李 歡，韓素桂，董宇曦

河北省唐山市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北唐山 063001

乙型肝炎病毒(HBV)相關(guān)原發(fā)性肝癌是我國常見的四大惡性腫瘤之一，病死率為10%左右，具有進(jìn)展快、預(yù)后差、侵襲性強(qiáng)的特點(diǎn)。HBV相關(guān)原發(fā)性肝癌的發(fā)病機(jī)制與感染HBV、食用黃曲霉素污染的食物、酗酒及飲用藍(lán)綠藻毒素污染的水源有關(guān)[1]，由于其發(fā)病速度比較快，大多數(shù)患者在就診時(shí)已經(jīng)發(fā)生了癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，發(fā)展進(jìn)程已經(jīng)進(jìn)入中期和晚期，因而很難進(jìn)行有效的治療，所以早期的診斷和預(yù)防非常重要[2-3]。巨噬細(xì)胞移動抑制因子(MIF)是來源于T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子，它能影響腫瘤細(xì)胞和單核-巨噬細(xì)胞的趨化、游走，在促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞浸潤和轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮著重要的作用[4]。高爾基體糖蛋白73(GP73)是一種與HBV相關(guān)原發(fā)性肝癌關(guān)系密切的高爾基跨膜糖蛋白，在正常的肝臟組織中表達(dá)較少，甚至不表達(dá)，在發(fā)生病變的肝細(xì)胞中水平較高。有研究表明，GP73是一個(gè)具有很大潛在價(jià)值的HBV相關(guān)原發(fā)性肝癌標(biāo)志物，具有較高的靈敏度和特異度[5-6]。維生素K缺乏或拮抗誘導(dǎo)的異常蛋白Ⅱ(VPIKA-Ⅱ)中含有γ-羧基谷氨酸結(jié)構(gòu)，當(dāng)該結(jié)構(gòu)不完全羧化時(shí)，人體的凝血功能會發(fā)生異常，在HBV相關(guān)原發(fā)性肝癌中呈現(xiàn)高表達(dá)[7]。本研究分析了HBV相關(guān)原發(fā)性肝癌患者外周血MIF、GP73、VPIKA-Ⅱ的表達(dá)及意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2019年3月至2020年4月本院收治的72例HBV相關(guān)原發(fā)性肝癌患者納入HBV相關(guān)原發(fā)性肝癌組，其中男38例，女34例；年齡46～75歲，平均(63.68±7.57)歲；病程2～5年，平均(3.68±1.07)年；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移32例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移40例；按TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，分為Ⅰ～Ⅱ期34例，Ⅲ～Ⅳ期38例，按腫瘤最大徑分為≤5 cm 36例，>5 cm 36例；按腫瘤數(shù)量分為≤2個(gè)35例，>2個(gè)37例。HBV相關(guān)原發(fā)性肝癌組納入標(biāo)準(zhǔn)：符合2001年中國抗癌協(xié)會肝癌專業(yè)委員會修訂的《原發(fā)性肝癌的臨床診斷與分期標(biāo)準(zhǔn)》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]；經(jīng)病理學(xué)、影像學(xué)確診為HBV相關(guān)原發(fā)性肝癌；1個(gè)月內(nèi)未進(jìn)行過任何抗癌治療。選擇在本院進(jìn)行健康體檢的72例志愿者納入健康對照組，其中男35例，女37例；年齡41～78歲，平均(62.63±11.47)歲。選擇72例無HBV感染的原發(fā)性肝癌患者納入無HBV感染原發(fā)性肝癌組，其中男36例，女36例；年齡40～76歲，平均(61.05±11.15)歲；病程2～4年，平均(3.16±0.64)年。所有研究對象排除標(biāo)準(zhǔn)：丙型肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒感染；患有酒精性肝病、自身免疫性肝病、遺傳代謝性肝病、藥物性肝病和重度脂肪肝；有轉(zhuǎn)移性肝癌和其他腫瘤；心、肺、肝、腎功能不全；孕婦及哺乳期女性；有消化道出血等并發(fā)癥。3組研究對象的性別、年齡比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。所有研究對象均自愿參與本研究，并簽署知情同意書，本研究經(jīng)過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)后進(jìn)行。

