黃培芝，劉靈芝，汪 柳，趙鋼艷，吳 芳，何樹(shù)光

湖南中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖南株洲 412000

肝細(xì)胞肝癌(HCC)是常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，我國(guó)每年因肝癌死亡人數(shù)達(dá)35.81萬(wàn)人，HCC病死率達(dá)25.85/100 000[1]。雖然近年來(lái)外科手術(shù)、介入栓塞術(shù)等新的治療手段提高了臨床治療HCC的療效，改善了HCC患者的生存預(yù)后，但由于患者早期臨床表現(xiàn)不明顯，一旦出現(xiàn)肝區(qū)疼痛、鞏膜黃染、消瘦等表現(xiàn)時(shí)已處于中晚期，失去最佳手術(shù)時(shí)機(jī)[2]。甲胎蛋白(AFP)是常用的診斷HCC的腫瘤標(biāo)志物，但臨床上發(fā)現(xiàn)約40%的HCC患者AFP無(wú)異常變化，并且AFP在肝炎、肝硬化，以及睪丸癌等惡性腫瘤中也會(huì)出現(xiàn)表達(dá)升高的現(xiàn)象[3]。因此，深入探討HCC的疾病發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，尋找能夠早期診斷并具有較高特異度的血清腫瘤標(biāo)志物具有重要意義。基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(SDF-1)又稱CXCL12，位于10q11.21，編碼蛋白屬于基質(zhì)細(xì)胞衍生的α趨化因子家族成員，可充當(dāng)G蛋白偶聯(lián)受體、趨化因子受體4的配體，參與胚胎發(fā)育、免疫監(jiān)視及腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移等多種病理、生理過(guò)程[4]。有研究表明，腫瘤中存在SDF-1異常高表達(dá)的現(xiàn)象，并且能夠分泌到患者外周血中，檢測(cè)患者外周血SDF-1水平有利于腫瘤的早期診斷及預(yù)后判斷[5]。單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)也稱CCL2，基因位于17q12，該基因編碼蛋白屬于趨化因子CC亞家族成員，結(jié)構(gòu)上具有兩個(gè)相鄰的半胱氨酸殘基，能與趨化因子受體CCR2和CCR4結(jié)合，對(duì)單核細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞具有趨化活性，參與免疫調(diào)節(jié)和炎性反應(yīng)過(guò)程。有研究表明，腫瘤中MCP-1的異常表達(dá)升高能夠作為旁分泌生長(zhǎng)因子促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)腫瘤血管的新生，導(dǎo)致腫瘤的惡性進(jìn)展[6]。目前，關(guān)于SDF-1、MCP-1在肝癌患者血清中的表達(dá)水平及意義的相關(guān)報(bào)道較少，本研究通過(guò)分析SDF-1、MCP-1在肝癌患者血清中的表達(dá)，探討二者的臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年4月至2020年4月本院診治的179例HCC患者納入HCC組，其中男99例，女80例；年齡34～73歲，平均(43.6±6.2)歲；腫瘤最大徑<3 cm者96例，≥3 cm者83例；腫瘤TNM分期Ⅰ～Ⅱ期126例，Ⅲ～Ⅳ期53例；腫瘤分化：高中分化104例，低分化75例；伴遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移25例，無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移154例；AFP<400 ng/mL者101例，≥400 ng/mL者78例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)HCC的診斷參考2015年《原發(fā)性肝癌規(guī)范化病理診斷指南》診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]。(2)HCC患者均為首次診治，既往未接受過(guò)其他治療。(3)患者無(wú)嚴(yán)重肝腎功能障礙。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并肝膿腫、結(jié)核分枝桿菌感染等。(2)梅毒螺旋體抗體陽(yáng)性。(3)合并自身免疫性疾病。68例肝良性病變患者納入病例對(duì)照組，其中男41例，女27例；年齡33～77歲，平均(41.5±6.2)歲。62例體檢健康人員作為健康對(duì)照組，其中男35例，女27例；年齡32～78歲，平均(44.5±7.2)歲。3組間性別、年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)后進(jìn)行，患者及家屬對(duì)本研究知情同意并已簽字。

