李春榮，鄒小勇，戴宗

1. 中山大學(xué)化學(xué)學(xué)院，廣東廣州510275

2. 中山大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，廣東深圳518107

3. 黔南民族醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，貴州都勻558013

硅是地殼中含量第二大元素，為各種硅相關(guān)應(yīng)用材料提供了豐富而低成本的資源支持。與20世紀(jì)90 年代就已興起的半導(dǎo)體量子點（如CdSe，CdTe 等）相比［1-3］，硅納米粒子是一類由于量子限域效應(yīng)而發(fā)展起來的具有優(yōu)異光學(xué)性能的新型無機(jī)納米材料。近年來，基于硅納米粒子的發(fā)光性能、光穩(wěn)定性、以及在熒光檢測中的高靈敏和快速響應(yīng)能力，硅納米粒子在光學(xué)傳感［4-5］、生物成像［6-8］、及生命醫(yī)學(xué)領(lǐng)域受到廣泛的應(yīng)用并得到長足發(fā)展［9-10］。雖然單一硅前體制備的熒光硅納米材料可以作為熒光信號調(diào)節(jié)介導(dǎo)，但缺乏對生物分子特異性識別能力，無法滿足在熒光分析檢測及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域需要。功能化修飾的硅納米材料不僅能增強(qiáng)硅納米粒子水溶性，同時還可以提供更加準(zhǔn)確的生物成像及熒光分析檢測信息，逐漸成為生物傳感、熒光檢測及成像領(lǐng)域的研究熱點。本文概述了硅納米粒子的功能化修飾，總結(jié)了硅納米粒子在熒光檢測、生物傳感及成像等領(lǐng)域應(yīng)用工作。并對基于硅納米粒子功能化修飾后的前景及應(yīng)用進(jìn)行了展望。

1 硅納米粒子功能化發(fā)展

1.1 金屬離子摻雜

為了滿足硅納米粒子性能需要，通過摻雜金屬離子得到功能改善的硅納米粒子研究越來越受到關(guān)注。近年來，已研制了一系列的金屬或者非金屬離子摻雜的熒光硅納米粒子，并被應(yīng)用于光、電、催化、生化傳感及腫瘤治療等領(lǐng)域［11-17］。2015 年，Mcvey 等［18］通過摻雜的方法將銅、錳、鎳金屬分別摻雜入氯化硅得到熒光性能優(yōu)異的摻雜硅納米粒子，摻雜后的硅納米粒子發(fā)射和吸收波長相比于未摻雜的納米粒子紅移近40 nm，并且激發(fā)態(tài)的動力學(xué)也發(fā)生了明顯改變。金屬離子摻雜硅納米粒子通常需要利用金屬摻雜的硅前體，通過多步反應(yīng)制備得到，所得硅納米粒子的摻雜濃度較高（約0.5%），并且通常是發(fā)出藍(lán)色熒光。2017 年，Chandra［19］利用三乙氧基硅烷首先在金屬（銅、鈷、鎳、錳）鹽溶液中進(jìn)行水解聚合，得到摻雜了金屬離子的(HSiO1.5)n。然后對其進(jìn)行高溫?zé)峤?、酸刻蝕和氫化硅烷化，反應(yīng)后得到了具有良好尺寸分散，熒光發(fā)射峰處于近紅外區(qū)的摻雜硅納米粒子。