1.2方法

1.2.1HBV檢測方法 采用一次性無菌注射器采集所有研究對象2 mL靜脈血置入無菌的干燥試管中，在25 ℃環(huán)境下放置60 min，4 000 r/min離心5 min，抽取上層血清，將其轉(zhuǎn)移至2 mL的滅菌離心管中，用一對乙型肝炎病毒特異性引物和一條乙型肝炎病毒特異性熒光探針，再配上PCR反應(yīng)液、耐熱的DNA聚合酶和4種脫氧核苷酸單體等成分來檢測HBV，將上清液放入離心機(jī)中1 min，按順序放入擴(kuò)增儀微孔中，設(shè)計(jì)循環(huán)條件為93 ℃45 s 10個(gè)循環(huán)，然后讀取結(jié)果，結(jié)果>103copy/mL為陽性。

1.2.2MIF、VPIKA-Ⅱ、GP73水平檢測 所有研究對象空腹?fàn)顟B(tài)下，采集3 mL靜脈血，離心半徑13.5 cm，3 000 r/min離心5 min。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測MIF、VPIKA-Ⅱ、GP73水平，取50 mmol/L的碳酸鹽緩沖液對MIF、VPIKA-Ⅱ、GP73進(jìn)行稀釋，加入聚苯乙烯的反應(yīng)孔中，再進(jìn)行加蓋處理，在4 ℃環(huán)境下等待24 h，第2天將其洗滌3次，拋干，在每個(gè)反應(yīng)孔中均加入pH值為7.4、濃度為0.02 mol/L的Tris-HCl緩沖液，再次在42 ℃環(huán)境下等待60 min，將液體移除并拋干，在每個(gè)反應(yīng)孔中加入0.1 mol/L的Na2HPO4,0.05 mol/L的枸櫞酸混勻，并且加入0.1 mL的領(lǐng)苯二胺，遮光處理20 min，再次加入0.1 mol/L的Na2HPO4，終止反應(yīng)，再使用專業(yè)的曲線制作軟件，在波長450 nm酶標(biāo)儀上讀取各孔的吸光度(A)值，以MIF水平為橫坐標(biāo)，A值為縱坐標(biāo)，最后得出MIF、VPIKA-Ⅱ、GP73水平。

2 結(jié) 果

2.13組研究對象MIF、GP73、VPIKA-Ⅱ水平比較 與健康對照組比較，無HBV感染原發(fā)性肝癌組、HBV相關(guān)原發(fā)性肝癌組MIF、GP73、VPIKA-Ⅱ水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與無HBV感染原發(fā)性肝癌組比較，HBV相關(guān)原發(fā)性肝癌組MIF、GP73、VPIKA-Ⅱ水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.2有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移HBV相關(guān)原發(fā)性肝癌組患者M(jìn)IF、GP73、VPIKA-Ⅱ水平比較 HBV相關(guān)原發(fā)性肝癌組中，與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者比較，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者M(jìn)IF、GP73、VPIKA-Ⅱ水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表1 3組研究對象MIF、GP73、VPIKA-Ⅱ水平比較

表2 有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移HBV相關(guān)原發(fā)性肝癌組患者M(jìn)IF、GP73、VPIKA-Ⅱ水平比較

2.3不同TNM分期HBV相關(guān)原發(fā)性肝癌組患者M(jìn)IF、GP73、VPIKA-Ⅱ水平比較 HBV相關(guān)原發(fā)性肝癌組中， 與Ⅰ～Ⅱ期患者比較，Ⅲ～Ⅳ期患者M(jìn)IF、GP73、VPIKA-Ⅱ水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 不同TNM分期HBV相關(guān)原發(fā)性肝癌組患者M(jìn)IF、GP73、VPIKA-Ⅱ水平比較

