馬 萌，謝瑩?dān)L，趙世晨，徐夢(mèng)婷，何岑盈

(1.青海大學(xué)附屬醫(yī)院；2.南陽(yáng)市中心醫(yī)院；3.天津醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院)

目前子癇前期的發(fā)病機(jī)制尚不明確。關(guān)于其發(fā)病機(jī)制觀點(diǎn)多樣，其中普遍認(rèn)為子癇前期共有的發(fā)病機(jī)制是子宮螺旋動(dòng)脈滋養(yǎng)細(xì)胞重鑄障礙致胎盤(pán)缺血缺氧。低氧誘導(dǎo)因子-2α(hypoxia inducible factors-2α，HIF-2α)作為一種低氧誘導(dǎo)因子在機(jī)體的生長(zhǎng)、發(fā)育中起到重要作用。已有研究表明，生活在高海拔低氧環(huán)境下的女性比生活在海平面的女性更容易患子癇前期[1]，而子癇前期存在HIF-2α蛋白高表達(dá)，但HIF-2α在子癇前期的發(fā)病機(jī)制中的作用尚不清楚。目前，對(duì)HIF-2α過(guò)表達(dá)對(duì)機(jī)體影響的研究結(jié)論不一，本研究擬通過(guò)重組腺病毒介導(dǎo)的HIF-2α過(guò)表達(dá)明確其對(duì)SD孕鼠的影響，并初步探討子癇前期發(fā)病機(jī)制。

1.材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD雌性和雄性大鼠，周齡10～12周，體重230±20 g，SPF級(jí)，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0006]。

本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過(guò)青海大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審批，批號(hào)：P-SL-2017064。

1.1.2 試劑及儀器

穩(wěn)定表達(dá)HIF-2α的重組腺病毒購(gòu)于漢恒生物科技(上海)有限公司，烏拉坦購(gòu)于梯希愛(ài)(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司，免疫組化試劑購(gòu)于武漢博士德生物有限公司。大鼠無(wú)創(chuàng)血壓儀購(gòu)于安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司，大鼠代謝籠購(gòu)于蘇州工業(yè)園區(qū)唯亭姑秀實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)備廠，低速臺(tái)式離心機(jī)購(gòu)于上海安亭科學(xué)儀器廠，免疫組化所用儀器購(gòu)于北京嘉信科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理

1.2.2 血壓測(cè)量

所有孕鼠分別于妊娠第9、19 d運(yùn)用無(wú)創(chuàng)血壓儀測(cè)血壓。測(cè)量方法：將測(cè)血壓系統(tǒng)安裝在電腦上，連接血壓儀，設(shè)置通道和固定參數(shù)。在室溫、安靜環(huán)境下，將孕鼠置固定籠內(nèi)并露出尾根部，溫度調(diào)至38 ℃預(yù)熱10 min，在孕鼠尾根部依次套入充氣球、血壓換能器(孕鼠尾部與血壓換能器緊密貼合)，待孕鼠脈搏波形穩(wěn)定后，打開(kāi)充氣球開(kāi)關(guān)，完全充氣并慢慢放氣后，讀取孕鼠收縮壓、舒張壓(每?jī)纱窝獕簻y(cè)量間歇應(yīng)大于1min)，測(cè)量3次，求其平均值。

1.2.3 尿液留取

所有孕鼠分別于妊娠第9、19 d置入大鼠代謝籠內(nèi)，禁食不禁水，收集孕鼠24 h的尿液。將尿液移入無(wú)菌離心管中離心10 min(4000rpm，4℃)，吸取上清液至另一無(wú)菌離心管內(nèi)，記錄尿量并標(biāo)記后統(tǒng)一運(yùn)用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)量24 h尿蛋白量。

1.2.4 處死

所有孕鼠在妊娠第19 d測(cè)量血壓、收集尿后于腹腔注射烏拉坦麻醉(20%，5mL/kg)，固定孕鼠，用蒸餾水濕潤(rùn)腹部，打開(kāi)腹腔，分離腹腔器官使下腔靜脈充分暴露，留取下腔靜脈血，運(yùn)用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)ALT、ALB、BUN、Cr。用無(wú)菌剪切開(kāi)子宮，記錄仔鼠個(gè)數(shù)及重量，剪取胎盤(pán)，置4%甲醛溶液中固定，做免疫組化分析。

1.2.5 免疫組化結(jié)果判定

HIF-2α蛋白主要表達(dá)于胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞胞核、胞漿中，HE染色為棕黃色時(shí)視為陽(yáng)性。在每張免疫組化片子隨機(jī)選取20個(gè)高倍視野觀察HIF-2α表達(dá)情況，根據(jù)染色程度和染色細(xì)胞占視野總細(xì)胞的百分比綜合計(jì)算：(1)無(wú)染色記為0分，淡棕色染色記為1分，棕黃色染色記為2分，深棕黃色染色記為3分；(2)無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞記為0分，陽(yáng)性細(xì)胞<30%記為1分，陽(yáng)性細(xì)胞30%～50%記為2分，陽(yáng)性細(xì)胞>50%記3分?？傇u(píng)分=(1)+(2)/2，總評(píng)分<1分記為陰性表達(dá)，總評(píng)分≥1分記為陽(yáng)性表達(dá)[2，3]。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 23.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，對(duì)同一處理組的處理前后比較使用配對(duì)t檢驗(yàn)，對(duì)不同處理組間比較采用單因素方差分析，多重兩兩比較采用Bonferroni法，不同處理組HIF-2α表達(dá)陽(yáng)性率比較采用卡方檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 血壓

