單真珍，劉 燕，羅朋立

(1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，青海 西寧 810001；2.青海大學(xué)附屬醫(yī)院腎病科，青海 西寧 810001)

腎臟纖維化是多種病因引起的慢性腎病(chronic kidney disease，CKD)發(fā)展至終末期腎病(end stage of renal disease，ESRD)的共同病理特征，而低氧是引起腎臟纖維化最主要的因素[1]。腎臟纖維化以細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)尤其是肌成纖維細胞積聚為主要特征[2]。近年來的研究顯示，腎臟纖維化中肌成纖維細胞有10%來源于內(nèi)皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化(Endothelial-Mesenchymal Transition，EndMT)[3]。EndMT是指內(nèi)皮細胞失去其特有的表型，而獲得間質(zhì)細胞表型及生理特征的一個生物學(xué)過程。在抗腎小管基底膜疾病的嚙齒動物模型中首次發(fā)現(xiàn)“腎小管上皮細胞通過基底膜遷移至間質(zhì)后，轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細胞”的現(xiàn)象[4]，提示細胞遷移是細胞發(fā)生轉(zhuǎn)分化的前提。糖尿病小鼠中足細胞特異性過表達Sema3A會加重腎小球硬化以及腎臟纖維化，當(dāng)抑制Sema3A后，上述癥狀可減輕[5]，說明Sema3A在腎臟纖維化的過程中起了非常重要的作用。近年來的研究還顯示，Sema3A是腎臟血管內(nèi)皮細胞存活和遷移的調(diào)節(jié)因子[6]，細胞從基底膜脫落是發(fā)生轉(zhuǎn)分化的重要環(huán)節(jié)，但Sema3A是否會影響EndMT過程未見報道。本研究主要探討Semaphorin 3A對低氧導(dǎo)致人腎小球內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)分化的影響。

1.材料與方法

1.1 主要儀器和試劑選擇

人腎小球內(nèi)皮細胞株(HGECs)、胎牛血清、內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基及內(nèi)皮細胞生長因子由ScienCell公司生產(chǎn)，小鼠抗人CD31及α-SMA一抗由abcam公司生產(chǎn)，共聚焦顯微鏡由德國Zeiss公司生產(chǎn)，細胞培養(yǎng)皿由Thermo公司生產(chǎn)，信號素3A(Sema3A)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒由ELabscience公司生產(chǎn)，Human Semaphorin3A/SEMA3A Protein由Sino Biological公司生產(chǎn)，二氧化碳培養(yǎng)箱由Thermo公司生產(chǎn)，全波長酶標儀(SpectraMax Plus 384型)由美國MD公司生產(chǎn)，電泳系統(tǒng)和凝膠成像儀由Bio-RAD公司生產(chǎn)。

1.2 HGECs實驗分組

原代HGECs包被復(fù)蘇后在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中增殖，每兩天更換一次培養(yǎng)基(含5%sFBS和1×青鏈霉素的ECM培養(yǎng)基)。在顯微鏡下觀察，細胞形態(tài)呈鵝卵石樣或卵圓形，貼壁生長，生長達90%融合狀態(tài)后傳代培養(yǎng)，選取第4～6代細胞用于本實驗。按完全隨機法設(shè)計分組，在體外給予HGECs不同的實驗條件，將貼壁細胞(細胞消化、接種至培養(yǎng)瓶后置于正常氧濃度培養(yǎng)10小時)分成低氧組[予以含5%sFBS和1×青鏈霉素的ECM培養(yǎng)基置1%低氧(1%，5% CO2，95%N2)培養(yǎng)箱培養(yǎng)5天]、低氧干預(yù)組[予以含200ng/mL外源性Sema3A的ECM培養(yǎng)基置1%低氧(1%，5% CO2，95%N2)培養(yǎng)箱培養(yǎng)5天]、常氧組[予以含5%sFBS和1×青鏈霉素的ECM培養(yǎng)基置于常氧(21% O2、5% CO2、74% N2，37℃)培養(yǎng)箱培養(yǎng)5天]。