1.2 小分子配體修飾

盡管硅納米粒子有毒性小、成本低、豐度高及光學(xué)性能獨特等固有優(yōu)點，硅納米粒子作為典型量子點和商用有機(jī)染料的替代材料在發(fā)光和生物成像應(yīng)用中已被廣泛接受。但如何提高硅納米粒子的光致發(fā)光性能（如超高量子產(chǎn)率、高穩(wěn)定性、尖銳發(fā)射峰）仍是一個具有挑點性問題，制約了硅納米粒子在生物熒光傳感領(lǐng)域應(yīng)用。因此，通過合理設(shè)計配體，對納米粒子表面進(jìn)行修飾，從而實現(xiàn)硅納米粒子功能化，已經(jīng)引起研究者們的廣泛關(guān)注。在近10 年中，科研工作者們通過探究硅納米粒子的表面特性，揭示硅納米粒子與配體之間電子轉(zhuǎn)移模式，選擇設(shè)計合理的功能性分子配體，實現(xiàn)硅納米粒子在量子產(chǎn)率以及發(fā)射波長的調(diào)控［20-24］。2011 年，Zong 等［25］利用聚乙烯亞胺（PEI）羅丹明B 異硫氰酸酯（RBITC）和異硫氰酸熒光素（FITC）支接在硅納米粒子表面，形成多發(fā)射硅納米探針。構(gòu)建的探針分別在518 nm和580 nm 處有發(fā)射峰，Cu2+與PEI/RBITC 發(fā)生作用后，生成穩(wěn)定的螯合物。導(dǎo)致從熒光團(tuán)RBITC 到Cu2+螯合體中心的能量共振轉(zhuǎn)移，探針在580 nm的熒光信號降低，因此完成了比率熒光法對水樣中的銅離子的高靈敏檢測，檢出限為10 nmol/L。2016 年，Chu 等［26］用異硫氰酸羅丹明B 和多巴胺配體共同修飾在硅納米粒子的表面（如圖1所示），利用羅丹明B對pH不敏感以及多巴胺對pH敏感的性質(zhì)，實現(xiàn)了比率型自校準(zhǔn)pH 傳感，結(jié)合硅納米粒子自身的光學(xué)穩(wěn)定性，并將修飾的硅納米探針用于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)pH 的示蹤。2016 年，Li 等［27］報道了利用金屬鈉和萘在聚乙二醇溶劑中反應(yīng)1 h 后，然后滴加溴化硅，繼續(xù)攪拌，再向反應(yīng)器中加入1，2，3，4-四氫咔氮唑進(jìn)行表面氮包覆修飾，制備的硅納米粒子量子產(chǎn)率高達(dá)90%，且半峰寬很窄（40 nm）的黃色熒光硅納米粒子，制備的Silicon nanoparticles （SiNDs）可以與商業(yè)染料以及典型的量子點的熒光性能相比較。2017 年，Li 等［28］用抗體共軛硅量子點納米顆粒和有機(jī)染料對活癌細(xì)胞進(jìn)行了免疫染色的時間可控?zé)晒獬上?，用于同時檢測兩個目標(biāo)物并去除背景自發(fā)光信號。與其他常用生物熒光團(tuán)的熒光壽命相比，共軛修飾的硅納米粒子具有非常長的光致發(fā)光熒光壽命（約25 μs），這種巨大的熒光壽命差異使得時間可控成像成為可能。2018 年，Zhang 等［29］利用硅量子點表面自帶的氨基基團(tuán)，通過共價偶合方法將帶有熒光基團(tuán)的適配體修飾在硅納米粒子表面，通過設(shè)計T-Hg2+-T 堿基結(jié)構(gòu)，準(zhǔn)確識別Hg2+，硅納米粒子熒光不受Hg2+影響，適配體修飾熒光被淬滅，通過熒光比率方式實現(xiàn)了對血清樣品中Hg2+的檢測。

