李海軍，邊 沁，何先偉

四川省廣元市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川廣元 628000

子宮內(nèi)膜癌為原發(fā)于子宮內(nèi)膜的上皮性惡性腫瘤，具有發(fā)病因素多、機(jī)制尚不明確的特點(diǎn)，有研究報(bào)道其病死率已居惡性腫瘤的前10位[1]。近年一些學(xué)者探討了子宮內(nèi)膜癌前病變與子宮內(nèi)膜癌的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞免疫水平與疾病密切相關(guān)，考慮通過評估T淋巴細(xì)胞及腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞(TILs)相關(guān)分子標(biāo)志物的表達(dá)水平來防治子宮內(nèi)膜癌前病變的惡性發(fā)展[2-3]。TILs參與腫瘤微環(huán)境組成和局部免疫應(yīng)答，既往研究已證實(shí)TILs表達(dá)水平影響癌癥化療效果，考慮與相關(guān)標(biāo)記抗體對臨床指標(biāo)的影響有關(guān)[4]。腫瘤細(xì)胞浸潤后T淋巴細(xì)胞活化程度增加，程序性死亡因子1(PD1)表達(dá)上調(diào)，與程序性死亡配體1(PD-L1)相互作用后誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞凋亡，進(jìn)而下調(diào)機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答。另外，近年以PD-L1為靶點(diǎn)的治療藥物已在乳腺癌患者中得到應(yīng)用[5]。但目前關(guān)于TILs標(biāo)記抗體CD8、CD68、FoxP3、PD1、PD-L1與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生和發(fā)展關(guān)系的報(bào)道較少，且尚缺乏臨床數(shù)據(jù)支持。因此，本研究就此展開討論，明確子宮內(nèi)膜癌前病變惡性發(fā)展的預(yù)測因子，以期為子宮內(nèi)膜癌防治提供新的預(yù)測依據(jù)和治療靶點(diǎn)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2015年1月至2018年12月本院96例子宮內(nèi)膜癌患者納入子宮內(nèi)膜癌組，68例子宮內(nèi)膜正常女性納入正常子宮內(nèi)膜組。子宮內(nèi)膜癌患者年齡26～60歲，平均(42.25±4.14)歲，<49歲38例，≥49歲58例；病理學(xué)分級G1～G2級45例，G3級51例；國際抗癌聯(lián)盟分期Ⅰ期42例，Ⅱ～Ⅲ期54例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移22例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移74例；正常子宮內(nèi)膜來源女性年齡28～56歲，平均(41.85±4.08)歲，<49歲42例，≥49歲26例。子宮內(nèi)膜癌組與正常子宮內(nèi)膜組年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，有可比性。入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)病理學(xué)檢查確診；(2)子宮發(fā)育正常的女性；(3)年齡18～65歲；(4)入院前均未接受放療、化療或靶向治療；(5)未發(fā)生全身其他部位轉(zhuǎn)移；(6)卡氏( KPS)評分≥70分；(7)預(yù)計(jì)生存期超過1年。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他惡性腫瘤；(2)依從性差，不能定期隨訪；(3)有乳腺癌既往史；(4)過敏體質(zhì)或凝血功能異常；(5)溝通障礙或嚴(yán)重精神疾?。?6)臨床資料不完整，相關(guān)檢查不完善；(7)未完成治療；(8)因疾病惡化或出現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥需進(jìn)行其他治療。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)討論并通過，患者及家屬均簽署知情同意書。

1.2方法 采用RM2235組織切片機(jī)(德國徠卡)將所有包蠟組織切成4 μm連續(xù)切片，依次采用二甲苯(南通新能源物資有限公司)、枸櫞酸鈉緩沖液(北京泰澤瑞達(dá)科技有限公司)及3%過氧化氫溶液(北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行脫蠟、抗原修復(fù)、梯度乙醇水化，磷酸鹽緩沖液(PBS)(上海穎心實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司)漂洗，內(nèi)源性過氧化物酶活性消除；滴加小鼠抗人PD1、PD-L1、CD8、CD68、FoxP3多克隆抗體(濃度1∶100，購自美國Santa Cruz公司)4 ℃孵育過夜；PBS漂洗，滴加即用型生物素化二抗37 ℃孵育30 min；PBS漂洗，滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37 ℃孵育20 min；PBS漂洗，經(jīng)DAB顯色試劑盒(Solarlaio)顯色，蘇木精(湖南匯百侍生物科技有限公司)復(fù)染，梯度乙醇脫水，透明，中性樹脂(南京森貝伽生物科技有限公司)封片，DMM-440倒置顯微鏡(上海蔡康光學(xué)儀器有限公司)下觀察CD8、CD68、FoxP3、PD1、PD-L1表達(dá)。

