劉吉爽，段連政，徐文慧，常麗靜，姜柔齊，宮喜艷，邱智東，陳新

(長春中醫(yī)藥大學藥學院，長春 130117)

葵花盤為菊科植物向日葵(HelianthusannuusL.)收取果實后的干燥花序托，為中成藥玉盤消渴片組成成分之一，藥材標準收載于《上海市中藥材標準》(1994年版)[1]，飲片炮制規(guī)范收載于《浙江省炮制規(guī)范》(1986年版)[2]?？ūP鮮品含水量豐富，產地加工、炮制及貯藏不當均易誘生真菌。中藥成分復雜，即使除去霉變藥材表面真菌，一些肉眼難以檢識到的真菌依然殘留其中，霉變藥材一旦使用，安全性將難以保障。

國家標準、地方標準甚至國際標準對于中藥(飲片)及相關制劑的霉變檢查尚無完善的評價方法，現(xiàn)有技術主要通過肉眼、顯微鏡或真菌毒素檢查。但并非所有霉變藥材均能檢出真菌毒素，某些藥材(如陳皮)采用此方法不能準確判斷是否霉變。針對此問題，本實驗以葵花盤為研究對象，通過制備霉變標志物，并以此為對照，建立了葵花盤霉變評價方法，同時對此方法在中藥安全性評價的應用進行研究，為葵花盤安全性檢查及質量評價體系的完善奠定基礎，為中藥霉變安全性評價方法的建立提供新思路。

1 儀器與材料

1.1儀器配有DAD檢測器的1260型安捷倫高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)，SY-型旋轉蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)。

1.2材料硅膠G薄層板(青島海洋化工廠)，甲苯(批號：20160617，分析純)、乙酸乙酯(批號：20180126，分析純)、甲酸(批號：20160612，分析純)、石油醚(批號：20170525，分析純)、甲醇(批號：20170106，分析純)均為北京化工廠產品?？ūP對照藥材為實驗室自制，葵花盤其他樣品采集于吉林省洮南市區(qū)、洮南市二龍鄉(xiāng)等地，經長春中醫(yī)藥大學張景龍老師鑒定為菊科植物向日葵(HelianthusannuusL.)收取果實后的干燥花序托。霉變樣品為貯藏時發(fā)霉，霉變肉眼可見。

2 方法與結果

2.1葵花盤真菌的鑒定

2.1.1黃曲霉毒素檢查采用《中華人民共和國藥典》(2015年版)四部液質聯(lián)用檢測方法分別對葵花盤未霉變及霉變樣品的4種黃曲霉毒素(黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1和黃曲霉毒素G2)進行測定[3]。結果均未檢測到黃曲霉毒素，葵花盤霉變與黃曲霉毒素無直接聯(lián)系，所生真菌并非黃曲霉。

2.1.2真菌的鑒別取不同產地葵花盤霉變樣品4份(樣品因貯藏不當滋生真菌)，分別挑取真菌進行革蘭染色，于顯微鏡下觀察菌落及菌絲特征。各樣品所生真菌存在一定相似之處：菌落多粗糙，帶不同顏色；菌絲多分隔，且均為革蘭陽性菌。結果見表1、圖1。

a.樣品1；b.樣品2；c.樣品3；d.樣品4。

表1 葵花盤霉變樣品真菌特征

2.2霉變標志物的研究

2.2.1葵花盤霉變前后薄層檢視取霉變葵花盤樣品1 g，加50倍甲醇超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL溶解。以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(24：7：1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(波長365 nm)下檢視。結果葵花盤霉變前后薄層色譜斑點行為不一致，葵花盤霉變樣品主斑點顏色變淺且伴隨綠色熒光斑點出現(xiàn)。見圖2。

1.對照藥材；2，3.吉林省洮南市區(qū)樣品；4，5.吉林省洮南市區(qū)(霉變)樣品；6，7.吉林省洮南市二龍鄉(xiāng)樣品；8，9.吉林省洮南市二龍鄉(xiāng)(霉變)樣品。

2.2.2霉變相關性驗證為驗證綠色熒光斑點與葵花盤霉變的相關性，實驗配制不同比例霉變樣品，照“2.2.1”項下方法進行薄層檢視。結果隨霉變比例增加，樣品中原存的藍紫色斑點的熒光強度下降，綠色熒光斑點強度反之增強。見圖3。

1.對照藥材；2.10%霉變樣品；3.20%霉變樣品；4.30%霉變樣品；5.40%霉變樣品；6.50%霉變樣品；7.100%霉變樣品。

2.2.3霉變標志物的確定剝離霉變葵花盤表面真菌，照“2.2.1”項下方法制備真菌提取液、葵花盤對照藥材提取液及霉變葵花盤提取液，分別吸取適量進行薄層檢視。結果在與霉變藥材色譜相應的位置上，真菌顯單一的綠色熒光斑點，霉變樣品除與真菌對應斑點外仍顯其他斑點。推測葵花盤霉變所產生的綠色熒光斑點其一為真菌所致，確定該成分為霉變標志物；另一個可能為相關化學成分轉化所致。見圖4。