2.4不同腫瘤最大徑HBV相關(guān)原發(fā)性肝癌組患者M(jìn)IF、GP73、VPIKA-Ⅱ水平比較 HBV相關(guān)原發(fā)性肝癌組中，與腫瘤最大徑≤5 cm的患者比較，腫瘤最大徑>5 cm的患者M(jìn)IF、GP73、VPIKA-Ⅱ水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 不同腫瘤最大徑HBV相關(guān)原發(fā)性肝癌組患者M(jìn)IF、GP73、VPIKA-Ⅱ水平比較

2.5不同腫瘤數(shù)量HBV相關(guān)原發(fā)性肝癌組患者M(jìn)IF、GP73、VPIKA-Ⅱ水平比較 HBV相關(guān)原發(fā)性肝癌組中，與腫瘤數(shù)量≤2個(gè)患者比較，腫瘤數(shù)量>2個(gè)患者M(jìn)IF、GP73、VPIKA-Ⅱ水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表5。

表5 不同腫瘤數(shù)量HBV相關(guān)原發(fā)性肝癌組患者M(jìn)IF、GP73、VPIKA-Ⅱ水平比較

2.6HBV相關(guān)原發(fā)性肝癌患者中MIF、GP73、VPIKA-Ⅱ的相關(guān)性 HBV相關(guān)原發(fā)性肝癌患者中，MIF與GP73呈正相關(guān)(r=0.240，P=0.042)；MIF與VPIKA-Ⅱ呈正相關(guān)(r=0.368，P=0.002)；GP73與VPIKA-Ⅱ呈正相關(guān)(r=0.240，P=0.042)。

3 討 論

HBV相關(guān)原發(fā)性肝癌是在肝細(xì)胞或者肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞發(fā)生的惡性腫瘤，近年來，我國HBV相關(guān)原發(fā)性肝癌的發(fā)生率和病死率逐年上升，嚴(yán)重危害人們健康[9-10]。HBV相關(guān)原發(fā)性肝癌的發(fā)病機(jī)制與亞硝胺類、偶氮芥類、有機(jī)氯農(nóng)藥、酒精等化學(xué)物質(zhì)有關(guān)，同時(shí)，肝小膽管中感染華支睪吸蟲刺激膽管上皮增生，也是導(dǎo)致HBV相關(guān)原發(fā)性肝癌發(fā)生的原因之一[11]。HBV相關(guān)原發(fā)性肝癌的發(fā)病比較隱匿，早期沒有明顯的癥狀，被發(fā)現(xiàn)時(shí)大多數(shù)患者的病情已經(jīng)進(jìn)入中期和晚期，因此，臨床上容易漏診和誤診[12]。本研究分析了外周血MIF、GP73、VPIKA-Ⅱ水平在HBV相關(guān)原發(fā)性肝癌中的表達(dá)及意義。

MIF是由下丘腦控制的多功能細(xì)胞因子，主要由T細(xì)胞分泌，此外，許多組織細(xì)胞能夠產(chǎn)生MIF，從而促成各種炎癥性疾病的出現(xiàn)，影響腫瘤細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞的趨化和游走[13-14]，在炎性反應(yīng)和腫瘤生長中發(fā)揮著雙重效應(yīng)，是調(diào)控HBV相關(guān)原發(fā)性肝癌發(fā)生的因子，同時(shí)也是抵抗腫瘤免疫防御系統(tǒng)和應(yīng)激反應(yīng)系統(tǒng)的因子，可有效地反映HBV相關(guān)原發(fā)性肝癌的惡性程度。有研究表明，MIF參與了血管生成，促進(jìn)了腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，可抑制自然殺傷細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，因此，MIF在HBV相關(guān)原發(fā)性肝癌患者中水平高于健康人群[15-17]。本研究顯示，MIF在HBV相關(guān)原發(fā)性肝癌患者中水平較高，可隨著淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移而逐漸升高，TNM分期越高，腫瘤越大，腫瘤數(shù)量越多，MIF表達(dá)越高，表明MIF可能成為診斷HBV相關(guān)原發(fā)性肝癌的一項(xiàng)重要指標(biāo)。

