華國(guó)勇，郭建琴，李 旻，張曉巖，湯 鋒，李潤(rùn)樂(lè)

(1.青海省人民醫(yī)院，青海 西寧 810007；2.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，青海 西寧 810001)

多房棘球絳蟲與其他寄生蟲一樣通過(guò)宿主獲取生命活動(dòng)所必須的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其代謝脂類和氨基酸的能力有限，因此需要從外界攝入糖類作為主要的能量來(lái)源。多房棘球絳蟲本身無(wú)消化道，通過(guò)體表吸收宿主環(huán)境中的葡萄糖并以糖原形式儲(chǔ)存，以此維持自身能量代謝進(jìn)行生命活動(dòng)。葡萄糖作為一種極性分子它不能以自由擴(kuò)散的方式通過(guò)細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)的疏水區(qū)，多數(shù)情況下需要葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GLUT)的協(xié)助[1，2]。GLUT1是目前所發(fā)現(xiàn)的分布最廣泛的轉(zhuǎn)運(yùn)體，負(fù)責(zé)組織與血液間葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)[3]。2018年Jun Matsumoto團(tuán)隊(duì)[4]研究發(fā)現(xiàn)多房棘球絳蟲攝取宿主葡萄糖的過(guò)程依賴EmGLUT1，如以葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白為抗原，能切斷多房棘球蚴能量來(lái)源從而抑制其增殖。本文擬對(duì)EmGLUT1結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，篩選其氨基酸序列中的非跨膜區(qū)域進(jìn)行串聯(lián)，設(shè)計(jì)序列插入到原核表達(dá)載體中用以表達(dá)及純化，獲得純度較高的重組表位肽，為后續(xù)疫苗研究尋找有效工具。

1.材料與方法

1.1 材料

pCzn1載體、Artic express表達(dá)菌株(Zoonbio)；限制性內(nèi)切酶Nde I和Xba I(Takara)；IPTG和氨芐青霉素鈉、質(zhì)粒提取試劑盒，蛋白胨、酵母粉、DNA純化回收試劑盒(Tiangen)；兔抗His抗體、山羊抗兔IgG抗體(Bioss)；Ni-NTA sepharose(Make Research Easy)。

1.2 方法

1.2.1EmGLUT1跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

使用生物信息學(xué)軟件TMHM(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)和TMpred(http：//www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)對(duì)EmGLUT1蛋白進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)在線預(yù)測(cè)。

1.2.2 表位肽的篩選及串聯(lián)設(shè)計(jì)

根據(jù)EmGLUT1蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果，刪除位于跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域的肽段，保留的表位肽段之間添加GS和KK氨基酸序列，以利于多肽鏈的空間構(gòu)象和保持抗原的特異性，防止表位肽之間互相干擾。將設(shè)計(jì)的EmGLUT1表位肽命名為GLEP。

1.2.3 pCzn1-GLEP質(zhì)粒構(gòu)建

參照前期實(shí)驗(yàn)方法[5，6]，對(duì)GLEP序列進(jìn)行大腸桿菌密碼子偏愛(ài)性優(yōu)化，并添加限制性內(nèi)切酶NdeI和XbaI酶切位點(diǎn)，序列如下(劃線區(qū)域?yàn)槊盖形稽c(diǎn))：

CATATGACCCATCTGCTGAATACCACCACACTGGGCAGTAATAGCAGCGAAATGCTGAAAGGTGCAAATGTTTCCAGTGATGGCAGCAACAGCGATGGTGTGGTTAATAAAATGCCATTTGTTCTGGTTAAAAAGCCGTCTCTGAATGGTCTGCTGAAAGGTGGTAGTATGCCTGAAACGAAAAACCGTACCTTTGATGAAGTGGCACGCGATCTGGCGTTTGGCAGCATTGTTGTTGGTAAACGTACAGCGGCACTGCAGAGCCCGGTTTTTACAAAAGAAGATGAAGAAGCGGCAACCGCACTGCGTCGTACCGATGATGATAGCAAAGTTGATGCGTAATCTAGA

上述序列送生工生物工程上海股份有限公司進(jìn)行合成，經(jīng)酶切、連接入pCzn1載體并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌TOP10后，挑選陽(yáng)性菌落并提取質(zhì)粒，采用測(cè)序及酶切法判斷質(zhì)粒pCzn1-GLEP構(gòu)建是否成功。

1.2.4 pCzn1-GLEP重組表達(dá)菌構(gòu)建及表達(dá)部位鑒定

1.2.5 GLEP可溶蛋白純化

將誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液離心(4℃，10000r/min，5min)，收集菌體用緩沖液洗滌3次，加入蛋白純化上樣緩沖液進(jìn)行超聲破碎(功率：70%；破碎3s暫停4s)，離心(4℃，10000r/min，10min)后收集上清用Ni-NTA-Sepharose親和層析法純化GLEP蛋白，獲得電泳純級(jí)的GLEP蛋白。使用His標(biāo)簽抗體對(duì)重組蛋白進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)。

