向引物5′-GCGGCGGAGGCAAGATGCTGGC-3′，反向引物5′-AGGCAAGATGCTGGCATAGCT-3′；IL-34正向引物5′-AATCCGTGTTGTCCCTCTTG-3′，反向引物5′-CAGCAGGAGCAGTACAGCAG-3′；GAPDH正向引物5′-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3′，反向引 物5′-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3′；U6正向引物5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′，反 向 引 物5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′。

1.2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 將對(duì)數(shù)期軟骨細(xì)胞接種到96孔板（5×103個(gè)/孔），按照實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，然后采用10 ng/L的IL-1β處理軟骨細(xì)胞24 h，每孔加入20μl的MTT溶液，孵育4 h后棄去上清液，每孔加入200μl的二甲基亞砜，振蕩15 min至結(jié)晶完全溶解，以無細(xì)胞空白孔調(diào)零后，在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（OD）值。存活率=實(shí)驗(yàn)組OD/對(duì)照組OD×100%。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 各組細(xì)胞按照實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行干預(yù)后，收集各組細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞后，采用適量結(jié)合緩沖液調(diào)整細(xì)胞密度的1×106個(gè)/ml的單細(xì)胞懸液。取100μl置于流式管內(nèi)，分別加入5μl的Annexin V-FITC和5μl的PI，避光孵育15 min，加入400μl結(jié)合液緩沖液，混勻，立即采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.2.5 Western blot檢測(cè)P21、Caspase-3和IL-34蛋白的表達(dá) 采用RIPA裂解液提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白檢測(cè)試劑盒進(jìn)行定量。蛋白樣品經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)到聚偏氟乙烯膜。用5%脫脂奶粉室溫封閉膜1 h。洗膜后，加入一抗4℃孵育過夜，洗膜后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG，洗膜后，加入化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行染色。利用Tanon 4200化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)分析圖像，以目的蛋白灰度值和GAPDH灰度值比值表示目的蛋白的表達(dá)水平。

1.2.6 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液中TNF-α和IL-6的表達(dá) 各組細(xì)胞按照實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行干預(yù)后，收集各組細(xì)胞上清液，按照TNF-α和IL-6檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作，測(cè)定TNF-α和IL-6的表達(dá)水平。加樣后，37℃溫育30 min，洗滌5次后，加入50μl的酶標(biāo)抗體，溫育、洗滌后，加顯色液顯色，檢測(cè)吸光度值并換算為TNF-α和IL-6的表達(dá)水平。

1.2.7 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-31對(duì)IL-34的靶向調(diào)控作用 構(gòu)建含有miR-31結(jié)合位點(diǎn)的野生型（WT-IL-34）和含有miR-31結(jié)合位點(diǎn)突變序列的突變型（MUT-IL-34）熒光素酶報(bào)告基因載體由上海吉瑪制藥有限公司提供。利用LipofectamineTM2000將miR-NC、miR-31 mimics分別與WT-IL-34或MUT-IL-34共轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞，經(jīng)IL-1β誘導(dǎo)24 h，采用熒光素酶報(bào)告基因試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞載體的熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，每組設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)并重復(fù)3次，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用±s表示。采用t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間均數(shù)比較，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步組間兩兩比價(jià)采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 炎癥因子IL-34在OA軟骨細(xì)胞的表達(dá) 見圖1，相較于對(duì)照組，模型組軟骨細(xì)胞中IL-34 mRNA的表達(dá)水平顯著增加（P＜0.05）。

2.2 過表達(dá)miR-31對(duì)OA軟骨細(xì)胞的細(xì)胞存活率凋亡的影響 見圖2，與對(duì)照組比較，模型組軟骨細(xì)胞P21和Caspase-3蛋白的表達(dá)顯著升高，細(xì)胞存活率顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高；與模型+miR-NC組比較，模型+miR-31組軟骨細(xì)胞P21和Caspase-3蛋白的表達(dá)顯著降低，細(xì)胞存活率顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.05）。