1.2方法 采集所有研究對(duì)象清晨空腹靜脈血5 mL，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，室溫靜置1 h，2 500 r/min離心10 min，離心半徑10 cm，吸取上層血清在—80 ℃冰箱保存。通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)各組研究對(duì)象血清SDF-1、MCP-1水平。人SDF-1、MCP-1 ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Abcam公司，批號(hào)分別為ab100637、ab179886，檢測(cè)嚴(yán)格按照相關(guān)說(shuō)明書操作。SDF-1檢測(cè)范圍為0.94～6.00 μg/L，MCP-1檢測(cè)范圍為4.70～300.00 pg/mL。采用電化學(xué)發(fā)光法應(yīng)用Cobase601電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀對(duì)血清AFP進(jìn)行檢測(cè)，AFP試劑盒購(gòu)自Roche公司。

2 結(jié) 果

2.1各組血清SDF-1、MCP-1水平比較 3組間血清SDF-1、MCP-1水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。HCC組血清SDF-1、MCP-1水平明顯高于病例對(duì)照組及健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。病例對(duì)照組與健康對(duì)照組血清SDF-1、MCP-1水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組血清SDF-1、MCP-1水平比較

2.2不同特征HCC患者血清SDF-1、MCP-1水平比較 TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、低分化HCC患者血清SDF-1、MCP-1水平明顯高于TNM分期Ⅰ～Ⅱ期、高中分化HCC患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。不同性別、年齡、腫瘤最大徑、血清AFP水平及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況患者血清SDF-1、MCP-1水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

2.3HCC組患者血清SDF-1與MCP-1水平的相關(guān)性 血清SDF-1與MCP-1水平在HCC患者中的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.612，P<0.001)。

表2 不同特征HCC患者血清SDF-1、MCP-1水平比較

2.4血清SDF-1、MCP-1單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)HCC的診斷價(jià)值 血清SDF-1、MCP-1單獨(dú)診斷時(shí)取約登指數(shù)最大時(shí)的值作為最佳截?cái)嘀?，二者同為?yáng)性或陰性時(shí)診斷為陽(yáng)性或陰性，一陰一陽(yáng)時(shí)，陽(yáng)性診斷參考SDF-1指標(biāo)(靈敏度較高)，陰性診斷參考MCP-1指標(biāo)(特異度較高)，并結(jié)合臨床醫(yī)師的觀點(diǎn)綜合判斷。血清SDF-1、MCP-1單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)的ROC曲線下面積(AUC)分別為0.839、0.741、0.913，見(jiàn)表3和圖1。

表3 血清SDF-1、MCP-1單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)HCC的診斷價(jià)值

圖1 血清SDF-1、MCP-1單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)HCC的診斷價(jià)值

3 討 論

肝癌是消化系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤，全球每年新發(fā)病例約78.2萬(wàn)，死亡例數(shù)約74.5萬(wàn)，并且肝癌的發(fā)病率有逐漸升高的趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅人類健康[8]。肝癌的病理類型分為HCC、肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌和混合型3種，其中以HCC最為常見(jiàn)。臨床上HCC的治療包括手術(shù)治療、介入治療、靶向藥物治療及免疫治療等，但部分患者即使經(jīng)積極治療后仍可出現(xiàn)復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致患者預(yù)后不佳[9]。因此，有必要研究HCC的發(fā)病機(jī)制，尋找新的HCC腫瘤標(biāo)志物。有學(xué)者報(bào)道，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與腫瘤微環(huán)境密切相關(guān)，特別是腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞，如T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等的功能異?？蓪?dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[10]。

SDF-1基因位于人類10號(hào)染色體，其編碼蛋白是一種趨化因子，主要由骨髓基質(zhì)細(xì)胞分泌，具有促進(jìn)骨髓、血管、淋巴管生成的作用。研究表明，乳腺癌、前列腺癌等腫瘤中存在SDF-1表達(dá)水平升高的現(xiàn)象，其能夠通過(guò)結(jié)合其配體CXCR4，促進(jìn)腫瘤的惡性進(jìn)展，與患者的不良預(yù)后密切相關(guān)[11]。本研究結(jié)果顯示，HCC組血清SDF-1水平明顯高于病例對(duì)照組及健康對(duì)照組，其機(jī)制可能與轉(zhuǎn)錄后表達(dá)調(diào)控異常有關(guān)。有學(xué)者報(bào)道，腫瘤中微小RNA-137表達(dá)水平降低，導(dǎo)致其SDF-1信使RNA的穩(wěn)定性升高，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞SDF-1的表達(dá)水平升高[11]。此外，TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、低分化HCC患者血清SDF-1、MCP-1水平明顯高于TNM分期Ⅰ～Ⅱ期、高中分化HCC患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明SDF-1的高表達(dá)可能參與促進(jìn)HCC中腫瘤細(xì)胞的惡性進(jìn)展。有研究結(jié)果顯示，腫瘤細(xì)胞中SDF-1能夠通過(guò)自分泌或旁分泌的方式，與細(xì)胞表面的CXCR4配體結(jié)合，進(jìn)而激活細(xì)胞內(nèi)核因子κB信號(hào)通路，促進(jìn)下游癌基因如c-myc的表達(dá)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞過(guò)度增殖[12-13]。此外，SDF-1還可通過(guò)激活蛋白激酶B，抑制促凋亡因子如Bax的表達(dá)，促進(jìn)抗凋亡基因如Bcl-2等的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞的程序性細(xì)胞死亡，導(dǎo)致腫瘤的分期升高[14-15]。