1.3 核酸修飾

DNA 功能化修飾納米探針具備對目標(biāo)物特異性識別作用，利用修飾的DNA 序列與納米粒子的共價偶合或非特異性吸附作用，構(gòu)成一種相對穩(wěn)定的DNA 功能化納米探針，基于修飾DNA 序列與核酸檢測目標(biāo)物之間的堿基互補(bǔ)配對作用，實現(xiàn)對目標(biāo)分析物的特異性識別檢測。2017 年，Zhang等［30］制備了水溶性硅納米粒子SiNDs，將FAM 熒光染料標(biāo)記的適配體AS1411 通過偶合反應(yīng)交聯(lián)劑Sulfo-SMCC 共價修飾至SiNDs，構(gòu)建了一個比率型pH 探針。SiNDs 中氨基與過量Sulfo-SMCC 的琥珀酰亞胺作用，產(chǎn)物（SiNDs-Mal）可以作為對pH不敏感的熒光參比。通過將一端標(biāo)記對pH 敏感的熒光素FAM，另一端標(biāo)記巰基的AS1411 適配體與SiNDs-Mal之間發(fā)生邁克爾（Michael）反應(yīng)，制備了對pH 敏感的適配體功能化比率型熒光探針（SiNDs-Apt-FAM）。2018 年，He 課題組［29］發(fā)現(xiàn)在Hg2+存在下，SiND 對富含T 堿基DNA 上標(biāo)記的染料Rox有熒光淬滅作用，通過共價偶聯(lián)作用，將富含T 堿基的DNA 鏈修飾到SiND，基于T-Hg2+-T作用，構(gòu)建了一種小粒徑，低毒性、抗酸堿性、水溶性比率型Hg2+探針，并實現(xiàn)了對人血清、尿樣中Hg2+定量檢測及HeLa 細(xì)胞中Hg2+成像。2018 年，Ji等［20］等用硫酸魚精蛋白（ps）修飾硅納米粒子，得到ps@SiNPs 基因載體。帶負(fù)電荷質(zhì)粒DNA(pDNA)可以通過靜電相互作用，有效地結(jié)合在ps@SiNPs 基因載體表面，特別是這種基因載體具有穩(wěn)定的高熒光性（光致發(fā)光量子產(chǎn)量PLQY：25%）。此外，基于ps@SiNPs 的基因載體對正常線粒體代謝活動表現(xiàn)出最小毒性作用（例如，人類視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞（ARPE-19）在與相應(yīng)載體孵育48h 后仍能保持90%細(xì)胞活力）。除此之外，通過選擇適宜的反應(yīng)原料，同樣可以制備功能化硅納米粒子。2019 年，Wei 等［31］采用（3-氨基丙基）-三乙氧基硅烷和二乙烯-三胺-五乙酸為前體，水熱法制備了具有藍(lán)色熒光的硅納米粒子，硅納米粒子作為銪離子（Eu3+）共價鍵配體，也是內(nèi)部參考信號。在四環(huán)素（TCs）的作用下，Eu3+發(fā)光強(qiáng)度顯著提高，而SiNDs發(fā)光強(qiáng)度降低，實現(xiàn)熒光比率型檢測TCs的含量，該方法成功用于檢測天然河流樣品和牛奶樣品中TCs的含量。

圖1 基于雙改性SiNPs（DMSiNPs）的pH傳感器的構(gòu)建［26］Fig.1 Construction of dual-modified SiNPs(DMSiNPs)-based pH sensor[26]

2 硅納米粒子的熒光檢測

2.1 離子檢測

金屬離子特別是微量元素金屬離子作為生物大分子組成部分或輔助成分，或用于激素、維生素的構(gòu)成，對維持機(jī)體正常生命活動起著非常重要作用。然而重金屬離子含量超標(biāo)不僅對環(huán)境帶來危害，同時影響人類生命安全。2019 年，本課題組［32］提出了一種新穎的酶輔助目標(biāo)回收擴(kuò)增策略，該策略基于DNA 組裝結(jié)構(gòu)的等溫擴(kuò)增，結(jié)合內(nèi)切酶輔助等溫擴(kuò)增，實現(xiàn)了對血清樣品中Hg2+的高靈敏分析檢測。隨著納米傳感技術(shù)的發(fā)展，納米粒子以獨特的光學(xué)性能和對金屬離子的特異性識別性能被廣泛應(yīng)用，特別是基于硅納米粒子的傳感平臺越來越多的被開發(fā)出來。2018 年，Phan等［33］利用L-抗壞血酸與3-（2-氨基乙基酰胺）-丙基-三甲氧基硅烷（AEAPTMS）一步合成了藍(lán)色熒光硅量子點，利用硅量子點作為熒光傳感器。由于硅量子點表面官能團(tuán)特殊，鉻離子Cr（Ⅵ）能夠選擇性淬滅硅量子點特征發(fā)射峰，通過熒光淬滅機(jī)制實現(xiàn)對水樣中Cr（Ⅵ）快速檢測，硅量子點還可以實現(xiàn)腫瘤細(xì)胞熒光成像。2019 年，Tang等［34］利用臧紅（T）與APTMS 制備了雙發(fā)射的硅納米粒子（SiNPs），實現(xiàn)基于硅納米粒子發(fā)射波長變化的檢測新途徑（如圖2 所示）。硅納米粒子在不同的溶劑中分別顯示不同熒光顏色。其中，SiNPs-A 對Cu2+有特定響應(yīng)，在與Cu2+作用后，SiNPs-A 表面基團(tuán)與Cu2+形成了配位化合物，導(dǎo)致SiNPs表面化學(xué)狀態(tài)發(fā)生改變，在436 nm 處熒光增強(qiáng)比500 nm 處熒光增強(qiáng)更加明顯。繼續(xù)增加Cu2+濃度，SiNPs-A 的熒光逐漸從綠色轉(zhuǎn)化為藍(lán)色，實現(xiàn)了對Cu2靈敏檢測，檢出限為0.91 μmol/L。利用硅納米粒子SiNPs-A 在254 nm 和365 nm 激發(fā)波長下不同熒光顏色，還可以實現(xiàn)復(fù)雜背景下潛在指紋的特征提取。