1，2.真菌；3，4.霉變藥材；5.對照藥材。

綜上，可證明綠色熒光斑點的產生與葵花盤霉變密切相關，薄層檢識出現(xiàn)綠色熒光斑點，即可認為樣品發(fā)生一定霉變。

2.2.4霉變樣品最小檢出量的測定取葵花盤霉變樣品0.5 g，按照“2.2.1”項下方法，考察葵花盤霉變樣品最小檢出量。結果顯示，霉變最小檢出量為4.11 μg，該方法靈敏。結果見圖5，編號1～7樣品斑點霉變含量依次為2630，1320，658，329，164，82，41，25，10，4，2 μg。

1-11.霉變藥材。

2.2.5霉變陽性對照藥材制備取不同產地的葵花盤藥材2個，每個花盤分成均等2份，其中一份保留，另一份連續(xù)5 d每天噴水適量，于自封袋中密封，室溫下培養(yǎng)真菌。約2周樣品發(fā)生霉變，取霉變樣品及對應藥材照“2.2.1”項下方法實驗。同一產地葵花盤霉變前后薄層色譜行為有明顯差異；比較不同批次霉變樣品的薄層色譜發(fā)現(xiàn)，斑點行為不一致，但與霉變標志物相比均顯相同綠色熒光斑點，故確定該斑點為評價葵花盤霉變的標志。結果見圖6。

1.真菌樣品；2.大安市樣品；3.大安市樣品(霉變)；4.安廣市樣品；5.安廣市樣品(霉變)。

2.3霉變標志物的制備

2.3.1霉變樣品提取、分離取霉變葵花盤樣品粉末15 g，加10倍量乙酸乙酯超聲提取30 min，濾過，旋干，加少量乙酸乙酯使溶解，加硅膠適量，拌勻，水浴揮干溶劑，以石油醚為溶劑濕法裝柱，干法上樣，依次用石油醚、石油醚：乙酸乙酯(20：1)混合溶液、石油醚：乙酸乙酯(20：2)混合溶液洗脫，用“2.2.1”項下薄層色譜法追蹤霉變標志物，以石油醚：乙酸乙酯(20：2)混合溶液洗脫可檢識到目標成分，收集合并洗脫液，回收溶劑，得霉變標志物的粗提物。

2.3.2霉變標志物的精制取霉變標志物粗提物適量點于薄層板，按照“2.2.1”項下方法檢識，霉變標志物在紫外波長254，365 nm下均顯綠色熒光，將此設置為液相檢識波長。

取適量的粗提物加甲醇溶散，經孔徑0.22 μm濾膜濾過，于安捷倫1260高效液相色譜儀(配有DAD檢測器)進樣，以乙腈：水(35：65)為流動相，柱溫25 ℃，254，365 nm雙波長同時檢測。目標成分約39 min開始出峰，富集目標峰餾分，濃縮得葵花盤霉變標志物。見圖7。

A.365 nm；B.254 nm；1.霉變標志物。

2.4霉變評價方法的建立分別取葵花盤對照藥材、真菌、不同批次霉變樣品，按照“2.2.1”項下方法實驗。結果顯示，各霉變樣品薄層色譜均顯與霉變標志物相同的綠色熒光斑點，該方法簡便易行、靈敏度高，可作為評價葵花盤霉變的有效方法。見圖8。

1-10.霉變藥材；11.對照藥材；12.霉變標志物。

綜上，形成葵花盤霉變安全性評價方法如下：取樣品粉末適量，加50倍量甲醇超聲30 min，濾過，蒸干，加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。分別吸取霉變標志物溶液5 μL、供試品溶液5～10 μL點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(12：3.5：0.5)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視，不得顯與霉變標志物相同顏色斑點。

2.5方法適用性考察

2.5.1霉變藥材檢視①薄層檢視：溫度25～28 ℃，相對濕度約80%為真菌繁殖的最適條件[4]，為考察霉變安全性評價方法的適用性，收集柴胡、澤瀉、葛根、升麻等12種霉變藥材，照“2.4”項下方法對不同霉變藥材進行實驗。葛根、黃芪、黃精、槐米、陳皮、人參、知母、桔梗霉變樣品均顯與霉變標志物相同顏色熒光斑點，未霉變藥材無此斑點；升麻、柴胡、澤瀉及茯苓未霉變及霉變樣品與霉變標志物相比，均顯微弱熒光。結果見圖9，10。

