阿潤，王秀蘭，策力木格，王徽

(內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院，通遼 028000)

非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是由于三酰甘油在肝細(xì)胞內(nèi)大量聚集引起的慢性肝病，可發(fā)展成肝硬化或肝癌[1]。全球流行病學(xué)調(diào)查表明，普通成人NAFLD患病率6.3%～45%，包括中國在內(nèi)的亞洲多數(shù)國家NAFLD患病率處于中上水平[2]。NAFLD是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)病名，蒙醫(yī)中沒有完全匹配的病名。多數(shù)蒙醫(yī)學(xué)者認(rèn)為NAFLD屬于“通拉嘎未消化癥”的范圍，蒙醫(yī)治療該病時以調(diào)理體素，平衡“三根”，清熱解毒，清“肝希拉熱”，祛“巴達(dá)干希拉”，抑制“赫依”增生為原則，針對各種類辨證施治[3]。

蒙藥紅花三味散由紅花、梔子、菊花三味藥組成，具有清血熱、清肝熱和保肝利膽功效，主要用于肝損傷和脂肪肝[4]。始載于《甘露四部》[5]，其中菊花和梔子為國家衛(wèi)生健康委員會認(rèn)定的藥食同源藥材，紅花既是中醫(yī)蒙醫(yī)常用藥材，也可作為保健食品。前期實(shí)驗(yàn)研究表明，紅花三味散對D-氨基半乳糖誘導(dǎo)的急性肝損傷大鼠具有顯著的保護(hù)作用，其保肝作用機(jī)制可能與抑制氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)有關(guān)[4]。由于紅花三味散具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的協(xié)同作用等特點(diǎn)，其有效成分的作用靶點(diǎn)及分子機(jī)制目前尚不清楚。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)突破了傳統(tǒng)“單靶點(diǎn)、單途徑”的研究理念，從整體性、系統(tǒng)性的角度研究中藥及復(fù)方的成分、靶點(diǎn)、疾病之間的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，為闡明民族醫(yī)藥科學(xué)內(nèi)涵提供了新的思路與方法[6]。因此，筆者借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的思路，探討紅花三味散治療NAFLD的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)用軟件及在線工具本文研究需要使用較多軟件及在線工具，如活性成分篩選時利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)，化合物靶標(biāo)預(yù)測時使用STITCH和Swiss Target Prediction，利用在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM)和DisGeNET分別進(jìn)行NAFLD發(fā)病機(jī)制靶標(biāo)的預(yù)測，在繪制網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋱D時需要安裝Cytoscape軟件，詳細(xì)內(nèi)容見表1。

表1 本文研究使用的軟件及在線工具

1.2紅花三味散中活性成分的篩選通過檢索TCMSP分別收集紅花、梔子和菊花中主要的化學(xué)成分，按照化學(xué)成分的口服生物利用度[oral bioavailability(OB)>30%]、類藥性[drug-likeness(DL)>0.18]的化學(xué)成分作為候選活性成分。

1.3紅花三味散化合物的靶標(biāo)預(yù)測將化合物導(dǎo)入PubChem中得到化合物的SMILE格式和2D structure，依據(jù)化合物相似性搜索和反向分子對接的方法采用STITCH、Swiss Target Prediction和TCMSP等網(wǎng)站預(yù)測化合物靶標(biāo)。對以上3個數(shù)據(jù)庫的預(yù)測結(jié)果匯總、去重，整理收集到的靶點(diǎn)導(dǎo)入Uniprot數(shù)據(jù)庫，將所有靶基因名稱校正為其官方名稱(official gene symbol)，作為紅花三味散化合物的預(yù)測靶標(biāo)。

1.4構(gòu)建紅花三味散活性成分-作用靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)根據(jù)紅花三味散中主要有效成分預(yù)測的靶點(diǎn)，建立活性成分-作用靶點(diǎn)之間的相互對應(yīng)關(guān)系。將活性成分和作用靶點(diǎn)作為網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)(node)，兩者之間的相互作用作為網(wǎng)絡(luò)中的連接(edge)，制成Excel表格，導(dǎo)入Cytoscape軟件中，運(yùn)用插件Network Analyzer計算網(wǎng)絡(luò)特征。

1.5NAFLD相關(guān)基因的收集從OMIM和DisGeNET數(shù)據(jù)庫中通過檢索關(guān)鍵詞“non-alcoholic fatty liver disease” “nonalcoholic fatty liver disease”和“NAFLD”收集疾病相關(guān)靶點(diǎn)，整理后建立NAFLD相關(guān)靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集。通過紅花三味散活性成分靶點(diǎn)和NAFLD靶點(diǎn)匹配，得到紅花三味散治療NAFLD的潛在靶點(diǎn)。

1.6蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建String數(shù)據(jù)庫是一種包含已知和預(yù)測的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的數(shù)據(jù)庫。將紅花三味散的關(guān)注靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫，獲取蛋白之間的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。

1.7生物學(xué)功能和信號通路注釋分析將關(guān)注基因?qū)隓AVID數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路注釋分析，并用錯誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate，F(xiàn)DR)錯誤控制法(FDR<0.05)對P值作檢驗(yàn)校正，最終設(shè)定閾值P<0.05，篩選差異有統(tǒng)計學(xué)意義的生物過程[7]，利用OmicShare繪圖。