圖2 臧紅T與APTMS制備硅納米粒子（SiNPs）及其硅納米粒子在不同溶劑中的熒光，以及在水分散硅納米粒子（SiNP-A）在潛在指紋（LFPs）檢測和顯示中的應(yīng)用［34］Fig.2 Illustration of the method for preparation of safranine-dyes silica nanoparticle (SiNPs),the evolution of SiNP-A,SiNP-B,SiNP-C and SiNP-D,and the application of water-dispersed silica nanoparticles(SiNP-A)to the detection and visualization of latent fingerprints(LFPs)[34]

此外，硅納米粒子還可應(yīng)用于陰離子檢測。2018年，Xiang等［35］首先將羅丹明B，APTMS、四乙氧基硅烷在氨氣中室溫條件下合成了染料羅丹明B修飾的硅納米粒子。然后，再將有機(jī)硅烷修飾碳點包覆在硅納米粒子表面，制備出雙發(fā)射的硅納米粒子（CD@RhB-SiNPs）。在波長460 nm 的發(fā)射來自碳點（CDs），波長572 nm 的發(fā)射來自羅丹明B熒光團(tuán)。在酸性條件下，硅納米粒子的熒光可以被溴酸根輕微淬滅，當(dāng)再加入亞硝酸根后，兩個發(fā)射峰強(qiáng)度都出現(xiàn)了明顯降低。來自CDs的熒光發(fā)射峰強(qiáng)度降低比率更加顯著?；谶@一現(xiàn)象，實現(xiàn)了對食品及蔬菜中亞硝酸鹽檢測。據(jù)悉在食用鹽中加入亞鐵氰化鉀(K4[Fe(CN)6])可以防止食鹽結(jié)塊，然而過量的K4[Fe(CN)6]及其分解產(chǎn)物對人類健康和環(huán)境都是有害的。2019 年，Na 等［36］利用3-（2-氨基乙氨基）丙基-二甲氧基硅烷（DAMO）和抗壞血酸鈉（AS），一步合成了具有良好光、熱穩(wěn)定性和水溶性的新型藍(lán)色熒光硅量子點。硅量子點的熒光可以通過靜電作用被K4[Fe(CN)6]顯著淬滅?；谶@一現(xiàn)象，建立了一種選擇性好、靈敏高、速度快的K4[Fe(CN)6]檢測方法。該方法已成功地用于實際樣品中K4[Fe(CN)6]測定。在0.05 ～8.0 g/mL 之間有較寬的線性范圍，檢出限為30 ng/mL。建立的熒光新方法適用于食鹽和腌制食品樣品中K4[Fe(CN)6]檢測，結(jié)果滿意。