2.結(jié)果

2.1 GLUT1蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

生物信息學(xué)軟件分析結(jié)果如圖1所示，EmGLUT1為12次跨膜蛋白，跨膜區(qū)域?yàn)?-30、59-81、94-116、121-143、121-143、148-170、148-170、264-286、301-323、332-354、369-391、404-423、433-452；細(xì)胞內(nèi)區(qū)域?yàn)?-7、82-93、144-147、203-263、324-331、392-403、453-509；細(xì)胞外區(qū)域?yàn)?1-58、117-120、171-179、287-300、355-368、424-432，根據(jù)分析結(jié)果刪除跨膜區(qū)域及12次跨膜細(xì)胞內(nèi)區(qū)域及氨基酸殘基小于5的序列區(qū)域，選定171-179、287-300、355-368和424-432跨膜胞外區(qū)及453-509胞內(nèi)區(qū)共5個(gè)肽段為研究對(duì)象。

圖1 GLUT1蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖

2.2 重組質(zhì)粒pCzn1-GLEP酶切及測(cè)序驗(yàn)證

重組質(zhì)粒pCzn1-GLEP的雙酶切驗(yàn)證顯示，大小約350 bp，與實(shí)際大小符合，且陽(yáng)性克隆序列測(cè)序結(jié)果與預(yù)期序列吻合度達(dá)100%(經(jīng)BLAST比對(duì))，如圖2～3所示。

M：DNA標(biāo)志物；1：pCzn1-GLEP陽(yáng)性克隆質(zhì)粒；2：pCzn1-GLEP經(jīng)Nde I和Xba I雙酶切后的質(zhì)粒

圖3 陽(yáng)性克隆序列比對(duì)結(jié)果圖

2.3 重組蛋白GLEP表達(dá)部位鑒定

將重組表達(dá)菌株經(jīng)誘導(dǎo)(0.4nM IPTG，26℃)，菌體用蛋白純化上樣緩沖液超聲破碎后，分別取菌體誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)后、破碎后上清(可溶蛋白)及破碎后沉淀(包涵體蛋白)，用12%SDS-PAGE鑒定表達(dá)部位，結(jié)果如圖4所示，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，菌體出現(xiàn)與目的蛋白相一致的條帶(約13.3kDa，泳道2)，超聲破碎上清與沉淀物均在13.3kDa處出現(xiàn)明顯條帶，表明GLEP蛋白以可溶性蛋白和包涵體蛋白兩種形式表達(dá)。從后續(xù)大規(guī)模生產(chǎn)及蛋白空間結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性考慮，選擇可溶性蛋白進(jìn)行純化。

M：蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)值；1：未經(jīng)0.4nM IPTG誘導(dǎo)；2：經(jīng)0.4nM IPTG誘導(dǎo)；3：誘導(dǎo)破碎后上清；4：誘導(dǎo)破碎后沉淀

2.4 重組蛋白GLEP純化

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，GLEP以可溶性蛋白的形式表達(dá)，因此將菌體破碎后上清經(jīng)Ni-NTA-Sepharose純化，收集洗脫液，采用12%SDS-PAGE考查純化蛋白的純度。結(jié)果如圖5所示，純化后蛋白在13.3kDa左右處有明顯單一條帶，且未發(fā)現(xiàn)雜蛋白。

M：蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)值；1：菌體經(jīng)破碎后的樣品；2：樣品上樣后的流出樣；3～4：經(jīng)250nM咪唑洗脫后的樣品

為檢測(cè)純化后GLEP蛋白的純度及其特異性，采用His抗體對(duì)GLEP蛋白進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)，結(jié)果如圖6所示，純化后的GLEP能特異性的與His抗體結(jié)合，未見(jiàn)其他條帶，表明經(jīng)Ni-NTA親和柱層析獲得了目的蛋白GLEP。

M：蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)值；1：純化后的GLEP

3.討論

近年來(lái)，包蟲病基礎(chǔ)研究一直致力于尋找具有良好抗原性和免疫原性的抗原，因?yàn)榧蚪{蟲具有復(fù)雜的生命周期且體外培養(yǎng)困難，阻礙了對(duì)免疫現(xiàn)象和相關(guān)機(jī)制的研究[7，8]。盡管如此，在細(xì)粒棘球絳蟲中也發(fā)現(xiàn)了一些優(yōu)勢(shì)抗原具有良好的抗原性，如EG95[9]、EgB[10，11]、Eg mefAg-1[12]等，這些抗原蛋白大多數(shù)為膜蛋白和分泌蛋白。與寄生蟲營(yíng)養(yǎng)相關(guān)的一些蛋白具有預(yù)防性，如日本血吸蟲腺苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[13]、精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)RNA酶[14]、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶[15]等。

