范倩，陳雪冰，汪玉梅，榮莉，張翠仙

廣州中醫(yī)藥大學中藥學院，廣東廣州510006

附子（Aconiti Lateralis Radix Praeparata）為毛莨科植物烏頭Aconitum carmichaeli Debx. 子根的加工品，具有回陽救逆、補火助陽，散寒除濕之功效等［1］。臨床用于治療陰盛格陽，大汗亡陽，風寒濕痹等疾病。文獻研究表明［2-4］附子的化學成分主要為生物堿、有機酸類、脂肪酸酯和微量元素等，其中生物堿為主要活性成分，具有強心、抗炎和抗風濕性關節(jié)炎等藥理作用。附子生物堿主要包括雙酯型二萜類生物堿、長鏈脂型二萜類生物堿、單酯型二萜類生物堿、無酯型二萜類生物堿和其他類型生物堿。其中雙酯型和單酯型二萜類生物堿也為其毒性成分。由于附子屬于大毒藥材，臨床常用其炮制品，炮制過程中雙酯型生物堿水解成單酯型生物堿，毒性顯著降低等［5］。近年來，將液相色譜的高效分離能力和高分辨質譜鑒定能力相結合，廣泛用于中藥材成分分析與鑒定［6］。GNPS（global natural products social molecular networking）是一種可視化計算策略，可以直觀地觀察到樣品LC-MS/MS 實驗中檢測到的所有分子離子以及這些分子離子之間的化學關系，對于化合物的快速而大規(guī)模地鑒定及新穎化合物發(fā)現具有重要的作用［7］。本研究采用UPLC-Q-TOF-MS/MS 及GNPS 技術對炮附片在線分離分析，快速鑒定其二萜類生物堿成分，為其藥效物質基礎及質量控制研究奠定基礎。

1 儀器與材料

Triple-TOFTM 5600+型三重四級桿飛行時間質譜（美國AB SCIEX 公司）。超高效液相系統(tǒng)：LC-30AD 高效液相色譜儀、SIL-30AC 自動進樣器（日本Shimadzu 公司）；煎煮鍋（廣州文新電器有限公司）；Milli-Q 超純水系統(tǒng)（美國Millipore 公司）；盧湘儀DD-5M 低速離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）；Sartorius 賽多利斯十萬分之一天平（季爾國際貿易有限公司）。

炮附片藥材（批號YPA7H0001）購自廣州采芝林藥業(yè)有限公司。炮附片，經廣州中醫(yī)藥大學黃海波教授鑒定為烏頭Aconitum carmichaeli Debx.的子根的加工品。對照品烏頭堿（aconitine，批號RP170421）、 中 烏 頭 堿（mesaconitine， 批 號RP170320）、 次 烏 頭 堿（hypaconitine， 批 號RP170520）、3-脫氧烏頭堿（3-deoxyaconitine，批號RP161108）、苯甲酰烏頭原堿（benzoylaconine，批號RP170615）、苯甲酰中烏頭原堿（benzoylmesaconine，批號RP170605）、苯甲酰次烏頭原堿（benzoylhypaconine，批號RP170513）、烏頭原堿（aconine，批號RP170517）、新烏頭原堿（mesaconine，批號RP170320）、次烏頭原堿（hypaconine，批 號 RP170518）、 尼 奧 林 （neoline， 批 號RP170423）、 多 根 烏 頭 堿（karacoline， 批 號RP161225）、宋果靈（songorine，批號RP170402），均購自成都麥德生科技有限公司，13 種對照品純度均≥98%。甲醇（色譜純，德國Merck 公司），甲酸（色譜純，美國Fisher 公司），φ=95%乙醇（分析純，天津市福晨化學試劑廠）。

2 方法與結果

2.1 色譜及質譜條件

2.1.1 色譜條件 ACE C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，3 μm，廣州菲羅門科學儀器有限公司），體積流量0.4 mL/min，PDA 全波長掃描，柱溫30 ℃，進樣量2 μL。以乙腈為流動相A，φ=0.1%甲酸水為流動相B，梯度洗脫：0～5 min，5% A；5～65 min ，5%～25 % A；65～95 min，25%～65% A；95～100 min，65%～95%A；100～105 min，95%A。

