杜偉鵬，陳向陽，呂高原，周 雨

1.河南省南陽市中心醫(yī)院檢驗科，河南南陽 473003；2.河南省鄭州市人民醫(yī)院檢驗科，河南鄭州 450000； 3.鄭州安圖生物工程股份有限公司，河南鄭州 450016

鏈球菌是臨床能夠分離到的常見致病菌之一[1]，尤其是肺炎鏈球菌、化膿鏈球菌、無乳鏈球菌等，對于人類，尤其是兒童的健康存在巨大威脅[2]。隨著目前廣譜抗菌藥物在臨床中的應(yīng)用日益增多，臨床上鏈球菌對于某些抗菌藥物的耐藥情況也日益嚴(yán)重[3]。因此，臨床分離鏈球菌屬的體外藥敏試驗檢測顯得尤為重要。目前，臨床上已經(jīng)有商業(yè)化的鏈球菌藥敏檢測試劑，并且已得到較為普遍的應(yīng)用，但是不同廠家或不同方法學(xué)之間存在較大差異[4-6]。本文通過考察一種國產(chǎn)商業(yè)化鏈球菌藥敏板與微量肉湯稀釋法對327株不同種類鏈球菌的體外藥敏試驗檢測，進而評估該新型商業(yè)化鏈球菌藥敏板卡的體外藥敏檢測性能，以期為臨床鏈球菌屬引起的感染性疾病提供更合理的用藥指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1材料 收集2018-2019年來源于鄭州市中心醫(yī)院、鄭州市人民醫(yī)院、南陽市中心醫(yī)院和河南省人民醫(yī)院的327株鏈球菌屬臨床菌株，包括肺炎鏈球菌107株，化膿鏈球菌41株，緩癥鏈球菌51株，無乳鏈球菌55株，停乳鏈球菌7株，星座鏈球菌13株，咽頰炎鏈球菌15株，草綠色鏈球菌8株，中間鏈球菌22株，血鏈球菌8株。標(biāo)準(zhǔn)菌株：肺炎鏈球菌(ATCC49619)。

1.2儀器與試劑 上海精科科技公司的酸度計，廈門致微公司的高壓滅菌鍋，瑞士METTLER TOLEDO公司的電子天平，金壇市科析儀器公司的振蕩儀，上海躍進公司的恒溫培養(yǎng)箱，法國生物梅里埃公司的比濁儀，美國SIGMA公司的快速離心機，中國海爾集團的-20 ℃冰箱，美國Thermo公司的移液器，美侖生物科技公司的頭孢曲松、利福平、氨芐西林、頭孢呋辛、美羅培南、青霉素、氯霉素、頭孢噻肟、阿莫西林/克拉維酸、頭孢吡肟、四環(huán)素、利奈唑胺、替加環(huán)素、左氧氟沙星、克林霉素、莫西沙星、甲氧芐啶、復(fù)方磺胺甲噁唑、萬古霉素、紅霉素抗菌藥物標(biāo)準(zhǔn)品，購自O(shè)xoid公司的M-H干粉、脫纖維綿羊血、礦物油，血瓊脂平板(鄭州安圖生物工程股份有限公司)，鏈球菌藥敏檢測試劑盒(比色/比濁法，鄭州安圖生物工程股份有限公司)，洛陽昊華公司的無水乙醇，國藥集團公司的二甲基亞砜。