寄生蟲經(jīng)過(guò)漫長(zhǎng)的演化適應(yīng)了宿主環(huán)境，像絳蟲消化系統(tǒng)完全消失，主要依靠皮層主動(dòng)運(yùn)輸營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)并輸入實(shí)質(zhì)組織中以糖原形式儲(chǔ)存。寄生蟲主要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)為葡萄糖，大部分寄生蟲從宿主獲取葡萄糖均依靠Na+葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白實(shí)現(xiàn)，目前葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族包含14個(gè)具有共同結(jié)構(gòu)特征但功能不同的亞型，都含有跨膜12次的結(jié)構(gòu)域、位于細(xì)胞質(zhì)側(cè)的N-和C-末端以及N-糖基化位點(diǎn)。Jun Matsumoto等[4]研究發(fā)現(xiàn)多房棘球蚴中可檢測(cè)到兩種葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(EmGLUT1和EmGLUT2)，其中EmGLUT1是一種易化擴(kuò)散的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體，不依賴Na+和H+對(duì)葡萄糖有高度特異性，而EmGLUT2是與寄生蟲發(fā)育無(wú)關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。因此EmGLUT1可能是多房棘球蚴從宿主環(huán)境獲取葡萄糖的一個(gè)重要轉(zhuǎn)運(yùn)體，本文表達(dá)和純化EmGLUT1是為后續(xù)疫苗研究尋找有力工具。

跨膜蛋白采用原核表達(dá)時(shí)，其細(xì)胞器較簡(jiǎn)單，無(wú)法像真核細(xì)胞一樣對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾、包裝并分泌，并且跨膜蛋白中含有大量的疏水性序列會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的翻譯過(guò)程產(chǎn)生抑制作用，較難表達(dá)，并且在表達(dá)過(guò)程中如與原核膜結(jié)構(gòu)融合會(huì)形成毒性[16]，因此很難在原核表達(dá)系統(tǒng)內(nèi)表達(dá)和純化。目前真核表達(dá)系統(tǒng)常用哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和酵母表達(dá)系統(tǒng)，雖然它們表達(dá)蛋白活性高，對(duì)于需要多修飾的蛋白易于表達(dá)，但存在成本高、表達(dá)量低、篩選時(shí)間長(zhǎng)等問(wèn)題，原核表達(dá)系統(tǒng)成本低廉、速度快、表達(dá)量高等優(yōu)勢(shì)有利于后續(xù)疫苗的研發(fā)及推廣，因此仍然選擇原核表達(dá)系統(tǒng)。

葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體(sGLT)以易化擴(kuò)散的形式進(jìn)行葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，其12次跨膜結(jié)構(gòu)是完成其易化擴(kuò)散的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，因此以該結(jié)構(gòu)作為抗原誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體或能夠達(dá)到抑制其功能的目的。通常情況下，一般對(duì)于跨膜蛋白的原核表達(dá)選擇胞外肽段進(jìn)行原核表達(dá)，如EB病毒潛伏膜蛋白1(LMP1)[17]、跨膜蛋白P185[18]、腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體[19]、雞細(xì)胞毒性T細(xì)胞相關(guān)抗原-4(CTLA-4)[20]等。因此本文通過(guò)對(duì)EmGLUT1跨膜結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)，刪除該氨基酸序列中跨膜和部分胞內(nèi)區(qū)域，選定171-179、287-300、355-368、424-432跨膜胞外區(qū)及453-509胞內(nèi)區(qū)共5個(gè)肽段，使用柔性序列KK和GS將其間隔并加以連接，以保證各表位肽之間的獨(dú)立性和特異性，避免相鄰表位肽連接部位出現(xiàn)新的表位，使各表位獨(dú)立發(fā)揮免疫原性。本文將串聯(lián)后的GLEP序列插入到pCzn1載體中，該載體能夠低溫誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，促進(jìn)可溶蛋白的產(chǎn)生，因此采用26 ℃誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，GLEP以可溶性蛋白表達(dá)，形成的融合蛋白穩(wěn)定性較好，經(jīng)Ni-NTA親和柱層析純化后獲得電泳純級(jí)的GLEP蛋白，并通過(guò)His標(biāo)簽抗體對(duì)重組蛋白進(jìn)行免疫印跡驗(yàn)證。在此建立的GLEP表達(dá)及純化方法，為后續(xù)疫苗研究提供了有力工具。