1.槐米；2.槐米(霉變)；3.黃精；4.黃精(霉變)；5.陳皮；6.陳皮(霉變)；7.人參；8.人參(霉變)；9.澤瀉；10.澤瀉(霉變)；11.葛根；12.葛根(霉變)；13.霉變標志物。

②成分驗證：取霉變陳皮0.5 g，加30倍量乙酸乙酯超聲提取30 min，濾過，濾液蒸干，用硅膠濕法裝柱，干法上樣，分別用石油醚、石油醚：乙酸乙酯(20：1)、石油醚：乙酸乙酯(20：2)混合溶劑洗脫，薄層色譜法追蹤并收集與霉變標志物對應位置顯相同熒光的洗脫液，合并洗脫液，適當濃縮，與霉變標志物同“2.3.2”項方法實驗。觀察霉變陳皮與霉變標志物吸收曲線，基本確定為同一類成分，三維譜圖見圖11，12。

1.升麻；2.升麻(霉變)；3.柴胡；4.柴胡(霉變)；5.桔梗；6.桔梗(霉變)；7.知母；8.知母(霉變)；9.黃芪；10.黃芪(霉變)；11.茯苓；12.茯苓(霉變)；13.霉變標志物。

圖11 霉變標志物三維圖譜

2.5.2菌類藥物檢視①薄層檢視：茯苓為多孔菌科真菌茯苓的干燥菌核[7]，霉變標志物為葵花盤霉變樣品中提取，故顯與霉變標志物相同斑點具有一定道理。為驗證茯苓薄層結果的推斷，實驗分別取多孔菌科真菌豬苓、銹革孔菌科白樺茸及僵蠶(幼蟲感染白僵菌而致死的干燥體)同茯苓照“2.2.1”項下方法進行實驗。

結果4種菌類藥物均含與霉變標志物相同斑點，提示菌類藥物中可能存在某些與霉變標志物相似的成分，故該法不適于菌類藥物的霉變安全性評價。見圖13。

圖12 霉變陳皮三維圖譜

1.白樺茸；2.豬苓；3.僵蠶；4.茯苓。

②成分驗證：按照“2.5.1②”項下方法對白樺茸進行實驗，觀察霉變標志物與白樺茸吸收曲線(圖11，14)，基本確定為同一類成分。

3 討論

中藥成分復雜，貯存、運輸、處理不當均易造成霉變，相關研究表明葵花盤具有豐富的營養(yǎng)物質，如萜類、多糖、黃酮、綠原酸等[4-8]，可廣泛應用于食用菌類的培養(yǎng)和牲畜飼料的制備[9-12]。真菌鑒定結果表明，葵花盤所滋生的真菌并非黃曲霉，但均為革蘭陽性菌。革蘭陽性菌是引起多種疾病的主要致病菌，對人體健康存在潛在危害，霉變是葵花盤廣泛應用的重要阻礙。

圖14 白樺茸三維圖譜

葵花盤的膜質托片排列緊密，對于滋生在其內部的真菌難以觀察。傳統(tǒng)的中藥霉變評價方法檢測靈敏度低、應用范圍受限，本實驗提出從霉變中藥或其所生真菌中分離制備霉變標志物，建立以薄層指紋圖譜技術為指導的中藥霉變安全性評價新方法，所建立的霉變評價方法簡便、靈敏度高，能夠有效評價葵花盤的安全性。

中藥的安全性評價適用性實驗表明，升麻、柴胡、澤瀉未霉變藥材與霉變標志物薄層均顯微弱熒光，推測可能為樣品貯藏時間過長而滋生肉眼不易觀察的真菌[13-16]。茯苓、豬苓、白樺茸本身為菌類，僵蠶為感染了白僵菌的干燥體，可能有與霉變標志物同類成分存在，故安全性評價結果呈假陽性?；泵?、陳皮、人參等霉變樣品的薄層色譜與霉變標志物均顯相同顏色斑點，分析所含成分，均含大量的皂苷、多糖、蛋白質等[17-19]，這些成分對于微生物繁殖增長具有促進作用。該法可作為評價多糖、皂苷及蛋白質含量較高的植物中藥安全性的有效手段，但不適于菌類藥材，具體適用的范圍有待進一步驗證。

《中華人民共和國藥典》2020年版編制要點指出，要進一步完善中藥材安全性檢測方法[20]。本實驗初步研究建立了葵花盤霉變安全性評價方法，所建立方法靈敏、簡便、有效，對于保證中藥臨床使用安全具有重要意義，為中藥安全性評價研究提供新思路。課題組將進一步對霉變標志物的化學結構及毒性進行研究，并對霉變中藥顯相同熒光的成分進一步分析，期待日后可為《中華人民共和國藥典》等行業(yè)標準的中藥材安全性檢查方法提供參考。