1.3方法 使用血瓊脂平板對質(zhì)控菌株和臨床菌株進行活化，利用0.85%生理鹽水將各臨床菌株制備成0.5麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙?，根?jù)美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(CLSI)《需氧菌的稀釋法藥敏試驗方法》關(guān)于鏈球菌屬細菌藥敏試驗所用培養(yǎng)基制備的規(guī)定[7]，將M-H干粉按照要求的量充分溶解并調(diào)節(jié)pH值至7.0左右，121 ℃高溫高壓滅菌15 min，滅菌的M-H肉湯冷卻后，添加2.5%～5.0%的脫纖維綿羊血，混勻后備用。分別稱取頭孢噻肟等20種抗菌藥物標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)需要考核試劑的各種抗菌藥物濃度分布及CLSI標(biāo)準(zhǔn)對于肉湯稀釋法操作過程的嚴(yán)格規(guī)定，使用合適的溶解試劑進行抗菌藥物的溶解并加入96孔板內(nèi)，每孔加入10 μL的10倍于檢測濃度的抗菌藥物溶解液，并使用大型真空干燥箱進行快速干燥處理，保存?zhèn)溆?。微量肉湯稀釋法操作：?0 μL加血M-H肉湯加入96孔酶標(biāo)板；每種抗菌藥物進行3次平行試驗，將已制得的0.5麥?zhǔn)蠁挝毁|(zhì)控菌懸液稀釋200倍后，各取10 μL加入酶標(biāo)板各孔內(nèi)，滴加1滴礦物油液封并置于35～37 ℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。待評價鏈球菌藥敏試劑盒操作過程：取出1瓶培養(yǎng)液，向其中添加1滴顯色液和100 μL菌懸液，混勻后向120孔鏈球菌藥敏板每孔加入100 μL菌懸液，滴加礦物油后蓋上蓋子置于35～37 ℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。兩種操作均要求首先進行肺炎鏈球菌(ATCC49619)的質(zhì)控，合格后才能進行臨床菌株試驗。依據(jù)CLSI文件M100-S29標(biāo)準(zhǔn)，對藥敏試驗結(jié)果和敏感性結(jié)果進行記錄和統(tǒng)計分析。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 對兩種方法所測得的最小抑菌濃度(MIC)結(jié)果及菌株敏感性結(jié)果按照菌株分類進行統(tǒng)計學(xué)分析，采用SPSS23.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析處理。計數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，采用χ2檢驗進行比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。根據(jù)CLSI的M52標(biāo)準(zhǔn)[7]進行菌株敏感性比較分析[8]；統(tǒng)計出3種方法的基本一致性(EA，即不同MIC測定方法在±1個稀釋倍數(shù)范圍內(nèi)的結(jié)果一致性)和分類一致性(CA，即不同方法測定的菌株對抗菌藥物敏感性的一致性)，另外，對于菌株敏感性，需要進行非常重大誤差(VME，即耐藥誤判為敏感)、重大誤差(ME，即敏感誤判為耐藥)和微小誤差(mE，即中介報告為敏感或耐藥)結(jié)果的測定。美國食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定指出，CA≥90%、EA≥90%、VME≤1.50%、ME≤3.00%、mE<3.00%為可接受范圍。

2 結(jié) 果

2.1考核試劑盒與微量肉湯稀釋法EA測定結(jié)果 統(tǒng)計鏈球菌藥敏試劑盒與微量肉湯稀釋法的檢測結(jié)果，對其EA進行統(tǒng)計分析，按照CLSI標(biāo)準(zhǔn)對于不同方法學(xué)結(jié)果差異的規(guī)定，不同測定方法的MIC差值≤1個倍比梯度認(rèn)為是正確測定值。EA檢測結(jié)果見表1。新型鏈球菌藥敏板與“金標(biāo)準(zhǔn)”微量肉湯稀釋法共測定327株鏈球菌的體外藥敏檢測，在EA方面，按照測試結(jié)果總量統(tǒng)計，新型鏈球菌藥敏板與微量肉湯稀釋結(jié)果差異在±1個稀釋倍數(shù)內(nèi)的整體符合結(jié)果個數(shù)/總結(jié)果個數(shù)為6 509/6 540，整體EA為99.53%。對于所涵蓋的抗菌藥物種類：頭孢曲松、利福平、頭孢呋辛、青霉素、氯霉素、頭孢噻肟、阿莫西林/克拉維酸、頭孢吡肟、四環(huán)素、利奈唑胺、替加環(huán)素、左氧氟沙星、克林霉素、莫西沙星、萬古霉素、紅霉素的EA均為100.00%；氨芐西林EA為97.86%；美羅培南EA為96.94%；復(fù)方磺胺甲噁唑EA為97.55%；紅霉素/克林霉素誘導(dǎo)試驗EA為98.17%；對于所測臨床菌株，隨機選取10株進行結(jié)果重復(fù)性測試，檢測結(jié)果與已測結(jié)果一致。