2.2 生物小分子檢測

生物小分子例如氨基酸、葡萄糖、三磷酸腺苷（ATP）、多巴胺，維生素，尿酸、抗壞血酸等在維持機(jī)體正常的生理功能方面發(fā)揮著非常重要作用［37，4，38-45］。2015 年，Zhang 等［46］以APTMS 為硅前體，微波法制備了藍(lán)色熒光硅納米粒子。多巴胺可以有效淬滅硅納米粒子熒光，利用多巴胺自身易被氧化為多巴胺醌的性質(zhì)，熒光淬滅機(jī)理是能量通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移從SiNPs 轉(zhuǎn)移到氧化的多巴胺醌分子，硅納米粒子自身熒光被淬滅，實現(xiàn)了對多巴胺靈敏檢測，檢出限為0.3 nmol/L。該方法不需對納米粒子進(jìn)行修飾，根據(jù)硅納米粒子與多巴胺醌之間的能量共振轉(zhuǎn)移，即可完成對多巴胺的檢測，且分析檢測方法簡便，靈敏，易操作。2018 年，Roy 等［9］采用魯棒反膠團(tuán)法制備了烯丙胺功能化的硅量子點（ASQDs），將該材料作為選擇性識別硫氰酸鹽（吸煙者與非吸煙者的生物標(biāo)志物）的熒光探針，基于ASQDs 熒光淬滅和回升，構(gòu)建了選擇性好、高準(zhǔn)確度高的異硫氰酸鹽檢測方法，檢出限為0.1 nmol/L。2019 年，Chen 等［4］利用APTES 和葡萄糖為原料，通過微波一步法制備了藍(lán)色熒光硅納米粒子（如圖3所示）。由于內(nèi)濾光效應(yīng)（IFE），高錳酸鹽可以淬滅硅納米粒子的熒光，通過高錳酸鹽與H2O2的氧化還原反應(yīng)，硅納米粒子的熒光得到恢復(fù)，實現(xiàn)了對H2O2靈敏檢測，檢出限為2.8 nmol/L。由于H2O2是一種重要分子，涉及各種研究，通過葡萄糖催化氧化生成H2O2，構(gòu)建了一種檢測葡萄糖的靈敏傳感器，線性響應(yīng)范圍為0.16～16 μmol/L，檢出限0.11 μmol/L。同年，Long等［42］以3-氨基丙基三乙氧基硅烷和檸檬酸鈉為硅前體和還原劑，通過微波法合成了一種熒光強(qiáng)度更強(qiáng)的SiQDs，由于維生素B12（VB12）吸收峰與SiQDs 熒光發(fā)射峰有非常多重疊，因此通過兩者之間同步重疊協(xié)同作用，VB12 對SiQDs 有很強(qiáng)的淬滅作用，淬滅效率在VB12濃度0.5～16.0 μmol/L之間呈線性增加，檢出限為158 nmol/L。另外，該方法還實現(xiàn)了藥物片劑和人尿液樣品中VB12 的檢測，回收率為97.7%～101.1%。以上均是基于硅納米粒子的生物小分子的檢測，檢測方法靈敏，檢出限較低，開拓了硅納米粒子的應(yīng)用范圍。本課題組在生物小分子檢測方面也進(jìn)行了相關(guān)研究，2019 年，本課題組［47］提出了一種基于MOF 酶復(fù)合材料的all-in-one 傳感器構(gòu)建策略，利用多孔結(jié)構(gòu)和guest-prisoner 角色以及經(jīng)典MOF 發(fā)光傳感特性。將響應(yīng)性MOF 集成到MOF 酶復(fù)合材料中，設(shè)計了一種集催化和發(fā)光功能于一體的多功能復(fù)合材料，并將其整合到單個粒子。將葡萄糖氧化酶（GOx）包裹在一個對氧（O2）敏感、不含貴金屬、發(fā)光CuI 三唑酸框架（MAF-2）中，記為GOx@MAF-2。MAF-2 對O2敏感，GOx@MAF-2 復(fù)合材料對溶解氧表現(xiàn)出快速和可逆的響應(yīng)，不需要顯色底物，級聯(lián)酶反應(yīng)，或電極系統(tǒng)，直接比率傳感檢測人血清中葡萄糖水平。

圖3 （a）合成硅納米粒子的原理；（b）傳感檢測H2O2和葡萄糖［4］Fig.3 (a)Schematic illustrations of SiND synthesis;(b)Application in the sensing of H2O2 and glucose [4]

