張素華，徐月新，傅 丹

江蘇省蘇北人民醫(yī)院產前診斷中心，江蘇揚州 225001

羊水細胞染色體核型分析技術是診斷胎兒染色體異常的金標準，但其檢測周期長、分辨率較低，無法檢出5 Mb以下的基因組拷貝數變異(CNVs)。染色體微陣列分析(CMA)為目前主要用于全基因組范圍CNVs檢測的技術[1]。然而，該技術成本較高，通量較低，實驗程序較復雜，因此限制了其在產前診斷中的大規(guī)模使用。而且CMA探針覆蓋范圍有限，導致一部分致病性CNVs可能無法被檢出[2-3]。下一代測序(NGS)技術的出現，使得CNVs的檢測范圍更廣、通量更大、費用更低，報告周期更短，而且所需DNA量更少，臨床適用性更強[4-6]。雖然國內外學者對基因組拷貝數變異測序(CNV-Seq)技術做了一些臨床應用探討[7-9]，但國內對染色體核型分析聯合CNV-Seq技術的臨床應用報道尚不多見。因此，本研究選取了2017-2019年在本院進行產前診斷，并選擇兩種技術聯合檢測的316例病例進行回顧性分析，以探討羊水細胞染色體核型分析聯合CNV-Seq技術在臨床中的應用價值，現將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 2017年1月至2019年12月到本院產前診斷中心就診的具備高危指征的單胎妊娠且接受羊膜腔穿刺的孕婦共計316例，年齡15～48歲，中位年齡30歲；高齡組 (≥35歲)87例(27.53%)， 低齡組(<35歲)229例(72.47%)；孕周17～29周。產前診斷指征主要包括高齡(≥35歲)、產前篩查高風險、不良孕產史(包括胚胎停育、死胎、流產、胎兒畸形等非正常妊娠情況)、B超指標異常(包括結構畸形及軟指標異常)、高通量測序無創(chuàng)產前篩查(NIPS)提示高風險、染色體異常攜帶者、孕婦本人智力落后、孕早期接觸有毒物質、妊娠合并其他疾病等。所有接受羊水穿刺的孕婦及家屬均被充分告知羊水細胞染色體核型分析及CNVs-Seq的臨床意義、穿刺的風險、注意事項，在知情同意及自愿選擇的情況下簽署兩份知情同意書。

1.2儀器與試劑 GSL120全自動染色體核型掃描分析系統儀購自德國徠卡公司；Illumina NextSeq500平臺購自美國Illumina公司；Thermo Forma CO2培養(yǎng)箱購自美國Thermo Fisher公司；羊水培養(yǎng)基購自廣州白云山拜迪生物醫(yī)藥有限公司和碧艾生物科技有限公司；秋水仙素購自美國Sigma公司；吉姆薩染液購自上海樂辰生物科技有限公司；枸櫞酸三鈉、三羥甲基氨基甲烷、冰醋酸(分析純AR)、甲醇(分析純AR)均購自國藥集團；胰蛋白酶購自美國Amresco公司；基因組DNA抽提試劑盒購自德國QIAGEN公司；測序反應通用試劑盒購自杭州貝瑞和康基因診斷技術有限公司。

1.3方法

1.3.1羊水細胞染色體核型分析 抽取羊水標本后進行細胞培養(yǎng)及中期染色體制備，G顯帶后，每份標本至少計數20個分裂相，至少分析5個核型，至少達到320條帶水平，按照人類細胞遺傳學國際命名體制(ISCN2009)[10]標準對孕婦染色體命名，如有異常加倍計數和分析。