2.3 過表達(dá)miR-31對(duì)OA軟骨細(xì)胞中炎癥因子表達(dá)的影響 見圖3，與對(duì)照組比較，模型組軟骨細(xì)胞中miR-31的表達(dá)顯著降低，炎癥因子TNF-α和IL-6表達(dá)顯著升高；與模型+miR-NC組比較，模型+miR-31組軟骨細(xì)胞中miR-31的表達(dá)顯著升高，炎癥因子TNF-α和IL-6表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。

圖1 IL-34在OA軟骨細(xì)胞中的表達(dá)Fig.1 Expression of IL-34 in OA chondrocytes

圖2 過表達(dá)miR-31對(duì)OA軟骨細(xì)胞的細(xì)胞增殖（A）凋亡（B、C）及P21、Caspase-3蛋白表達(dá)（D、E）的影響Fig.2 Effect of overexpressing miR-31 on cell proliferation（A）apoptosis（B，C）and P21，Caspase-3 protein expression（D，E）of OA chondrocytes

2.4 miR-31靶向、調(diào)控IL-34 采用targetscan進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)顯示，miR-31與IL-34的3'-UTR區(qū)域存在部分特異性結(jié)合的位點(diǎn)，見圖4A。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示，與miR-NC和WT-IL-34共轉(zhuǎn)染組比較，miR-31和WT-IL-34共轉(zhuǎn)染組軟骨細(xì)胞的熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05）；與miR-NC和MUT-IL-34共轉(zhuǎn)染組比較，miR-31和MUT-IL-34共轉(zhuǎn)染組軟骨細(xì)胞的熒光素酶活性無顯著變化，見圖4B。Western blot檢測(cè)顯示，與miR-NC組比較，miR-31組軟骨細(xì)胞中IL-34在mRNA和蛋白水平的表達(dá)均顯著降低；與anti-miR-NC組比較，anti-miR-31組軟骨細(xì)胞中IL-34在mRNA和蛋白水平的表達(dá)均顯著升高（P＜0.05），見圖4C、D。說明miR-31靶向IL-34并負(fù)調(diào)控其表達(dá)。

2.5 過表達(dá)IL-34能逆轉(zhuǎn)miR-31對(duì)OA軟骨細(xì)胞的細(xì)胞存活和凋亡的影響 見圖5，與模型組+miR-31+pcDNA3.1組比較，模型組+miR-31+pcDNA3.1-IL-34組軟骨細(xì)胞IL-34、P21和Caspase-3蛋白的表達(dá)顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著升高，細(xì)胞存活率顯著降低（P＜0.05）。

圖3 過表達(dá)miR-31對(duì)OA軟骨細(xì)胞中炎癥因子表達(dá)的影響（±s，n=9）Fig.3 Effect of overexpressing miR-31 on expression of inflammatory factors in OA chondrocytes（±s，n=9）

圖4 miR-31靶向調(diào)控IL-34Fig.4 miR-31 targeted regulation of IL-34

2.6 過表達(dá)I L-34能逆轉(zhuǎn)miR-31對(duì)OA軟骨細(xì)胞中炎癥因子表達(dá)的影響 見圖6，與模型+miR-31+pcDNA3.1組比較，模型+miR-31+pcDNA3.1-IL-34組軟骨細(xì)胞TNF-α和IL-6的表達(dá)顯著升高（P＜0.05）。

圖5 過表達(dá)IL-34能逆轉(zhuǎn)miR-31對(duì)OA軟骨細(xì)胞增殖（A）、凋亡（B、C）及P21、Caspase-3蛋白表達(dá)（D、E）的影響Fig.5 Overexpression of IL-34 can reverse effect of miR-31 on OA chondrocyte proliferation（A），apoptosis（B，C）and P21，Caspase-3 protein expression（D，E）