2.1.2 質譜條件 采用電噴霧離子化源（ESI），正離子掃描模式，掃描范圍m/z 100～1 500，用亮氨酸腦啡肽作校正液，進行實時校正。正離子模式離子噴霧電壓（ISVE）：+5 500 V；渦輪噴霧溫度（TEM）：550 ℃；氣簾氣壓力（GUR）：35 psi；霧化氣（Gas1）：55 psi；輔助氣（Gas2）：55 psi；解簇電位（DP）：100 V；碰撞能散布（CES）：15 eV；離子釋放延遲（IRD）：67 V；離子釋放寬度（IRW）：25 V 一級質譜母離子掃描范圍100～1 500 ；IDA 設置響應值超過100 cps 的8 個最高峰進行二級質譜掃描，子離子掃描范圍：100～1 500。

2.2 溶液的配制

2.2.1 混合對照品儲備液的溶液 用十萬分之一天平精密稱取13 種附子對照品各約1.0 mg，用φ=80%的甲醇溶解，定容至1 mL 容量瓶中，分別精密吸取13 種附子對照品各0.1 mL，定容至50 mL容量瓶中，配制成質量濃度約為0.02 mg/mL 的附子混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的配制 取炮附片藥材30.0 g，精密稱定，加入1 L純凈水浸泡30 min，水煮2 h制成水煎液，趁熱用四層紗布過濾，藥渣采用此方法再煎煮一次后合并兩次濾液，離心（4 000 r/min，15 min），上清濾液濃縮至約300 mL后加3倍φ=95%的乙醇沉糖，于4 ℃冰箱靜置24 h，離心（4 000 r/min，15 min），上清液在50 ℃減壓濃縮至粘稠狀態(tài)，氮氣吹干儀吹干部分溶劑，得稠浸膏。取浸膏適量，用φ=80%甲醇水配制成質量濃度約為50 mg/mL 的樣品溶液，搖勻，用0.22 μm 微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.3 數據分析

2.3.1 化學數據庫分析 使用Peak ViewTM軟件（版本1.2，AB Sciex）對炮附片中復雜的化合物進行定性鑒別。首先，通過檢索相關文獻和化學數據 庫 網 站（CNKI，Chemspider，Web of Science，PubMeb，SciFinder 等），建立了一個屬于附子的化合物數據庫，包括名稱、分子式和化學結構文件。然后，將數據庫導入到Peak ViewTM軟件的XIC Manager 模塊對目標化合物進行峰提取和匹配。提取的參數設置如下：XIC intensity ＞50 counts，S/N ＞ 10， isotope ratio% difference ＜20， mass error ＜10×10-6。經計算篩選后，軟件將各化合物的實測數據與軟件理論的數據進行匹配，將匹配度大于75%且質譜碎片裂解過程合理的結果作為炮附片中最終鑒定出來的化合物。

2.3.2 GNPS 網絡的建立 按照“2.1”項下優(yōu)化的色譜及質譜條件進樣，獲得正離子模式下炮附片樣品及混合對照品溶液的UPLC-Q-TOF-MS/MS二級質譜文件，通過MS Convert 軟件轉換后利用FileZilla FTP Client 連接器導入GNPS 平臺（http：//gnps. ucsd. edu），分別建立GNPS 網絡，并與混合對照品和譜庫中的數據進行匹配；數據分析在Cytoscape 3.6.1 軟件中進行。

3 討 論

3.1 UPLC-Q-TOF-MS/MS 條件優(yōu)化及參數設置

中藥炮附片的提取物成分復雜多樣。通過與樣品的正負離子響應度比較，發(fā)現正離子比負離子具有更好的響應。為了有足夠的碎片信息用于結構鑒定分析，以13 種生物堿溶液的對照品為參考，選擇20、30、40 和50 eV 的碰撞能量（CE）進行優(yōu)化以獲得合適的產物離子，最后選擇40 eV作為最佳CE。