1.3染色判定標(biāo)準(zhǔn) 由兩名具有執(zhí)業(yè)資格的病理科醫(yī)生采用雙盲法對結(jié)果進(jìn)行判斷和分析：每張切片中選取癌細(xì)胞數(shù)較多的5個(gè)高倍視野(SP，×400)，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞；染色強(qiáng)度：0分為不著色，1分為淡黃色，2分為深黃色，3分為棕黃色；陽性細(xì)胞百分率：1分為陽性細(xì)胞百分率0～30%，2分為陽性細(xì)胞百分率>30%；兩項(xiàng)之和進(jìn)行綜合判定：PD1、PD-L1表達(dá)量0～1分判定為-，2～6分判定為+[6]；CD8、CD68、FoxP3表達(dá)量≤3分判定為-，>3分判定為+[7]。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法，組間有序分類資料比較采用Ridit分析；采用Kendall′s tau-b法對等級資料進(jìn)行相關(guān)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1CD8、CD68、FoxP3在TILs細(xì)胞上的表達(dá)情況 CD8、CD68主要定位于TILs細(xì)胞膜上，F(xiàn)oxP3主要定位于TILs細(xì)胞核上，為棕黃色顆粒，CD8、CD68、FoxP3在正常子宮內(nèi)膜組織中呈強(qiáng)陽性表達(dá)，見圖1。子宮內(nèi)膜癌組織中CD8、CD68、FoxP3陽性率分別為33.33%(32/96)、36.46%(35/96)、37.50%(36/96)，明顯低于正常子宮內(nèi)膜組織中CD8、CD68、FoxP3陽性率[64.71%(44/68)、70.59%(48/68)、67.65%(46/68)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2PD1、PD-L1在TILs及T淋巴細(xì)胞上的表達(dá)情況 PD1、PD-L1主要定位于細(xì)胞膜或(和)細(xì)胞質(zhì)上，為棕黃色顆粒；PD1、PD-L1在子宮內(nèi)膜癌組織中TILs及T淋巴細(xì)胞上均呈陽性表達(dá)，見圖2、3。子宮內(nèi)膜癌組織中TILs上的PD1、PD-L1陽性率分別為 34.38%(33/96)、36.46%(35/96)，高于正常子宮內(nèi)膜組織中TILs上的PD1、PD-L1陽性率[14.71%(10/68)、20.59%(14/68)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。子宮內(nèi)膜癌T淋巴細(xì)胞上的PD1、PD-L1陽性率分別為16.67%(16/96)、19.79%(19/96)，與正常子宮內(nèi)膜組織T淋巴細(xì)胞上的PD1、PD-L1陽性率[17.65%(12/68)、16.18%(11/68)]比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

注：A1為正常子宮內(nèi)膜CD8表達(dá);A2為子宮內(nèi)膜癌CD8表達(dá);B1為正常子宮內(nèi)膜 CD68表達(dá)；B2為子宮內(nèi)膜癌CD68表達(dá)；C1為正常子宮內(nèi)膜FoxP3表達(dá);C2為子宮內(nèi)膜癌FoxP3表達(dá)。

注：A1為正常子宮內(nèi)膜PD1表達(dá)；A2為子宮內(nèi)膜癌PD1表達(dá)；B1為正常子宮內(nèi)膜PD-L1表達(dá)；B2為子宮內(nèi)膜癌PD-L1表達(dá)。

注：A1為正常子宮內(nèi)膜PD1表達(dá)；A2為子宮內(nèi)膜癌PD1表達(dá)；B1為正常子宮內(nèi)膜PD-L1表達(dá)；B2為子宮內(nèi)膜癌PD-L1表達(dá)。

2.3子宮內(nèi)膜癌患者PD1、PD-L1在TILs與T淋巴細(xì)胞上表達(dá)的相關(guān)分析 子宮內(nèi)膜癌患者PD1、PD-L1在TILs與T淋巴細(xì)胞上的陽性率無關(guān)(P>0.05)。見表1。

2.4CD8、CD68、FoxP3、PD1、PD-L1與子宮內(nèi)膜癌患者年齡及臨床病理特征的關(guān)系 CD8、CD68、FoxP3、PD1、PD-L1在病理學(xué)分級G3、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移子宮內(nèi)膜癌組織中的陽性率高于在病理學(xué)分級G1～G2、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移子宮內(nèi)膜癌組織中的陽性率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表1 PD1、PD-L1在TILs與T淋巴細(xì)胞上表達(dá)的相關(guān)分析(n)

表2 CD8、CD68、FoxP3、PD1、PD-L1與子宮內(nèi)膜癌患者年齡及臨床病理特征的關(guān)系(n)

項(xiàng)目nPD1(+)χ2PPD-L1(+)χ2P年齡(歲)1.241<0.050.658<0.05 <49381513 ≥49581822病理學(xué)分級6.520<0.056.021<0.05 G1～G24556 G3512829腫瘤分期3.025<0.050.424<0.05 Ⅰ421316 Ⅱ～Ⅲ542019淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移4.025<0.055.201<0.05 有221819 無74516