1.3.2CNV-Seq (1)標本采集、DNA提取、文庫構建及測序：通過羊膜穿刺術獲取胎兒羊水標本5 mL，通過短串聯重復序列(STR)排除母血污染，然后按照基因組DNA抽提試劑盒的說明書提取胎兒DNA，將50 ng基因組DNA經過隨機消化，末端補平，連接接頭；通過聚合酶鏈反應(PCR)進行富集、磁珠純化后得到DNA文庫，最后在Illumina NextSeq500平臺上對DNA文庫進行測序，采用FASTQ數據質控；檢測分析非整倍體及全基因組范圍CNVs。(2)數據判讀：采用ChAS2.0軟件，選取長度≥100 kb缺失/重復片段(可信度≥90%)進行分析。根據CNVs的性質不同，將其分為致病性、可能致病性、致病性未知(意義未明)、可能良性及良性CNVs 5類[11]。為了臨床數據分析的需要，本研究只對前3類CNVs進行分析[12]。數據分析參照在線公共數據庫，如OMIM、DGV、DECIPHER等，并查閱相關文獻進行CNVs的判讀。

2 結 果

本研究中316例孕婦同時進行羊水細胞染色體核型分析和CNV-Seq檢測，結果發(fā)現，兩種方法聯合檢測共發(fā)現49例異常，占受檢人數的15.51%；其中兩種方法同時發(fā)現異常共16例，結果見表1；羊水細胞染色體核型分析結果異常而CNV-Seq未檢出異常的有8例(主要是平衡易位，結果未顯示)；胎兒CNV-Seq檢測結果異常而染色體核型分析結果正常25例，結果見表2。羊水細胞染色體核型分析結果異常24例，占受檢總人數的7.59%，包括染色體數目異常13例，結構異常11例，結構異常中包括平衡易位8例，非平衡易位3例；CNV-Seq檢測結果異常41例，占受檢總人數的12.97%，包括染色體數目異常13例，結構異常28例，結構異常包括致病性CNVs 10例，可能致病性CNVs 7例，致病性未知CNVs 11例。

表1 16例羊水細胞染色體核型分析及CNV-Seq檢測均異常結果

續(xù)表1 16例羊水細胞染色體核型分析及CNV-Seq檢測均異常結果

表2 25例羊水細胞染色體核型分析正常及CNV-Seq檢測異常結果

續(xù)表2 25例羊水細胞染色體核型分析正常及CNV-Seq檢測異常結果

3 討 論

胎兒染色體數目或結構異常是導致胎兒畸形、流產、死胎及新生兒死亡的主要原因，傳統細胞遺傳學分析難以發(fā)現染色體亞顯微結構改變，即CNVs。目前為止，已明確由CNVs所致的染色體微缺失及微重復綜合征已達300余種[13-14]，綜合發(fā)病率約為1/600[13]，占染色體畸變所致出生缺陷的一半[15]。有研究表明，核型分析正常但超聲提示結構異常的胎兒中，有6%～7%存在明確致病或可能致病的CNVs[16-18]。

本研究對316例孕婦進行羊水細胞染色體核型分析和CNV-Seq檢測，結果發(fā)現，兩種方法聯合檢測共發(fā)現49例異常，占受檢總人數的15.51%。染色體核型分析結果異常的有24例，占受檢總人數的7.59%，CNV-Seq檢測結果異常的有41例，占受檢總人數的12.97%，該技術對致病或可能致病的染色體異常的檢出率為9.49%(30/316)，與染色體核型分析技術相比，提高了1.90%的異常檢出率，與其他研究報道結果相似[8,11-12]。

CNV-Seq技術可以檢測出所有的染色體非整倍體異常，如21三體、18三體、性染色體異常，并且對于核型分析無法判斷染色體來源的異常片段能更精準地定位，對臨床遺傳咨詢及胎兒的去留提供更有力的依據，如本研究中的12、14、15及16號孕婦的胎兒。12號孕婦的胎兒有一條非正常的21號染色體，且14號染色體發(fā)生了羅伯遜易位，經CNV-Seq檢測分析，發(fā)現為21號染色體大片段重復，符合21三體的診斷；14號孕婦的胎兒染色體核型分析見mar，但不能斷定是Y染色體，CNV-Seq檢測提示為Y染色體，臨床診斷為47,XYY；15號孕婦的胎兒父親存在著4號與16號的染色體平衡易位，所以胎兒染色體中發(fā)生了不平衡的易位，16號染色體和4號染色體分別發(fā)生了重復和缺失，后經數據庫查詢所引起的臨床表型和B超提示的胎兒先天性心臟病相符合，提示為致病性CNVs；16號孕婦NIPS提示胎兒其他染色體異?？赡?8號)，經CNV-Seq檢測，提示8號染色體q22.1q24.3區(qū)段存在約48.5 Mb大小的拷貝數重復，屬于8號染色體長臂三體綜合征，臨床表現包括身材矮小、特殊面容、隱睪等，因此該拷貝數變異也是致病性CNVs。本研究表1中的16例染色體核型分析及CNV-Seq檢測均異常結果的胎兒，只有1例47，XYY的胎兒在家屬知情同意后保留，其余胎兒家屬知情同意后均選擇引產。