本實驗采用了四極桿飛行時間串聯(lián)質譜（QTOF-MS/MS），無論是在MS 或MS/MS 模式下均具有高分辨能力，在實現UPLC-Q-TOF-MS/MS 分析時其主要優(yōu)點是應用質譜的高分辨精確質量數進行化合物的定性分析，加上MS/MS 數據以推測分子結構，對于高分辨率質譜通常要求儀器的質量測量準確度小于10×10-6［8-10］，才能滿足定性分析的需要；利用Peak ViewTM軟件里的XIC Manager 模塊對化學數據庫里化合物進行峰提取和匹配的參數的篩選標準限值，該匹配度僅作為一個化合物定性分析的初步篩選標準，提取并突出顯示初步符合數據庫要求的化合物；同時，我們也參考了相關的文獻（如：復方白術芍藥散成分分析）［8］里該匹配度值的設置情況。故本實驗選用了mass error ＜10×10-6作為質量測量準確度的標準，匹配度大于75%作為炮附片的定性分析的初步標準。此外，化合物的定性分析需要同時滿足質量測量準確度（mass error） 小于10×10-6和匹配度大于75%，并需結合各化合物的特征二級碎片離子等，最終才能鑒定化合物的結構。

3.2 炮附片的成分鑒定

按照“2.1”項下優(yōu)化的色譜及質譜條件進樣，獲得UPLC-Q-TOF-MS/MS 正離子模式下炮附片樣品和混合對照品溶液的TIC圖（見圖1）。按照“2.3”項下數據分析方法確定化學成分的結構，對炮附片主要成分進行快速表征，共鑒定了123個化合物（見表1、表2），其中包括雙酯型生物堿21個，脂型生物堿11 個，單酯型生物堿43 個，無酯型生物堿47 個，多酯型生物堿1 個，其中包括34個潛在的新化合物。

3.2.1 通過數據庫和Peakview 對二萜類生物堿的成分鑒定

1） 雙酯型二萜類生物堿。

雙酯型二萜類生物堿（DDAs）是附子的主要生物活性成分，通過建立的LC-MS 方法，在炮附片的水煎液中一共鑒別了17 種雙酯型二萜類生物堿，該類化合物的主要裂解特征為容易脫去取代基，如羥基、甲氧基、乙?；?、苯甲?；?，而丟失CO、H2O、CH3OH、AcOH、BzOH 等中性分子?；衔?7、94、103 和109 通過對照品無偏差的鑒別為aconitine、mesaconitine、hypaconitine 和3-deoxyaconitine。為幫助鑒定和證實其他雙酯型二萜類生物堿，我們首先對mesaconitine 對照品的碎片裂解途經進行分析，在正離子模式檢測下，化合物94 （mesaconitine） 給出了明顯的m/z 632.305 4 ［M+H］+的分子離子峰， 二級質譜圖（圖2A）可觀察到碎片離子m/z 582.269 1［M+HCH3OH-H2O］+、572.280 9［M+H-AcOH］+、540.256 2［M+H-AcOH-CH3OH］+、512.261 9［M+H-AcOHCH3OH-CO］+、508.231 8［M+H-AcOH-2CH3OH］+、480.236 9［M+H-AcOH-2CH3OH-CO］+、480.236 9［M+H-AcOH-2CH3OH-CO］+、390.228 0［M+H -AcOH-CH3OH-CO-BzOH］+、354.169 0［M+HAcOH-CH3OH-CO-BzOH-2H2O］+；其裂解規(guī)律如圖3所示。其他雙酯型生物堿（化合物72、81、84和108）均有類似的質譜裂解規(guī)律，根據質譜數據結合文獻報道［11］，分別鑒定為17-dihydronapelline、3*、10-hydroxymesaconitine、chasmaconitine。研究發(fā)現化合物74 和化合物94（mesaconitine）具有相同的分子式C33H45NO11，其為mesaconitine的同分異構體。 其二級質譜中形成的m/z 572.280 9［M+H-AcOH］+主要碎片離子，同時觀察到其碎片離子m/z 540.258 0［M+H-AcOHCH3OH］+、508.265 9［M+H-AcOH-2CH3OH］+。但因未發(fā)現［M+H-H2O］+和［M+H-CH3OH -H2O］+等與脫去H2O相關的碎片離子，說明其C3位未有羥基取代，根據文獻［12］比對，推測化合物74 其可能為10-OH-hypaconitine。類似地，其他雙酯型二萜類生物堿化合物，根據質譜數據，結合文獻報道及ClogP 值［8，10-11］，79、82、91、95、96、102和110～112逐一被鑒定（表1）。