2.3 核酸檢測

核酸是所有生物分子中最重要的物質(zhì)，在遺傳信息存儲，指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成及表達(dá)信息傳輸方面具有非常重要的作用，許多疾病的根源與核酸序列變化及表達(dá)水平異常有關(guān)［48-51］。MicroRNA（miRNA）是目前研究最為廣泛的一類非編碼短鏈RNA，參與生命活動各個層次的調(diào)節(jié)，并與惡性腫瘤等重大疾病密切相關(guān)，成為疾病診斷生物標(biāo)志物。建立miRNA 快速靈敏檢測方法，對進(jìn)一步深入了解miRNA 與疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，為疾病早期診斷提供新技術(shù)，具有十分重要的理論意義和實用價值［52-54］。近幾年，本課題組［55-57］發(fā)展了多種miRNA 檢測方法，實現(xiàn)了恒溫下對細(xì)胞內(nèi)miRNA 成像分析檢測。2018 年，我們提出了一種基于短探針DSN 信號放大(spDSNSA) 策略，能夠在37 ℃下顯著提高miRNA 分析特異性［58］。通過對不同類型DNA 探針擴(kuò)增反應(yīng)系統(tǒng)性研究，發(fā)現(xiàn)探針與目標(biāo)miRNA 之間的退火速率對擴(kuò)增過程動態(tài)有很大影響。通過縮短DNA 探針長度，spDSNSA特異性顯著提高，且擴(kuò)增效率沒有損失。在檢測let-7a 時，該方法特異性明顯高于傳統(tǒng)DSNSA 方法。硅納米粒子作為一類新型納米材料，在核酸檢測領(lǐng)域也受到廣泛應(yīng)用。Li 等［59］通過一鍋兩步反相微乳液法合成了3- (2,2-雙吡啶) -二氯釕(Ⅱ)六水合物摻雜的二氧化硅(FS)納米粒子（如圖4所示）。首先通過聚乙二醇（PEG）和氨基對FS 進(jìn)行修飾，使其具有更好的生物相容性與生物偶聯(lián)作用，將適配體AS1411 與FS 表面氨基進(jìn)行偶聯(lián)，然后再將分子信標(biāo)(miR-21-MB) 標(biāo)記在FS 探針上，用于特異性識別乳腺癌細(xì)胞MCF-7 中miR-21。通過AS1411 適配體功能化FS 納米顆粒，利用核仁蛋白實現(xiàn)腫瘤細(xì)胞特異性遞送，探針釋放miR-21-MB 與miR-21 發(fā)生鏈雜交反應(yīng)，實現(xiàn)了miR-21 成像。2018年，Zhang等［60］發(fā)現(xiàn)SiNPs與帶負(fù)電荷且有熒光基團(tuán)修飾單鏈DNA（ssDNA）之間有靜電吸附作用，當(dāng)熒光基團(tuán)靠近SiNPs 時，SiNPs 可以淬滅熒光信號。當(dāng)有待檢測miRNA 存在時，miRNA與ssDNA 之間發(fā)生堿基互補(bǔ)配對作用，雙鏈DNA結(jié)構(gòu)改變使熒光基團(tuán)脫離SiNPs 吸附，使熒光信號回升，因此建立了簡單，快捷miRNA 檢測方法，并實現(xiàn)對生物樣品尿液、血清中miR-27a檢測。

圖4 FS-AS/MB的合成和使用FS-AS/MB靶向Theranostics的策略示意圖［59］Fig.4 Schematic of the synthesis of FS-AS/MB and strategy of cancer-targeting theranostics using FS-AS/MB[59]

Ding 等［61］設(shè)計了一種基于SiNPs 與HCR 信號擴(kuò)增的新型、無標(biāo)記、無酶參與的熒光生物傳感器用于miRNA 檢測。在該策略中，兩個DNA 發(fā)卡探針（HP1 和HP2）通過miRNA 觸發(fā)HCR 反應(yīng)，形 成Hemin/G 四 聯(lián) 體DNAzyme。DNAzyme 能 在H2O2作用下將鄰苯二胺（OPD）氧化為2，3-二氨基萘嗪（DAP）。DAP 吸收峰與SiNPs 發(fā)射峰有很好重疊，通過較強(qiáng)內(nèi)濾作用使SiNPs 發(fā)生熒光淬滅，根據(jù)SiNPs熒光降低來確定miRNA濃度。該設(shè)計策略對miRNA 檢測具有很高的選擇性，為基于內(nèi)濾作用SiNPs 熒光傳感策略提供了新視角。

3 硅納米粒子的成像應(yīng)用

3.1 細(xì)菌成像

熒光硅納米粒子具有良好生物相容性及較強(qiáng)抗光漂性，可控載藥能力以及較小納米尺寸，已經(jīng)被美國食品和藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)進(jìn)行首次人體臨床試驗［62-64］。2018年，Meng等［65］利用石墨烯（GO），銀納米顆粒（AgNP），硅（Si）構(gòu)建了三明治納米復(fù)合材料（G@AgNPs@Si），該材料表現(xiàn)出信號強(qiáng)度大、穩(wěn)定、表面增強(qiáng)拉曼散射效果可重現(xiàn)，并具有可靠定量分析能力，該芯片作為一種新型多功能平臺，能夠同時捕獲、識別和滅活細(xì)菌。當(dāng)細(xì)菌為108CFU·mL-1時，細(xì)菌捕獲效率為54%，處理24 h后，抗菌率達(dá)93%。且通過芯片可以很容易區(qū)分進(jìn)入血液中的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌。2019 年，Tang 課題組［66］開發(fā)了多功能硅納米制劑用于成像及治療多種細(xì)菌性病原體引起的感染。硅納米粒子經(jīng)過葡萄糖聚合物功能化（例如，聚[ 4-O-(-a-d-glucopyranosyl)-d-glucopyranose])，并負(fù)載氯化物e6（Ce6）。通過ATP 結(jié)合盒（ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通路機(jī)制，迅速內(nèi)在化到革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細(xì)菌中。通過SiNPs 綠色熒光和Ce6 紅色熒光進(jìn)行細(xì)菌成像，體內(nèi)可檢測105個菌落形成單位。在波長660 nm 照射下，硅納米制劑對金黃色葡萄球菌體內(nèi)光動力抗菌率為98%，對銅綠假單胞菌抗菌率為96%，同時實現(xiàn)對細(xì)菌進(jìn)行成像和治療。