1.3 細胞計數(shù)

將生長占培養(yǎng)瓶90%的細胞消化、離心(半徑12.36cm，1000r/min，5min)，棄上清液，加入新鮮培養(yǎng)基，反復(fù)吹打均勻，在1.5 mL的EP管中加入900 μL 1×DPBS緩沖液，再次加入100 μL上述細胞懸液(稀釋10倍)吹打均勻后，取出10 μL稀釋好的細胞懸液加到干凈且干燥的計數(shù)板上，在顯微鏡下數(shù)8個16方格的細胞數(shù)，位于方格邊緣的細胞按數(shù)上不數(shù)下、數(shù)左不數(shù)右的原則計數(shù)，細胞數(shù)/mL=8個16方格細胞數(shù)總和/8×104×10(稀釋倍數(shù))。

1.4 細胞上清液提取

將生長占培養(yǎng)瓶90%左右的細胞消化、離心(半徑12.36cm，1000r/min，5min)，棄凈上清液，加入新鮮培養(yǎng)基(5%FBS)后重懸，按照上述細胞計數(shù)方法對細胞進行計數(shù)，并將細胞懸液稀釋成2×104個/mL，之后將細胞懸液移入培養(yǎng)瓶中，每瓶1 mL，然后補足新鮮的完全培養(yǎng)基，在常氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10小時，待貼壁后分常氧組(21% O2)、低氧組(1% O2)和低氧干預(yù)組(1% O2+外源性Sema3A干預(yù))，將細胞放在常氧和低氧(1%氧濃度)培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)1、3、5天，之后用移液槍分別吸取上述培養(yǎng)瓶中的上清液，轉(zhuǎn)移至無菌的1.5 mL的EP管中，離心(半徑12.36cm，12000r/min，4℃，15min)，取上清液，棄沉淀，置-20 ℃冰箱保存。

1.5 低氧對HGECs培養(yǎng)上清液中Sema3A表達的影響

通過ELISA法測試。根據(jù)上述方法提取細胞上清液后，具體操作根據(jù)Sema3A 酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒說明書進行。

1.6 轉(zhuǎn)分化蛋白檢測

通過Western Blot法檢測。用BCA法測蛋白濃度，按SDS-PAGE凝膠試劑盒說明書配置10%的分離膠及5%濃縮膠，上樣前加入5×蛋白上樣緩沖液，每孔上樣30 μg，先在恒壓(80mV)下電泳15 min，再切換至120 mV下電泳約60 min，待蛋白樣本達到分離膠的底部時，停止電泳。將PVDF膜剪切、激活、覆蓋后在恒定電流(180m A)下轉(zhuǎn)膜2小時，取出PVDF膜，浸泡于脫脂牛奶中封閉(室溫，2小時)，孵育相應(yīng)一抗(4℃冰箱內(nèi)過夜)，用1×TBST洗滌7次，5 min/次。孵育相應(yīng)二抗2小時，洗膜后用ECL化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)顯影。使用Quantity One軟件分析并計算蛋白灰度值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2.結(jié)果

2.1 低氧培養(yǎng)下HGECs的形態(tài)變化

倒置顯微鏡下可見各組細胞均勻的貼壁生長，邊界清晰，胞膜光滑，胞核透亮，折光性較強，呈克隆性生長，7～8天融合達90%左右，逐漸出現(xiàn)接觸抑制現(xiàn)象。常氧組細胞呈“鋪路石”或“鵝卵石”外觀；相較于常氧組，低氧組和低氧干預(yù)組細胞培養(yǎng)5天后細胞形態(tài)發(fā)生了明顯變化，尤其是低氧組，幾乎所有的細胞胞體增大，細胞之間間隙變大，連接減少且紊亂，單個細胞外觀呈長梭形或紡錘形，總體呈離散狀甚至呈“棋盤狀”生長；低氧干預(yù)組的細胞僅有少數(shù)細胞形態(tài)發(fā)生了變化，多數(shù)細胞還是呈“鋪路石”樣外觀(圖1)。