圖1 炮附片（A）和混合對照品溶液（B）的UPLC-Q-TOF-MS/MS 總離子流圖Fig.1 The total ion chromatograms of PAC and mixed reference solution by UPLC-Q-TOF-MS/MS

表1 炮附片中已知二萜類生物堿離子結構信息1）Table 1 Characterization of known diterpenoid alkaloids of PAC by UPLC-Q-TOF-MS/MS

續(xù)表

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表2 炮附片中新二萜類生物堿離子結構信息1）Table 2 Characterization of new diterpenoid alkaloids of PAC by Molecular Networking

續(xù)表

2） 長鏈脂型二萜類生物堿。

長鏈脂型二萜類生物堿（Lipo-As）是附子中特有的一類生物活性成分，該類化合物的主要質譜裂解特征為首先脫去C-8 為對應的長鏈脂肪酸（-lipo）后，再與其相對應的雙酯型二萜類生物堿［M+H-AcOH］+的骨架的二級質譜裂解規(guī)律是一致的［15］?；诖肆呀庖?guī)律，從炮附片中一共鑒定到了11 個長鏈脂型生物堿。例如，化合物122 的準分子離子峰為m/z 812.531 2［M+H］+，分子式為C47H73NO10。二級質譜圖如圖2 B 可觀察到碎片離子m/z 556.289 2［M+H-lipo］+、524.262 6［M+H-lipo-CH3OH］+、496.269 5［M+H-lipo- CH3OH-CO］+、338.172 5［M+H-lipo-3CH3OH-BzOH］+。其二級質譜和benzoylhypaconine 二級質譜一致，因此，該化合物的骨架初步鑒定為benzoylhypaconine，其長鏈脂肪酸的分子式為C16H32O2，推測長鏈脂肪酸初步為palmitic acid （pal）。根據其質譜數據結合文獻報 道［11］，化 合 物122 鑒 定 為8-pal-benzoylhypaconine。此外，其他長鏈脂型二萜類生物堿化合物也有類似的裂解規(guī)律，根據其質譜數據結合文獻報道［12-13］，化合物113～117、119～123 逐一被鑒定表征（表1）。