3.2 細(xì)胞成像

硅納米粒子優(yōu)越的熒光性能和良好生物相容性使其具有良好的生物應(yīng)用潛力，基于硅納米粒子的熒光性能及納米載體功能已廣泛應(yīng)用于細(xì)胞成像。Wang 等［67］基于銪（Eu3+）摻雜雙發(fā)射硅納米粒子Eu@SiNPs，實現(xiàn)對活細(xì)胞內(nèi)溫度的高精確度檢測（如圖5所示）。Eu@SiNPs在波長455 nm有藍(lán)色熒光，在波長620 nm 處為紅色熒光。溫度升高，紅色熒光增強(qiáng)；當(dāng)溫度降低時，藍(lán)色熒光增強(qiáng)。Eu@SiNPs 比率型的熒光強(qiáng)度在25～70 ℃溫度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線性響應(yīng)，并且可以實現(xiàn)30 min對活細(xì)胞內(nèi)溫度監(jiān)測。除了以硅納米粒子為功能載體進(jìn)行活細(xì)胞成像之外，2019 年，本課題組［68］通過設(shè)計新型亞穩(wěn)態(tài)啞鈴探針（MxDPs）裝置，克服了傳統(tǒng)探針?biāo)庀拗?，同時提高了轉(zhuǎn)染、抗消化率、組裝動力學(xué)和納米結(jié)構(gòu)均勻性。MxDPs 可在活細(xì)胞中保持穩(wěn)定性長達(dá)16 h，并可通過HCR快速產(chǎn)生均勻致密的DNA 納米結(jié)構(gòu)。來自熒光共振能量轉(zhuǎn)移級聯(lián)積累的尖銳信號進(jìn)一步減小了系統(tǒng)波動影響。基于MxDPs 的HCR 方法在細(xì)胞裂解液和緩沖液下對miR-27a 的分析表現(xiàn)出相同性能，檢出限為3.2 pmol/L，比傳統(tǒng)發(fā)夾探針低44 倍。MxDPHCR 法能清晰區(qū)分正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，并提供了細(xì)胞內(nèi)特異性miRNA更準(zhǔn)確定量信息。

圖5（a）基于Eu@SiNPs用于檢測細(xì)胞內(nèi)溫度的制作示意圖；（b）硅納米粒子與Eu3+形成配合物；（c）在紫外光照射下拍攝不同溫度下Eu@SiNPs的光致發(fā)光光譜［67］Fig.5 (a)Schematic illustration of fabricating Eu@SiNPs-based nanothermometer for intracellular temperature detection;(b)Local coordination process between SiNPs and Eu complex;(c)Photographs under UV irradiation and corresponding photoluminescence spectra of Eu@SiNPs under different temperature[67]