常氧組 低氧組 低氧干預(yù)組

2.2 低氧對HGECs上清液中Sema3A表達的影響

ELISA結(jié)果顯示，常氧組和低氧組HGECs均有Sema3A分泌。與常氧組相比，低氧明顯抑制了Sema3A的分泌，在第五天最顯著，P<0.05(表1)。

表1 低氧對HGECs上清液中Sema3A表達的影響

2.3 低氧對HGECs α-SMA和CD31蛋白表達的影響

Western Blot結(jié)果顯示，三組HGECs中α-SMA和CD31蛋白表達差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(Fα-SMA=686.468，P<0.05；FCD31=5884.993，P<0.05)。低氧處理5天后，相較于常氧組，低氧組和低氧干預(yù)組中的CD31表達均明顯降低(P<0.05)，α-SMA表達均明顯升高(P<0.05)；相較于低氧組，經(jīng)外源性Sema3A干預(yù)后CD31表達仍下降(P<0.05)，α-SMA表達有所降低(P<0.05)，但仍高于常氧組(表2，圖2)。

表2 低氧對HGECs轉(zhuǎn)分化蛋白α-SMA和CD31含量的影響結(jié)果

圖2 Western Blot檢測HGECs轉(zhuǎn)分化蛋白α-SMA和CD31圖

3.討論

3.1 低氧誘導(dǎo)人腎小球內(nèi)皮細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)分化

EndMT是指內(nèi)皮細胞在各種病理因素如缺氧、炎癥因子、機械損傷等刺激下，內(nèi)皮細胞失去了細胞之間的粘附性和頂端-基底部的極性，轉(zhuǎn)變成了瘦長紡錘狀梭形并獲得高度侵襲性和遷移性的間充質(zhì)細胞。這一過程中最重要的是生物學(xué)的改變，即內(nèi)皮細胞表面標志物表達的減少和間質(zhì)細胞表面標志物的增多，接受EndMT的內(nèi)皮細胞其表型標志物CD31表達減少甚至消失，而纖維細胞特性的α平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)表達增加[2]。近年來的研究顯示，EndMT是腎組織中肌成纖維細胞的主要來源。缺氧已被認為是引起不同組織(肝臟，心臟，肺臟)纖維化的重要原因[7-10]，并且參與了EndMT的過程[2，7，11]。EndMT在梗阻性和糖尿病腎病、缺血-再灌注損傷和Alport綜合征的動物模型中有報道[12，13]。在糖尿病腎病、免疫球蛋白A腎病、狼瘡性腎炎和移植失敗的患者腎活檢中也發(fā)現(xiàn)了EndMT[14-16]。有證據(jù)表明，低氧是促使內(nèi)皮細胞發(fā)生EndMT的有效誘導(dǎo)因素，我們在體外培養(yǎng)的人腎小球內(nèi)皮細胞中發(fā)現(xiàn)，低氧組細胞發(fā)生了由“鋪路石”樣外觀向“長梭形” 樣外觀轉(zhuǎn)變，這種細胞形態(tài)與肌成纖維細胞非常類似。同時我們還發(fā)現(xiàn)低氧環(huán)境下內(nèi)皮細胞表面標志物CD31表達減少，而肌成纖維細胞標志物α-SMA表達增加，提示低氧可以誘導(dǎo)人腎小球內(nèi)皮細胞向肌成纖維樣細胞轉(zhuǎn)化。