表1 考核試劑盒與微量肉湯稀釋法EA測定結(jié)果

2.2考核試劑盒與微量肉湯稀釋法CA測定結(jié)果 對兩種測定方法的體外藥敏檢測的CA進行統(tǒng)計，結(jié)果表明，新型鏈球菌藥敏板與“金標(biāo)準(zhǔn)”微量肉湯稀釋法測定共進行327株鏈球菌的體外藥敏檢測，兩種方法的整體CA為97.40%，VME為0.09%，ME為0.59%，mE為1.92%。新型鏈球菌藥敏板與“金標(biāo)準(zhǔn)”微量肉湯稀釋法的CA測定結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 考核試劑盒與微量肉湯稀釋法CA測定結(jié)果[n(%)]

3 討 論

鏈球菌常分布于人體的口腔、鼻咽、眼部，少量存在于血液或腦脊液等體液中，常引起肺炎、支氣管炎、胸膜炎、腦膜炎、敗血癥等，尤其是對兒童的健康影響較大[9]。另外，隨著抗菌藥物應(yīng)用于鏈球菌感染的治療日益普遍，鏈球菌對抗菌藥物耐藥也逐漸增多[10]。因此，針對鏈球菌屬的體外藥敏檢測，對于臨床用藥的指導(dǎo)意義就顯得更加重要。

鏈球菌屬耐藥性的變遷，全國細菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)作為國家級的臨床細菌耐藥監(jiān)測機構(gòu)，出臺的全國細菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)技術(shù)方案也明確規(guī)定了鏈球菌屬細菌為必須進行監(jiān)測的抗菌藥物種類，比如對于分離自腦脊液的肺炎鏈球菌，必須監(jiān)測青霉素、萬古霉素、頭孢曲松(或頭孢噻肟)、美羅培南等抗菌藥物耐藥性變遷；對于分離自腦脊液以外的其他標(biāo)本類型的肺炎鏈球菌，必須監(jiān)測青霉素、紅霉素、克林霉素、左氧氟沙星或莫西沙星、復(fù)方磺胺甲噁唑等抗菌藥物的耐藥性變遷。因此，對于商業(yè)化的鏈球菌藥敏板卡，其能夠覆蓋的抗菌藥物種類必須包含全國細菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)技術(shù)方案規(guī)定的必須監(jiān)測的抗菌藥物種類，并且盡可能多地覆蓋鏈球菌屬細菌的檢測種類。

商業(yè)化藥敏板目前已經(jīng)在臨床體外藥敏檢測方面有比較普遍的應(yīng)用[11]，但是針對鏈球菌的體外藥敏檢測，由于鏈球菌對于營養(yǎng)物質(zhì)要求的特殊性，進口和國產(chǎn)的商業(yè)化藥敏板檢測性能參差不齊，不同種類試劑能夠檢測的鏈球菌種類差異也較大。目前，國內(nèi)臨床常用的鏈球菌藥敏進口檢測試劑盒有法國梅里埃的GP68型號和GP67型號藥敏卡、美國BD公司的PHOENIX SMIC/ID-2型號藥敏卡、美國貝克曼公司的PC33型號和PMIC29型號及美國賽默飛公司的Sensititre STP6F型號藥敏卡。法國梅里埃公司的GP68只能用來測定肺炎鏈球菌藥敏試驗，GP67只能用來檢測無乳鏈球菌藥敏試驗，其他種類的鏈球菌藥敏試驗均無法進行檢測。熊安英等[12]對Vitek-Compact肺炎鏈球菌GP68藥敏卡的性能評估指出，GP68藥敏板卡由于檢測原理缺陷，對青霉素、頭孢曲松、頭孢噻肟、美羅培南等藥敏試驗檢測結(jié)果出現(xiàn)假耐藥情況，需要使用其他方法復(fù)核測定結(jié)果，GP68其余抗菌藥物測定肺炎鏈球菌的EA和CA均>90.00%。美國BD公司鏈球菌專用SMIC/ID-2藥敏板條能夠檢測75種鏈球菌的藥敏試驗，包括了15種抗菌藥物；美國貝克曼公司MicroScan AutoScan-4 PC系列兩種板卡能夠?qū)︽溓蚓鷮龠M行檢測，但是不能覆蓋氨芐西林、克林霉素、紅霉素和四環(huán)素的敏感折點，PMIC29則不能覆蓋氨芐西林的敏感折點；美國賽默飛公司的Sensititre STP6F能夠檢測鏈球菌屬藥敏試驗結(jié)果，但是對于β溶血鏈球菌的檢測，板卡未包含克林霉素，因此需要使用其他方法來進行補充。MITTMAN等[13]對肺炎鏈球菌BD Phoenix與Vitek 2、MicroScan microstreps及藥敏試驗的比較研究指出，BD Phoenix與Vitek 2、MicroScan microstreps與微量肉湯稀釋的EA>95.00%，CA分別為95.50%、94.20%、98.70%，檢測性能良好。