MCP-1基因位于人類17號(hào)染色體，其編碼蛋白包括76個(gè)氨基酸，可由正常組織細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及免疫細(xì)胞等分泌產(chǎn)生。近年來(lái)研究表明，在膠質(zhì)瘤、前列腺癌等腫瘤中均存在MCP-1表達(dá)升高的現(xiàn)象，其能夠結(jié)合其配體CCR2，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞內(nèi)磷脂酰肌醇3激酶的磷酸化激活，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的無(wú)限增殖[16-17]。本研究結(jié)果顯示，HCC組血清中MCP-1表達(dá)明顯高于病例對(duì)照組及健康對(duì)照組。分析其原因，可能是腫瘤微環(huán)境中的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞釋放MCP-1增多，導(dǎo)致血清中MCP-1水平升高，MCP-1 能夠招募大量單核細(xì)胞進(jìn)入腫瘤組織，形成免疫抑制的微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤的惡性進(jìn)展[18]。此外，HCC組患者血清MCP-1的表達(dá)與腫瘤TNM分期關(guān)系密切，其原因可能是MCP-1能結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面的CXCR4，激活蛋白激酶B信號(hào)通路，促進(jìn)下游c-myc等癌基因的表達(dá)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的惡性增殖，引起腫瘤分期升高[19]。此外，腫瘤細(xì)胞分泌的MCP-1能夠趨化單核巨噬細(xì)胞進(jìn)入腫瘤組織局部，進(jìn)而分泌產(chǎn)生血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β等，促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致HCC細(xì)胞的遷移、侵襲等生物學(xué)過(guò)程[20]。本研究進(jìn)一步分析血清SDF-1、MCP-1表達(dá)對(duì)HCC的診斷價(jià)值，結(jié)果表明SDF-1與MCP-1聯(lián)合檢測(cè)診斷HCC的靈敏度為82.1%，高于二者單獨(dú)檢測(cè)。以往研究表明，AFP對(duì)肝癌診斷的靈敏度為70%～80%，特異度為70%～90%。雖然本研究SDF-1、MCP-1單一指標(biāo)診斷HCC的特異度并不優(yōu)于AFP，但SDF-1、MCP-1聯(lián)合檢測(cè)的靈敏度明顯升高，表明聯(lián)合檢測(cè)血清SDF-1與MCP-1水平有可能成為潛在的HCC診斷標(biāo)志物，值得臨床深入研究。本研究中，HCC患者血清中SDF-1與MCP-1水平呈顯著正相關(guān)(r=0.612，P<0.001)。有學(xué)者報(bào)道，腫瘤處于一種缺氧的微環(huán)境中，腫瘤細(xì)胞缺氧導(dǎo)致缺氧誘導(dǎo)因子1A(HIF-1A)表達(dá)水平升高，HIF-1A能夠直接結(jié)合SDF-1、MCP-1的啟動(dòng)子區(qū)，促進(jìn)兩者的表達(dá)[21]。但HCC中SDF-1與MCP-1的相互作用機(jī)制有待深入研究。

綜上所述，HCC患者血清SDF-1、MCP-1表達(dá)上調(diào)，二者水平呈顯著正相關(guān)。HCC患者血清SDF-1、MCP-1水平與腫瘤TNM分期及腫瘤分化程度關(guān)系密切。聯(lián)合檢測(cè)血清SDF-1、MCP-1可能成為新的診斷HCC的方法。