妊娠第19 d，重組腺病毒組收縮壓、舒張壓與妊娠第9 d相比，收縮壓、舒張壓明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；妊娠第19 d，與鹽水組、空白腺病毒組相比，重組腺病毒組收縮壓、舒張壓明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 不同處理組收縮壓與舒張壓

2.2 尿蛋白

重組腺病毒組妊娠第19 d的24小時(shí)尿蛋白與妊娠第9 d相比，24小時(shí)尿蛋白明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，妊娠第19 d，與鹽水組、空白腺病毒組相比，重組腺病毒組24小時(shí)尿蛋白明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 不同處理組24小時(shí)尿蛋白值

2.3 肝腎功能

不同處理組孕鼠ALT、ALB、BUN、Cr無(wú)明顯差異(P>0.05)，見(jiàn)表3。

表3 不同處理組肝腎功能值

2.4 仔鼠均重

與鹽水組、空白腺病毒組相比，重組腺病毒組仔鼠均重明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 不同處理組仔鼠均重

2.5 免疫組化

不同處理組HIF-2α表達(dá)比較，重組腺病毒組HIF-2α表達(dá)高于鹽水組、空白腺病毒組(P<0.05)，見(jiàn)表5。

表5 不同處理組HIF-2α表達(dá)情況

3.討論

3.1 HIF-2α與子癇前期

胎盤(pán)最初是在含氧量為1%的低氧環(huán)境中發(fā)育，直到懷孕10周后。在此期間，氧濃度對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞活性有重要影響，HIF被認(rèn)為是影響妊娠前期滋養(yǎng)細(xì)胞行為的重要調(diào)節(jié)因子之一[4]。其中HIF-1和HIF-2(即Endothelial PASdomain-containing protein，EPAS1)是細(xì)胞在缺氧應(yīng)答反應(yīng)中最重要的調(diào)節(jié)因子，它們均是一種由α亞基和β亞基組成的異質(zhì)二聚轉(zhuǎn)錄因子，其中α亞基是應(yīng)對(duì)缺氧的主要亞基，在常氧下迅速分解失活，而β亞基是基本亞基。EPAS1驅(qū)動(dòng)慢性缺氧反應(yīng)，而HIF-1α參與了對(duì)急性缺氧的細(xì)胞反應(yīng)，有研究表明低氧狀態(tài)下為使內(nèi)皮細(xì)胞維持氧平衡狀態(tài)，HIF-2α可能替代HIF-1α起作用[5]。Rajakumar[6]、LiuW[7]的研究顯示，子癇前期胎盤(pán)中HIF-2α的蛋白表達(dá)增加，而胎盤(pán)中的HIF-1α并未增加。Depoix C L[8]的研究顯示，是EPAS1，而不是HIF-1α，可能在滋養(yǎng)細(xì)胞分化過(guò)程中、在基因表達(dá)調(diào)控中起重要作用。在Qin L[9]的研究中發(fā)現(xiàn)，通過(guò)沉默真核翻譯起始因子降低HIF-2α的表達(dá)可使子癇前期大鼠模型的臨床表現(xiàn)得到改善，并抑制PE大鼠高血壓和尿蛋白的出現(xiàn)。以上研究都說(shuō)明HIF-2α與子癇前期關(guān)系密切，也是我們選擇HIF-2α而不是HIF-1α作為研究因子的原因。曲新霞[ 10]通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，低氧環(huán)境下的表達(dá)下降HLA-G可能通過(guò)影響滋養(yǎng)細(xì)胞增殖活性及侵襲能力參與妊娠期高血壓疾病發(fā)生。在Rueda-Clausen C F[11]的研究中將正常孕鼠與子癇前期孕鼠暴露于10.5%的氧氣濃度下8 d后，正常孕鼠血壓、尿蛋白明顯增加，仔鼠體重、生存率下降。子癇前期孕鼠血壓進(jìn)一步上升、尿蛋白增加。以上說(shuō)明低氧與子癇前期關(guān)系密切，并在子癇前期發(fā)病中占有重要作用。HIF-2α作為重要的低氧調(diào)節(jié)因子，HIF-2α的表達(dá)變化是否與子癇前期有關(guān)、是否參與子癇前期發(fā)病機(jī)制是本研究的目的。