3） 單酯型二萜類生物堿。

單酯型二萜類生物堿（MDAs）是炮附子中主要的低毒活性成分，通過建立的LC-MS 方法在炮附片的水煎液中一共鑒別了34 種單酯型二萜類生物堿，其裂解規(guī)律為容易失去AcOH、CH3OH、H2O、CO 等中性分子。化合物67、73 和75 通過對照品無偏差的鑒別為benzoylmesaconitine，benzoylaconine 和benzoylhypaconine。為鑒定和證實其它單酯型二萜類生物堿，首先對benzoylaconine 對照品的碎片裂解途經進行分析，在正離子模式檢測下，化合物73（benzoylaconine）給出了明顯的m/z 604.312 0［M+H］+的分子離子峰， 二級質譜圖（圖2C）可觀察到碎片離子m/z 586.300 8［M+HH2O］+、572.285 6［M+H-CH3OH］+、554.275 2［M+H-H2O-CH3OH］+、540.259 3［M+H-2CH3OH］+、522.248 9［M+H-2CH3OH -H2O］+、508.233 6［M+H -3CH3OH］+、490.222 4［M+H-3CH3OH-H2O］+、428.186 6［M+H-BzOH-3H2O］+；此外，其他單酯型二萜類生物堿均有類似的質譜裂解規(guī)律，根據質譜數據結合文獻報道［11-12，14-16］，化合物1、24、26、37、47、53、54、56、57、65、76、80、88、90、93、98 和99 逐一分別被鑒定。在正離子模式下，化合物62出現m/z 604.312 2［M+H］+的準分子離子峰，它的二級質譜數據與benzoylaconine 相類似，二級質譜圖同樣可觀察到m/z 572.287 7、554.277 5和522.251 1等碎片離子，對比之下化合物62 還具有m/z 458.198 9［M+H-4CH3OH-H2O］+、336.159 4［M+H-4CH3OH-BzOH-H2O］+特征的碎片離子，暗示其比benzoylaconine 多一個-OCH3，根據質譜數據結合文獻報道［12］，推測其結構為hukbusine A。其他單酯型二萜類生物堿化合物均有類似的質譜裂解規(guī)律，根據其質譜數據結合文獻報道及ClogP 值［11，17-19］，化合物69、71、78、83、85～87、100、101和104～107逐一被鑒定（表1）。

圖2 Mesaconitine（A）、8-pal-benzoylhypaconine（B）、benzoylaconine（C）、neoline（D）、PAC-2#（E）和PAC-16#（F）的二級質譜圖Fig.2 The MS2 spectra of mesaconitine（A），8-pal-benzoylhypaconine（B），benzoylaconine（C），neoline（D），PAC-2#（E）and PAC-16#（F）

4） 無酯型二萜類生物堿。無酯型二萜類生物堿（ADAs）是炮附子中主要的無毒活性成分，通過建立的LC-MS 方法，在炮附片的水煎液中一共鑒別了25 種無酯型二萜類生物堿，化合物12、15、20、23、28 和33 通過對照品無偏差的鑒別為mesaconine、karakoline、songorine、aconine、hypaconine 和neoline；以化合物33 為例，說明無酯型二萜類生物堿的裂解規(guī)律。化合物33 二級質譜圖如 圖2D 可 觀 察m/z 420.274 7［M+H-H2O］+、402.264 1［M+H-2H2O］+、388.248 6［M+H-H2OCH3OH］+、370.237 9［M+H - 2H2O - CH3OH］+、356.222 2［M+H-H2O -2CH3OH］+等碎片離子，根據對照品的質譜信息和參考文獻報道［12］，化合物33 初步鑒定為neoline。而化合物36 的裂解方式和化合物33 的相似，它的二級質譜數據與neoline 相類似，二級質譜圖同樣可觀察到m/z 420.274 0、388.248 6、360.217 5 等碎片離子，對比之下，化合物36 還形成m/z 406.259 4 的主要的特征二級碎片離子，是在m/z 438.285 3 的母離子脫去C1位的-CH3OH 產生的，表明其C1是甲氧基取代。根據質譜數據并結合參考文獻［11］，因此推測其結構為foresticine。其他無酯型二萜類生物堿化合物類似的質譜裂解規(guī)律，根據其質譜數據結合文獻報道及ClogP 值［11-13，15-16］，化 合 物2，4，6～9，14，29，40和48逐一被鑒定（表1）。

3.2.2 通過GNPS 網絡對二萜類生物堿的成分鑒定 基于MS/MS 光譜的相似性，炮附片水煎煮液的可視化的分子籠網絡被建立（https：//gnps. ucsd. edu/ProteoSAFe/status. jsp？task=7c62374c03854 e01ad1ad354134c7616）。在4 個明顯的二萜類生物堿分子籠中，通過GNPS 網絡和已知化合物的去重復分析，共初步鑒定了65 個生物堿，其中包括34個潛在的新生物堿（表2和圖4）。