2018年，Chen等［5］以3-[2-(2-氨基乙基酰胺)乙基氨基]丙基-三甲氧基硅烷(AEEA)和玫瑰紅(RB)為原料，水熱法制備了高熒光量子產(chǎn)率的綠色熒光硅納米粒子。該納米粒子具有優(yōu)越細(xì)胞穿透能力，能夠靶向到細(xì)胞溶酶體，并且不受溶酶體pH環(huán)境影響，可以對細(xì)胞溶酶體長達(dá)48 h 實時成像監(jiān)測。2019 年，Roy 等［69］利用APTMS 和乙二醇為原料水熱法制備了藍(lán)色硅納米粒子（SQD），然后通過EDC 偶合反應(yīng)將葉酸修飾在硅納米粒子表面，得到了在紫外區(qū)和近紅外區(qū)均有熒光的雙發(fā)射硅納米粒子（FSQD）。FSQD 探針分別在445 nm 和845 nm 處有熒光發(fā)射峰，并且SQD 和FSQD 均有良好pH 穩(wěn)定性和光穩(wěn)定性。FSQD 細(xì)胞毒性低，并有良好熒光性能，不僅可以用來活細(xì)胞成像，還可以用于標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)胎球蛋白A。與傳統(tǒng)羅丹明類染料間接標(biāo)記方法相比，該方法具有數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠、操作簡單、穩(wěn)定、不存在間接標(biāo)記導(dǎo)致的非特異性結(jié)合。

3.3 活體成像

近年來，科研工作者們已經(jīng)開展了許多基于熒光硅納米粒子在活體成像方面的研究。2012 年，He 等［70］提出了一種新型基于FRET 的大Stokes 位移近紅外熒光二氧化硅納米顆粒（LSS-NFSiNPs）。選擇三（2，2-雙吡啶）-二氯-六水合物（RuBpy）和亞甲基藍(lán)（MB）兩種高水溶性染料作為模型給體受體對。在二氧化硅納米顆粒中同步摻雜RuBpy和MB 制得LSS-NFSiNPs。通過優(yōu)化二氧化硅納米粒子中摻雜RuBpy 和MB 的摩爾比，在二氧化硅基體中發(fā)生從RuBpy 到MB 的能量轉(zhuǎn)移，生成具有強(qiáng)熒光和大Stokes位移（200 nm）的近紅外熒光二氧化硅納米粒子。LSS-NFSiNPs可以有效提高辨別熒光信號并區(qū)分其他背景信號，實現(xiàn)在活體動物中實時深層熒光成像。

為了避免引入有機(jī)試劑及復(fù)雜硅納米粒子修飾過程，2015 年，Wu 課題組［71］介紹了一種環(huán)境友好的制備熒光SiNPs方法（如圖6所示）。實驗采用硅藻作為綠色硅前體，不需要額外化學(xué)試劑。在溫和反應(yīng)條件下可以快速（10 min內(nèi)）制備出較窄發(fā)射光譜寬度（例如，半最大寬度（FWHM）為30 nm）的紅色硅納米粒子，并將其應(yīng)用于生物體內(nèi)和體外熒光成像。進(jìn)一步將紅色硅納米粒子與常規(guī)藍(lán)色納米粒子分別注射到秀麗線蟲生殖系統(tǒng)和消化系統(tǒng)，可以觀察到在秀麗線蟲子宮及小腸中分別呈現(xiàn)出紅色熒光和藍(lán)色熒光成像。

圖6 SiNPs的仿生制備及同于細(xì)胞內(nèi)外的多色成像示意圖［71］Fig.6 Schematic illustration of biomimetic synthesis of fluorescent SiNPs and their use for in vitro and in vivo dual-color imaging[71]

4 展 望

硅納米粒子作為一類新型納米材料，在熒光檢測及生物傳感等領(lǐng)域中受到了廣泛關(guān)注及應(yīng)用。但在硅納米粒功能化修飾及應(yīng)用方面還需要考慮以下幾個方面的問題：

1）制備近紅外發(fā)光、量子產(chǎn)率高、水溶性、大尺寸的硅納米粒子是建立有效生物傳感的關(guān)鍵；

2）在硅納米粒子功能化修飾過程中，應(yīng)盡可能避免有機(jī)配體修飾或重金屬摻雜等為納米探針帶來潛在生物毒性問題；

3）在面對多個分析物檢測時，需要修飾多個熒光響應(yīng)信號，對分析過程帶來冗雜操作步驟，以及不可避免各個熒光信號之間的交互影響也是急需解決的問題；

4）在基于單一發(fā)射納米粒子熒光分析檢測及細(xì)胞成像中，細(xì)胞攝取探針的濃度差異，可能導(dǎo)致假陽性結(jié)果出現(xiàn)。

因此，從構(gòu)建生物相容性好、高效、高靈敏、高選擇性的生物傳感及分析方法出發(fā)，通過合理設(shè)計反應(yīng)路線，制備條件溫和、修飾步驟簡單、多功能化、高量子產(chǎn)率的硅納米粒子是值得發(fā)展的研究方向。