GP73是一種高爾基體特異性Ⅱ型跨膜蛋白，大多數(shù)的高爾基體膜蛋白在細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)倪^程中，參與蛋白及脂類的修飾反應(yīng)。GP73具有完整的跨膜結(jié)構(gòu)，由疏水的N-端、膜內(nèi)區(qū)域和膜外的C-端3部分組成。GP73也是早期近側(cè)高爾基復(fù)合體的固有膜蛋白，優(yōu)先在人體的上皮細(xì)胞表達(dá)[18]，同時(shí)，GP73還是診斷HBV相關(guān)原發(fā)性肝癌和評估術(shù)后復(fù)發(fā)病情的標(biāo)志物，具有較高的靈敏度和特異度。GP73在良性和惡性肝病患者中的表達(dá)均升高，在HBV相關(guān)原發(fā)性肝癌患者中GP73水平最高，是良性肝病患者的20倍[16]。有研究表明，GP73在正常的肝細(xì)胞中不表達(dá)或者微量表達(dá)，在慢性肝炎或者酒精性肝硬化患者中GP73水平會隨著疾病的發(fā)展逐漸增加，當(dāng)肝細(xì)胞發(fā)生癌變或者攜帶HBV感染時(shí)，GP73血清水平會明顯升高[19]。本研究結(jié)果顯示，GP73在HBV相關(guān)原發(fā)性肝癌組中的水平明顯高于健康對照組，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移HBV相關(guān)原發(fā)性肝癌患者中水平較高，隨著TNM分期升高、腫瘤變大和腫瘤數(shù)量增多，GP73水平也逐漸升高，提示GP73可能參與HBV相關(guān)原發(fā)性肝癌的發(fā)生。

VPIKA-Ⅱ是因維生素K缺乏而誘生的一種異常凝血酶，因?yàn)槠涔劝彼釁^(qū)域中的一個(gè)或者多個(gè)谷氨酸殘基不能被羧化為γ羧基谷氨酸，所以其不具有正常的凝血酶原功能[20]，同時(shí)，γ谷氨酸羧化酶需要在維生素K與低密度蛋白結(jié)合下形成復(fù)合物，通過肝細(xì)胞膜上的特異性受體進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)與γ谷氨酸羧化酶的活化位點(diǎn)相結(jié)合，進(jìn)而形成具有活性的γ谷氨酸羧化酶。HBV相關(guān)原發(fā)性肝癌細(xì)胞不具有正常的細(xì)胞膜受體，以及維生素K的缺乏和γ谷氨酸羧化酶的不足是VPIKA-Ⅱ升高的原因，也是形成HBV相關(guān)原發(fā)性肝癌的原因[21]。本研究結(jié)果顯示，VPIKA-Ⅱ在HBV相關(guān)原發(fā)性肝癌患者中呈現(xiàn)高表達(dá)，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中的水平較高，TNM分期的不同，腫瘤大小的不同，腫瘤數(shù)量的不同，VPIKA-Ⅱ的水平也不同，因此，VPIKA-Ⅱ可能為檢測HBV相關(guān)原發(fā)性肝癌的一項(xiàng)重要指標(biāo)。經(jīng)過Pearson相關(guān)分析，MIF與GP73呈正相關(guān)，MIF與VPIKA-Ⅱ呈正相關(guān)，GP73與VPIKA-Ⅱ呈正相關(guān)，說明MIF、GP73、VPIKA-Ⅱ均在HBV相關(guān)原發(fā)性肝癌患者的診斷中起著重要作用。

綜上所述，MIF、GP73、VPIKA-Ⅱ在HBV相關(guān)原發(fā)性肝癌中的水平明顯升高，與HBV相關(guān)原發(fā)性肝癌患者有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、腫瘤大小和腫瘤數(shù)量關(guān)系密切，三者均參與HBV相關(guān)原發(fā)性肝癌的發(fā)生，對HBV相關(guān)原發(fā)性肝癌的診斷具有非常重要的作用。