CNV-Seq能夠發(fā)現染色體的微重復及微缺失。在羊水細胞染色體核型分析正常的標本中共發(fā)現了7例致病性CNVs，7例可能致病性CNVs，11例致病性未知的CNVs。7例致病性CNVs中17、18及19號孕婦胎兒的異常結果可以引起臨床常見的DiGeorge綜合征、貓叫綜合征及1p36微缺失綜合征，值得一提的是18號孕婦胎兒，CNV-Seq提示5p15.33p15.1缺失17.92 Mb，7q34q36.3重復17.76 Mb，這么大片段的缺失和重復在核型中為什么沒有明顯地表現出來？后來通過分析發(fā)現原來5號染色體短臂末端其實是7q34q36.3易位至此，兩個缺失和重復的片段很相似，而兩條7號染色體正常，所以羊水細胞染色體核型沒有發(fā)現異常。如果這例孕婦沒有選擇進行胎兒的CNV-Seq檢測，則很有可能導致貓叫綜合征的患兒出生，從而給家庭帶來沉重的精神和經濟壓力。此外，本研究還發(fā)現，可能致病性及致病性未知的CNVs所占比例也很高，這給臨床遺傳咨詢工作帶來了困難和挑戰(zhàn)，需要結合胎兒的其他檢查結果及胎兒父母CNVs的溯源檢測結果進行分析，如果可能致病性及致病性未知的CNVs源自胎兒父母，可能對孕婦的遺傳咨詢有所幫助[19]，如果是新發(fā)的CNVs，根據美國醫(yī)學遺傳學與基因組學學會(ACMG)的建議則需要進行隨訪[20]。而對于大多數的國內孕婦，由于CNV-Seq費用偏高，一般拒絕做進一步的胎兒父母溯源檢測，如果沒有特殊情況則選擇保留胎兒。

CNV-Seq技術不能檢測染色體的平衡易位及倒位[11,21]，這類攜帶者出生后可能無異常臨床表現，成年后也有生育能力，但因產生異常配子的可能性大，反復發(fā)生流產，且生育染色體異常患兒的風險也隨之增加。這類攜帶者生育期可根據實際情況選擇合適的生育方案，例如自然妊娠后進行孕期產前診斷，或者利用胚胎植入前遺傳學診斷技術選擇診斷正常的胚胎移植[7]。本研究中的8例染色體平衡易位未能被CNV-Seq技術檢測出，這也說明易位的過程中沒有發(fā)生染色體的微缺失和微重復，為胎兒的保留提供了有利的證據。此外，若該異常染色體遺傳來自臨床表型正常的雙親，則大部分胎兒表型仍可能為正常，若為新發(fā)變異則可能破壞或打斷原體內正?；虻谋磉_活性，導致疾病的發(fā)生，因而需要結合超聲及臨床檢測結果進行充分評估[22]。本研究中8例發(fā)生染色體平衡易位的胎兒均保留，目前隨訪均未見異常表型。

綜上所述，羊水細胞染色體核型分析和CNV-Seq檢測在產前診斷中各有優(yōu)缺點，遺傳學產前診斷結果的準確性依賴于分子遺傳學的檢測結果，在不增加流產的風險下，CNV-Seq檢測能為傳統的羊水細胞染色體核型分析技術提供有效的補充。兩者聯合檢測，能為孕婦提供更全面、更精準的產前診斷結果。