圖6 OA軟骨細(xì)胞中炎癥因子的表達(dá)Fig.6 Expression of inflammatory factors in OA chondrocytes

3 討論

OA的發(fā)生是一個(gè)涉及多種因素的復(fù)雜過程，其中軟骨細(xì)胞在OA的發(fā)病機(jī)制中起著非常重要的作用。因此，研究軟骨細(xì)胞增殖、凋亡炎癥反應(yīng)的分子機(jī)制對(duì)尋找有效的OA治療方法具有潛在的意義。

近年來，miRNA在OA中的作用備受關(guān)注，許多特異性的miRNA被證實(shí)在OA發(fā)病過程中起關(guān)鍵作用［8］。例如，miR-15a-5p通過靶向血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子A來調(diào)節(jié)人OA軟骨細(xì)胞的活力和基質(zhì)降解［9］。miR-34a已被證實(shí)通過促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡和衰老來促進(jìn)OA的發(fā)展［10］。miR-31是腫瘤生物學(xué)中被廣泛研究的miRNA之一，其調(diào)控模式和功能因腫瘤類型的不同而不同［11-12］。最近研究表明miR-31可促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖和遷移，但miR-31在OA中的作用并未完全闡明［13］。本研究顯示IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞中miR-31的表達(dá)顯著降低，與既往研究結(jié)論基本吻合。進(jìn)一步功能分析顯示，在IL-1β誘導(dǎo)條件下過表達(dá)miR-31可減少促凋亡蛋白Caspase-3和增殖抑制蛋白P21的水平，提高軟骨細(xì)胞存活率，抑制細(xì)胞凋亡［14］。在OA發(fā)展過程中，大量細(xì)胞因子尤其是炎癥因子參與調(diào)節(jié)和維持關(guān)節(jié)軟骨的動(dòng)態(tài)平衡，炎癥因子的持續(xù)刺激促進(jìn)軟骨降解［15］。本研究中IL-1β誘導(dǎo)可顯著提高軟骨細(xì)胞中炎癥因子TNF-α和IL-6的水平，而過表達(dá)miR-31則減輕IL-1β對(duì)軟骨細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的促進(jìn)作用。提示miR-31對(duì)OA軟骨細(xì)胞具有保護(hù)作用。

IL-34是一種新型細(xì)胞因子，其通過與巨噬細(xì)胞集落刺激因子受體結(jié)合，調(diào)控單核吞噬細(xì)胞系細(xì)胞分化、增殖和存活［16］。先前研究顯示血清和滑膜液中IL-34水平的升高與膝OA患者的放射學(xué)和癥狀嚴(yán)重程度顯著相關(guān)［17］。在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血清IL-34也呈高表達(dá)，IL-34可能在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者骨質(zhì)疏松的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要作用［18］。此外，有報(bào)道稱赤雹根總皂苷通過抑制血液和滑膜組織中IL-34的表達(dá)可能對(duì)Ⅱ型膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎具有治療作用［19］。本研究顯示IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞中IL-34 mRNA的表達(dá)顯著升高，與miR-31表達(dá)模式呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。本研究顯示過表達(dá)miR-31可降低IL-34-3'UTR報(bào)告基因熒光素酶活性，且在軟骨細(xì)胞中負(fù)調(diào)控IL-34表達(dá)，與既往研究結(jié)論相吻合［20］。此外，本研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)IL-34還可逆轉(zhuǎn)miR-31對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞存活、凋亡以及TNF-α和IL-6表達(dá)的影響。提示miR-31通過靶向IL-34具有促進(jìn)OA軟骨細(xì)胞存活，抑制細(xì)胞凋亡，減輕炎癥損傷作用。

綜上所述，miR-31通過靶向IL-34可促進(jìn)OA軟骨細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡和炎癥因子分泌。因此，miR-31和IL-34有望成為OA治療的潛在靶點(diǎn)。