李 黎，唐李鳳，鐘雪梅，任 杰，張素杰，何川疆，鄒小廣△，許愛敏▲

1.新疆維吾爾自治區(qū)喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，新疆喀什 844000；2.石河子大學，新疆石河子 832000

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種可防、可治的常見病[1]。我國COPD的疾病負擔重，患病率呈逐年上升趨勢[2]。COPD病因和發(fā)病機制復雜，受環(huán)境和遺傳因素共同影響[3]。目前，研究結果表明COPD的分子發(fā)病機制主要是氣道炎性反應，且氧化應激可促使炎性反應相關基因表達[4]。Nrf2的激活是機體抵抗氧化應激的關鍵，它可調節(jié)多個抗氧化酶來保護細胞免受氧化損傷[5]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2啟動子區(qū)域的多態(tài)性與COPD易感性有關，圍繞Nrf2遺傳變異的研究可能開辟未來治療COPD的重要途徑[6]，然而，關于Nrf2基因多態(tài)性與維吾爾族人群COPD的相關性研究報道較少。本研究旨在評估Nrf2基因位點rs35652124、rs6721961單核苷酸多態(tài)性(SNP)與維吾爾族人群COPD易感性的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2017年9月至2019年9月在新疆維吾爾自治區(qū)喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院接受治療的203例COPD患者作為病例組，COPD的診斷符合《慢性阻塞性肺疾病診斷、治療與預防全球倡議》(GOLD)標準[1]。同期選擇新疆維吾爾自治區(qū)喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院199例維吾爾族體檢健康者作為對照組，均滿足以下條件:(1)胸部CT檢查結果顯示無器質性病變；(2)肺功能正常，第1秒用力呼氣容積占預計值百分比(FEV1% Pred)>80%，吸入400 μg沙丁胺醇30 min后第1秒用力呼氣容積與用力肺活量比(FEV1/FVC)>70%。所有研究對象均符合以下標準：(1)排除與氧化應激有關的疾病，如支氣管擴張、肺結核、肺間質纖維化、結節(jié)病、支氣管哮喘、糖尿病、心臟病等；(2)排除有各系統(tǒng)腫瘤病史；(3)均為維吾爾族，至少3代長期居住于喀什地區(qū)，各研究對象之間無任何血緣關系，且無外族通婚史。本研究通過新疆維吾爾自治區(qū)喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院倫理委員會審核批準，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1DNA提取 采集所有研究對象清晨空腹外周靜脈血，使用Greiner 基因組DNA提取試劑盒(德國，Greiner)按照說明書步驟從全血標本中提取DNA。

1.2.2SNP選擇 使用Sequenom公司Genotyping Tools 及MassARRAY Assay Design軟件設計待測SNP位點的PCR擴增引物及單堿基延伸引物，并送至中國上海天昊生物技術有限公司進行PCR擴增，引物序列見表1。

1.2.3基因檢測 采用多重PCR技術，在以下反應條件下擴增所選位點的基因序列：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火25 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)40次，最后72 ℃延伸3 min；然后將擴增產物用蝦堿性磷酸酶處理以除去反應中的dNTPs，再經過單堿基延伸引物(約20 bp)擴增SNP位點及樹脂純化，最后采用Sequenom-MassARRAY SNP技術進行SNP分型檢測[7]。

表1 Nrf2基因多態(tài)性位點引物序列

2 結 果

2.1Hardy-Weinberg平衡檢驗 分別對兩組研究對象中所檢測到的Nrf2基因多態(tài)性位點(rs6721961、rs35652124)的基因型分布頻率進行 Hardy-Weinberg平衡檢驗，結果顯示這兩個位點的基因分布均符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡(P>0.05)，具有群體代表性。

2.2病例組與對照組基線資料比較 病例組與對照組在性別、BMI、吸煙、動物粉塵暴露方面比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。兩組間年齡、SI、FEV1%Pred、用力肺活量占預計值百分比(FVC%Pred)比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

2.3兩組Nrf2基因多態(tài)位點的基因型及等位基因分布頻率比較 病例組與對照組rs6721961(G/T)、rs35652124(C/T)的基因型和等位基因分布頻率比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表2 兩組的基線資料比較

表3 兩組Nrf2基因多態(tài)位點的基因型和等位基因分布頻率比較[n(%)]

基因位點nrs6721961GGGTTTGT對照組199105(52.8)86(43.2)8(4.0)296(74.4)102(25.6)病例組203124 (61.1)71(35.0)8(3.9)319(78.6)87(21.4)χ2-2.9680.104-1.971OR(95%CI)-0.699(0.465～1.051)0.847(0.307～2.334)-0.791(0.571～1.097)P-0.0850.748-0.160

2.4多因素Logistic回歸分析 在校正性別、年齡、吸煙等混雜因素后，結果顯示rs35652124、rs6721961位點的基因型和等位基因分布頻率與COPD的關系差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表4。

表4 多因素Logistic回歸分析

續(xù)表4 多因素Logistic回歸分析

3 討 論

氧化應激損傷和抗氧化防御機制在COPD的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用，Nrf2是維持肺組織增生和存活最重要的抗氧化分子之一[8]。在氧化應激狀態(tài)下，位于細胞質的Nrf2分子轉移至細胞核內與抗氧化反應元件(ARE)結合，促進抗氧化劑基因表達[9]，進而發(fā)揮穩(wěn)定抗氧化作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2 表達下調可能是COPD發(fā)病的重要原因之一，激活Nrf2表達可能是未來治療COPD的重要途徑[10]。

SNP是人類遺傳變異最常見的來源，當關鍵區(qū)域突變時可能會影響基因功能。近年來，國內外已開展多項關于Nrf2啟動子區(qū)域SNP與COPD易感性的研究。例如，美國學者研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2啟動子區(qū)域的rs6721961(C/C)與極低出生體質量(VLBW)新生兒重度支氣管肺發(fā)育不良(BPD)風險降低有關[11]，而事實上幼年時期肺發(fā)育不良是COPD的重要危險因素之一[12]。此前，國內針對內蒙古地區(qū)蒙古族人群的研究發(fā)現(xiàn)，rs6721961位點與COPD遺傳易感性不相關[13]。但周小果[14]的研究卻發(fā)現(xiàn)，rs6721961(C/A)的A等位基因頻率是我國漢族COPD的危險因素。此外，Nrf2啟動子區(qū)域的rs35652124位點也顯示出與氧化應激性疾病風險的相關性，俄羅斯最近的一項研究發(fā)現(xiàn)，rs35652124位點SNP是吸煙人群COPD的危險因素，該位點AA基因型與FEV1明顯相關[15]。有趣的是，本研究證實Nrf2啟動子區(qū)基因位點rs35652124(C/T)、rs6721961(G/T)SNP與COPD的關系差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。本研究強調了不同人群COPD易感性的遺傳異質性。

本研究是首次在維吾爾族人群中進行Nrf2基因多態(tài)性與COPD相關性的研究，由于樣本地理來源的局限性，研究結果僅表明這兩個基因位點在喀什地區(qū)維吾爾族人群中存在差異。但由于本研究樣本有限，結果可能存在偏差。鑒于本研究得到的陰性結果，未來的研究將增加樣本量以充分了解更多的遺傳異質性。

綜上所述，本研究顯示Nrf2啟動子區(qū)基因位點rs35652124和rs6721961SNP與維吾爾族人群COPD發(fā)病無關，表明遺傳與環(huán)境等因素共同影響著COPD的發(fā)生、發(fā)展，基因多態(tài)性與疾病的相關性因地域或種族不同而存在一定差異，有待進一步深入研究。