圖3 Mesaconitine的質譜裂解規(guī)律圖Fig.3 The proposed fragmentation pathways of mesaconitine

在正離子模式下，分子籠Ⅰ共包含了36 個節(jié)點，相對分子質量范圍在m/z 320.114～588.280 之間，結構涉及單酯型和無酯型生物堿（圖5A）。特別地，通過對比對照品（表1），節(jié)點m/z 378.264［M+H］+被鑒定為已知化合物karakanine（18）。此外，通過文獻報道和數據庫分析［11］，節(jié)點m/z 420.275（35）和392.280（1）［M+H］+分別被鑒定為N-ethylhokbusine B（35）和hukbusine B 或它的同分異構體（1）。與此同時，如圖分子籠I 所示，未知離子m/z 396.264 與已知離子m/z 378.264 相關，表明它們在結構上類似。節(jié)點m/z 396.264 產生的準分子離子峰為396.236 3［M+H］+，其二級碎片為m/z 378.254 5［M+H-H2O］+、360.244 2［M+H-2H2O］+、342.234 7［M+H-3H2O］+、324.223 6［M+H-4H2O］+、268.203 9［M+H-2CH3OH-H2O-CO］+，二級質譜顯示有多個中性水分子的丟失，推測結構中存在多個羥基，基于質譜數據分析，節(jié)點m/z 396.26 被鑒定為karakoline 的衍生物（PAC-2#（5），表2 和圖4）。此外未知離子m/z 434.290 比已知離子m/z 420.275 高出14 ，節(jié)點m/z 434.290 的準分子離子峰為396.236 3［M+H］+，其二級碎片為402.255 3［M+H-H2O］+、384.249 5［M+H-2H2O］+、342.243 2［M+H-AcOH］+、324.233 2［M+H-AcOH-H2O］+、292.204 6［M+H-AcOH-H2OCH3OH］+，二級質譜顯示有中性乙酸分子的丟失，推測結構中存在1 個乙?；?，基于文獻報道［11］結合質譜數據，節(jié)點m/z 434.290 被鑒定為N-ethylhokbusine B 的衍生物（PAC-16#（50），表2 和圖4）。通過GNPS 網絡分析，在分子籠Ⅰ中，我們共鑒定了26 個生物堿，其中包含15 個新的生物堿。此外，在分子籠Ⅱ中共鑒定21 個生物堿，其中包含11 個新的生物堿；在分子籠Ⅲ中共鑒定7 個生物堿，其中包含1個新的生物堿；在分子籠Ⅳ中共鑒定11 個生物堿，其中包含7 個新的生物堿（表2和3，圖5C～D）。最后將通過GNPS 分子網絡推導的所有潛在的新化合物結構分別輸入Sci Finder 數據庫搜索驗證，發(fā)現其34 個潛在的化合物均未見相關文獻報道，故推測此34 個潛在的化合物均為炮附片中潛在的新化合物。

4 結 論

圖4 炮附片中新二萜類生物堿成分Fig.4 The structures of the new diterpenoid alkaloids compounds identified from PAC

圖5 炮附片中4個二萜類生物堿分子籠Fig. 5 The 4 clusters of the diterpenoid alkaloids from PAC

為全面分析炮附片的二萜類生物堿成分并挖掘其潛在的新成分，本研究采用了GNPS 分子網絡結合UPLC-Q-TOF-MS/MS 策略，對PAC 的成分進行快速表征。并根據化合物之間的MS/MS 相似性，PAC 提取物的GNPS 分子網絡被建立，通過GNPS分子網絡去重復分析，成功地鑒定了與二萜類生物堿相關的4個分子籠。利用上述方法在PAC提取物中共鑒定了123 個二萜類生物堿，其中包括34個新二萜類生物堿。這些發(fā)現極大地擴展了我們對炮附片的化學物質基礎的認識，有助于為進一步全面了解其藥理活性，藥效物質基礎及質量控制研究奠定了基礎。