3 討 論

PD1、PD-L1可相互作用，共同對T淋巴細(xì)胞活性產(chǎn)生抑制，T淋巴細(xì)胞正常傳遞和激活功能下降后，可抑制腫瘤免疫機(jī)制進(jìn)而形成腫瘤微環(huán)境。二者在細(xì)胞組織中表達(dá)，具有影響細(xì)胞黏附、生長、凋亡、增殖、炎性反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)功能。王鈺聰?shù)萚8]發(fā)現(xiàn)，PD1、PD-L1在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中表達(dá)上調(diào)時(shí)，患者5年生存率更低。DURUISSEAUX等[9]采用抗PD1、PD-L1的人源化單克隆抗體治療肺癌后發(fā)現(xiàn)，T淋巴細(xì)胞功能和肺癌耐藥性均明顯升高，提示PD1、PD-L1可誘導(dǎo)癌細(xì)胞耐藥。以上研究表明，PD1、PD-L1可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)展。目前，抗PD1、PD-L1的人源化單克隆抗體已獲得批準(zhǔn)用于治療轉(zhuǎn)移性尿路上皮癌及三陰性乳腺癌等，藥物安全性試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)PD1、PD-L1陽性表達(dá)時(shí)治療客觀緩解率更高[10]。因此，推測進(jìn)行PD1、PD-L1表達(dá)的監(jiān)測對于疾病發(fā)展的預(yù)測有重要價(jià)值。本研究結(jié)果顯示，PD1、PD-L1在子宮內(nèi)膜癌組織中TILs及T淋巴細(xì)胞上均呈陽性表達(dá)，且子宮內(nèi)膜癌組織中TILs上的PD1、PD-L1陽性率明顯高于正常子宮內(nèi)膜組織中TILs上的PD1、PD-L1陽性率。進(jìn)一步分析二者與子宮內(nèi)膜癌病理特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)當(dāng)PD1、PD-L1陽性率升高時(shí)，病理分級越高，更易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。這與國內(nèi)學(xué)者田大偉等[11]的研究結(jié)果基本一致，PD1、PD-L1可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長和增殖。另外，本研究中PD1、PD-L1陽性率低于PRAT等[12]的報(bào)道，考慮與本研究樣本量較少有關(guān)。

TILs包括T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和NK 細(xì)胞，當(dāng)T淋巴細(xì)胞通過激活而聚集后可刺激PD1/PD-L1途徑逃脫免疫系統(tǒng)清除腫瘤細(xì)胞。本研究中CD8、CD68、FoxP3和PD1、PD-L1在子宮內(nèi)膜癌中均呈陽性表達(dá)。另外，T淋巴細(xì)胞中PD1、PD-L1陽性率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說明T淋巴細(xì)胞中的PD1、PD-L1表達(dá)數(shù)量并不能決定癌癥的發(fā)生和發(fā)展。沈輝等[13]的研究結(jié)果顯示，TILs比例較高的乳腺癌患者經(jīng)化療或分子靶向治療后，高TILs表達(dá)患者無病生存期高于低TILs表達(dá)患者。ZHU等[14]的研究指出，CD8、CD68、FoxP3在膀胱癌組織切片中陽性率低于正常膀胱組織。本研究結(jié)果顯示，CD8、CD68、FoxP3陽性率越高，病理分級越高，且存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，與上述研究結(jié)果一致。分析其作用機(jī)制可得，腫瘤患者在接受化療藥物治療后，腫瘤細(xì)胞會(huì)釋放出腫瘤相關(guān)抗原，從而觸發(fā)對腫瘤細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)。CD68為一類可檢測人體組織中巨噬細(xì)胞的分子標(biāo)記物，可調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞浸潤導(dǎo)致的血管新生、癌浸潤深度、病理分期等的發(fā)展。CD8、CD68、FoxP3高表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答反應(yīng)相關(guān)，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞壞死，進(jìn)而提高治療客觀緩解率。李國等[15]的研究結(jié)果顯示，向機(jī)體回輸CD8+T淋巴細(xì)胞型細(xì)胞因子后，腫瘤微環(huán)境中CD4+TILs抗腫瘤作用增強(qiáng)。

綜上所述，PD1、PD-L1在子宮內(nèi)膜癌組織中呈高表達(dá)，而CD8、CD68、FoxP3呈低表達(dá)，且與子宮內(nèi)膜癌臨床病理特征關(guān)系密切，考慮可通過人為干預(yù)治療改變PD1、PD-L1比例，增強(qiáng)患者免疫調(diào)節(jié)能力，為治療子宮內(nèi)膜癌提供新的策略依據(jù)。但由于研究時(shí)間短，本研究未對患者的長期生存率進(jìn)行分析，暫不能明確PD1、PD-L1靶向治療藥物的有效性，關(guān)于PD1、PD-L1靶向治療藥物的應(yīng)用和開展仍需在臨床中進(jìn)一步探討。