3.2 Sema3A影響低氧誘導(dǎo)的人腎小球內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)分化

Sema3A是一種趨化導(dǎo)向蛋白，在許多器官和組織(神經(jīng)、心血管、肺臟、腎臟)的形成過程中發(fā)揮了重要作用，并參與了細胞死亡[17]、細胞粘附和聚集[18]以及細胞遷移和血管重構(gòu)等調(diào)控過程[19]。在腎臟組織中，Sema3A主要在腎小球上皮細胞、足細胞和遠曲小管、集合管表達[20，21]，是腎臟血管內(nèi)皮細胞存活和遷移的調(diào)節(jié)因子[6]。小鼠動物模型顯示，Sema3A缺乏時可導(dǎo)致腎內(nèi)Flk1-LacZ陽性內(nèi)皮細胞增多，毛細血管腔內(nèi)內(nèi)皮細胞增殖、遷移受抑制并因此引起血管形態(tài)的異常[6]。給健康小鼠注射重組Sema3A 4小時后，腎小球內(nèi)皮細胞腫脹、窗口缺失和損傷，表現(xiàn)為空泡和部分脫落[22]。足細胞過表達Sema3A可誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞凋亡，Sema3A與內(nèi)皮細胞結(jié)合，抑制其遷移[19]。在共培養(yǎng)實驗和遷移實驗中，重組Sema3A抑制內(nèi)皮細胞向胚胎腎外植體遷移，表明Sema3A在腎小球內(nèi)皮細胞遷移中起著非常重要的化學(xué)反應(yīng)導(dǎo)向信號作用[6]。有研究顯示，Sema3A在腎臟纖維化中也起到了非常重要的作用，在動物模型中發(fā)現(xiàn)糖尿病小鼠中足細胞特異性過表達Sema3A會加重腎小球硬化以及腎臟纖維化[5]，隨后的研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)糖尿病小鼠的Sema3A基因表達突變時，其促纖維化基因表達減少，腎小球硬化和間質(zhì)纖維化程度減輕，腎功能得以改善[23]。采用新型Sema3A抑制肽，對糖尿病引起的蛋白尿、腎纖維化有抑制作用[24，25]。以上研究均顯示Sema3A不僅影響了內(nèi)皮細胞的遷移和生存，也在腎臟纖維化的進程中發(fā)揮重要作用。本研究首先對Sema3A在腎臟組織細胞中的定位有了進一步的認識：既往認為Sema3A在腎臟組織中主要定位在腎小球上皮細胞、足細胞和遠曲小管、集合管[20，21]，但我們通過ELISA檢測發(fā)現(xiàn)，在常氧與低氧環(huán)境下獲得的條件細胞培養(yǎng)上清液中有Sema3A表達，說明人腎小球內(nèi)皮細胞可分泌Sema3A，這與Vacca A的報道一致[26]。重要的是我們發(fā)現(xiàn)，低氧組細胞上清液中Sema3A濃度均明顯低于對照組，提示低氧環(huán)境抑制了細胞Sema3A的分泌。其次對常氧和低氧兩組細胞中CD31和α-SMA蛋白的表達情況進行了檢測，相較于常氧組，低氧組細胞中CD31表達減少，而α-SMA表達增加。當(dāng)向低氧條件下的HGECs中加入外源性Sema3A后，與低氧組相比，HGECs細胞中的CD31表達進一步降低，提示Sema3A可抑制CD31的表達。CD31主要在內(nèi)皮細胞細胞間連接處高度表達，對維持內(nèi)皮細胞連接完整性起非常重要的作用，當(dāng)其表達下降時可破壞細胞間連接，有助于細胞從基底膜脫離，細胞從基底膜脫落是轉(zhuǎn)分化關(guān)鍵的一個環(huán)節(jié)。因此低氧條件下Sema3A低表達有助于維持細胞間連接的完整性，這是一種保護性反應(yīng)。同時我們發(fā)現(xiàn)，受低外源性Sema3A刺激后α-SMA表達反而有所下降，因α-SMA是肌成纖維細胞的標志性蛋白，因此我們推測Sema3A不能直接誘導(dǎo)細胞發(fā)生轉(zhuǎn)分化。在Sema3A參與的纖維化過程中，其更多的作用可能是促進細胞間連接破壞，促進細胞脫落，以有利于向纖維細胞的轉(zhuǎn)化。

綜上所述，我們認為低氧可抑制人腎小球內(nèi)皮細胞Sema3A表達，此有利于CD31的表達，有助于維持細胞間連接的完整性，這可能是細胞在低氧條件下的保護性反應(yīng)。