3.2 HIF-2α過(guò)表達(dá)對(duì)孕鼠的影響

子癇前期的典型特征是高血壓和尿蛋白，鮮有HIF2α過(guò)表達(dá)對(duì)孕鼠影響的研究，本研究尚處于摸索研究階段。我們于妊娠第9 d注射腺病毒，此時(shí)孕鼠處于孕中期，仔鼠已發(fā)育穩(wěn)定，外界干預(yù)不易致流產(chǎn)，利于整個(gè)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，而大鼠整個(gè)孕期在20 d左右，我們選擇了妊娠第19 d進(jìn)行解剖。對(duì)于鼠尾注射病毒的劑量，過(guò)低可能達(dá)不到預(yù)期的結(jié)果，過(guò)高可能對(duì)孕鼠產(chǎn)生嚴(yán)重不良影響，查閱有關(guān)腺病毒注射類文獻(xiàn)后，最后確定了本研究孕鼠注射病毒劑量。為了研究腺病毒是否對(duì)孕鼠產(chǎn)生影響，我們?cè)O(shè)置了空白病毒組來(lái)對(duì)照。結(jié)果在妊娠第19 d，重組腺病毒組收縮壓、舒張壓、尿蛋白與妊娠第9 d相比顯著升高，尿蛋白增加了近10倍，而鹽水組及空白腺病毒組收縮壓、舒張壓、尿蛋白與妊娠第9 d相比無(wú)顯著差異，說(shuō)明注射腺病毒對(duì)孕鼠血壓、尿蛋白無(wú)明顯影響，而注射重組腺病毒介導(dǎo)的HIF-2α過(guò)表達(dá)使孕鼠產(chǎn)生高血壓和尿蛋白，即子癇前期癥狀，雖然收縮壓、舒張壓升高程度未達(dá)人類高血壓判定標(biāo)準(zhǔn)(可能與注射腺病毒劑量不足或動(dòng)物子癇前期尚無(wú)統(tǒng)一判定標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)，具體劑量有待進(jìn)一步研究)，但較對(duì)照組還是明顯升高了。本研究在青海西寧完成(海拔2200m)，屬于低氧區(qū)，但鹽水組、空白病毒組未出現(xiàn)血壓明顯變化，與低氧地區(qū)子癇前期發(fā)病率高不一致，可能跟海拔高度不夠高和組數(shù)少、低氧時(shí)間短暫有關(guān)系，這也從反面說(shuō)明重組腺病毒組孕鼠產(chǎn)生的一系列子癇前期癥狀與2 200米海拔無(wú)明確關(guān)聯(lián)。

在研究結(jié)果中我們看到三組肝腎功能指標(biāo)ALT、ALB、BUN、Cr無(wú)明顯差異，并未出現(xiàn)注射腺病毒產(chǎn)生的特異性肝炎所致的肝酶升高，可能與大鼠肝腎功能沒(méi)有統(tǒng)一判定標(biāo)準(zhǔn)、孕鼠研究樣本有限及注射腺病毒劑量不足有關(guān)。而本研究中注射腺病毒未出現(xiàn)肝腎功能指標(biāo)的上升，也排除了注射腺病毒所致肝腎功能改變對(duì)孕鼠血壓、尿蛋白的影響，隨后可以在肝臟、腎臟病理學(xué)中尋求驗(yàn)證。

胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限(Intrauterine growth restriction in utero，IUGR)，被定義為胎兒未能達(dá)到其基因決定的生長(zhǎng)潛力，在大約25%的子癇前期中存在[12 ]。IUGR雖然不是子癇前期特異性的表現(xiàn)，但I(xiàn)UGR與子癇前期具有共同的病理生理學(xué)特征，且與子癇前期導(dǎo)致的絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)不足、子宮螺旋小動(dòng)脈重鑄障礙密切相關(guān)，可以間接反映子癇前期的病情。在妊娠第19 d，重組腺病毒組仔鼠體重顯著低于鹽水組和空白病毒組，而鹽水組與空白病毒組無(wú)明顯差異，說(shuō)明鼠尾注射重組腺病毒介導(dǎo)的HIF-2α過(guò)表達(dá)使仔鼠產(chǎn)生了IUGR。胎盤(pán)免疫組化結(jié)果提示HIF-2α蛋白在鹽水組和空白腺病毒組低表達(dá)，而在重組腺病毒組呈高表達(dá)，從反面驗(yàn)證了HIF-2α過(guò)表達(dá)可使SD孕鼠產(chǎn)生子癇前期癥狀，這與Rajakumar[ 6]、Liu W[ 7]及李淑麗[13]的研究結(jié)論一致。

本研究通過(guò)重組腺病毒介導(dǎo)的HIF-2α過(guò)表達(dá)使SD孕鼠產(chǎn)生子癇前期癥狀，致胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限(在胎盤(pán)免疫組化中得到了驗(yàn)證)，說(shuō)明HIF-2α參與了子癇前期的發(fā)病，但具體的分子機(jī)制尚不清楚，有待學(xué)者進(jìn)一步研究。