另外，考慮到進口藥敏檢測產(chǎn)品與國產(chǎn)藥敏檢測產(chǎn)品比較，雖然性能方面能夠明顯優(yōu)于國產(chǎn)藥敏檢測產(chǎn)品，但是其使用成本太高，這也限制了進口試劑在部分臨床機構(gòu)的應(yīng)用；一旦國產(chǎn)藥敏檢測試劑能夠在產(chǎn)品檢測性能方面達到或接近進口產(chǎn)品檢測水平，國產(chǎn)藥敏檢測試劑能在解決臨床實際藥敏檢測問題的同時，明顯降低檢驗科微生物室的成本。

與紙片擴散法和E test法比較，商業(yè)化藥敏板能夠與自動化儀器設(shè)備進行配套，減少人工操作過程，能夠同時檢測多種抗菌藥物的體外藥敏情況，縮短藥敏試驗結(jié)果報告時間，但是菌株檢測范圍有一定限制，比如厭氧菌、對營養(yǎng)要求苛刻的少見菌目前還沒有商業(yè)化藥敏板實現(xiàn)對其的檢測。

本文考核的國產(chǎn)商業(yè)化鏈球菌藥敏試劑盒采用比濁法和比色法相結(jié)合的檢測方法學(xué)，板卡為120微孔設(shè)計，不僅覆蓋了全國細菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)技術(shù)方案規(guī)定的必須檢測抗菌藥物的種類，還能檢測替加環(huán)素、利福平等共19種抗菌藥物，各抗菌藥物能夠檢測濃度梯度平均數(shù)大于6個，實現(xiàn)2020年最新版CLSI標(biāo)準(zhǔn)折點全覆蓋，檢測更加精準(zhǔn)；考核試劑盒應(yīng)用改良的特殊鏈球菌培養(yǎng)基代替了“金標(biāo)準(zhǔn)”微量肉湯稀釋法所用的加血培養(yǎng)基(2.5%～5.0%裂解馬血或脫纖維綿羊血)，使用更加方便；另外，本國產(chǎn)鏈球菌藥敏板能夠同時用于肺炎鏈球菌、α-溶血和β-溶血鏈球菌等多種鏈球菌的藥敏試驗檢測，通用性強。

本文以微量稀釋法作為比對標(biāo)準(zhǔn)，研究了一種新型國產(chǎn)商業(yè)化鏈球菌藥敏板對于不同種類鏈球菌的體外藥敏檢測性能。研究表明，新型鏈球菌藥敏板與“金標(biāo)準(zhǔn)”微量肉湯稀釋法在測定結(jié)果的EA方面，整體符合結(jié)果個數(shù)/總結(jié)果個數(shù)為6 509/6 540，整體EA為99.53%，CA為97.40%，VME為0.09%，ME為0.59%，mE為1.92%。新型鏈球菌藥敏板與“金標(biāo)準(zhǔn)”在測定結(jié)果的CA方面比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，也能夠充分說明新型國產(chǎn)商業(yè)化鏈球菌平板具有良好的體外藥敏檢測性能，能夠滿足臨床檢測的需要。