1.8網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建采用Cytoscape軟件的Merge功能構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)模型。網(wǎng)絡(luò)中每個節(jié)點(diǎn)的拓?fù)鋵W(xué)用度數(shù)(degree)和接近中心(central)度進(jìn)行評估。節(jié)點(diǎn)度數(shù)和接近中心度由Cytoscape插件Network Analyzer進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1紅花三味散中活性成分的篩選在TCMSP數(shù)據(jù)庫里對其ADME性質(zhì)進(jìn)行評價，分別篩選得到紅花化學(xué)成分22種、梔子化學(xué)成分15種、菊花化學(xué)成分20種。其中槲皮素、山奈酚和β-谷甾醇為三味藥共有成分，豆甾醇為紅花及梔子共有成分，γ-谷甾醇和木犀草素為紅花及菊花共有成分，鯊烯為梔子及菊花共有成分。所有活性化合物經(jīng)去重后得到47種，基本信息見表 2。

表2 紅花三味散中的活性成分

2.2活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析使用Cytoscape軟件將47種化合物與430個靶點(diǎn)構(gòu)成化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)?；衔?靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)總共包括477個節(jié)點(diǎn)和1458條邊。其中，紅色節(jié)點(diǎn)代表紅花化合物，綠色節(jié)點(diǎn)代表菊花化合物，藍(lán)色節(jié)點(diǎn)代表梔子化合物，淺藍(lán)色節(jié)點(diǎn)代表化合物對應(yīng)的潛在靶點(diǎn)，每條邊則表示化合物分子與靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系(圖 1)。Degree的大小代表網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵度，槲皮素的作用靶點(diǎn)最多(degree>170)，其次是山奈酚(degree>82)、木犀草素(degree>77)、異鼠李素(degree>56)及黃芩苷元(degree>53)等。由此得知同一個活性成分作用于多個靶點(diǎn)，且這些具有多靶點(diǎn)的活性成分可能是藥理作用的核心點(diǎn)，這體現(xiàn)了紅花三味散多成分、多靶點(diǎn)的協(xié)同作用特點(diǎn)。

紅色代表紅花藥材化學(xué)成分；綠色代表梔子藥材化學(xué)成分；深藍(lán)色代表菊花藥材化學(xué)成分；黃色代表2種藥材或3種藥材共同成分；淺藍(lán)色代表靶點(diǎn)。

2.3潛在靶點(diǎn)的預(yù)測從DesGeNET和OMIM數(shù)據(jù)庫中收集到的227個NAFLD疾病相關(guān)的基因與活性成分的430個基因相映射，篩選出了42個紅花三味散治療NAFLD的潛在靶點(diǎn)，具體信息見表3。

表3 紅花三味散活性成分的潛在靶點(diǎn)信息

2.4蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析將上述42個潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫中，限定物種為人，從而獲得蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系，導(dǎo)入Cytoscape軟件中構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，見圖2。圖2中節(jié)點(diǎn)表示蛋白質(zhì)，邊表示蛋白質(zhì)間的相互關(guān)聯(lián)，共涉及39個節(jié)點(diǎn)，239條邊。用節(jié)點(diǎn)的大小和顏色表示degree值的大小，節(jié)點(diǎn)越大對應(yīng)的degree值越大，顏色由深紅變淡粉對應(yīng)degree值的大小。用邊的粗細(xì)表示Combine score值的大小，顏色由深藍(lán)變淺藍(lán)對應(yīng)Combine score值的大小。邊越粗，顏色深藍(lán)，邊粗時Combine score值越大。在靶點(diǎn)中，度值最高的前5位是：INS(degree>32)、白細(xì)胞介素(IL)-6(degree>29)、腫瘤壞死因子(TNF)(degree>26)、JUN(degree>23)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator activated receptor gamma，PPARG)(degree>21)。

圖2 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)圖

2.5潛在靶點(diǎn)的GO富集將紅花三味散的關(guān)鍵靶點(diǎn)通過DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO富集分析，即從生物過程(biological process)、分子功能(molecular function)和細(xì)胞組分(cellular component)角度進(jìn)行功能注釋。GO富集分析結(jié)果(P<0.05，F(xiàn)DR<0.05)表明紅花三味散在生物過程中與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、藥物結(jié)合、老化等相關(guān)性最大；在分子功能中與DNA結(jié)合和藥物結(jié)合及類固醇激素受體活性相關(guān)性最大；在細(xì)胞組分中與質(zhì)膜外側(cè)面相關(guān)性最大。詳細(xì)信息見圖3。

圖3 GO富集分析

2.6KEGG通路分析將紅花三味散的42個關(guān)注基因富集在KEGG通路時，富集結(jié)果(P<0.05，F(xiàn)DR<0.05)得到與NAFLD關(guān)聯(lián)度最高的13條相關(guān)通路，分別為PPAR信號通路、胰島素抵抗通路、NAFLD通路、乙型肝炎通路、南美錐蟲病通路、癌癥通路、炎癥性腸病通路、利什曼病通路、破骨細(xì)胞分化通路、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎通路、TNF信號通路、百日咳通路及MAPK信號通路。詳細(xì)信息見圖4。

圖4 KEGG通路富集分析

2.7紅花三味散的網(wǎng)絡(luò)分析使用Cytoscape建立了紅花三味散治療NAFLD的“活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖”，如圖5所示，能直觀地看到紅花三味散的關(guān)鍵靶點(diǎn)分布于不同的信號通路，從不同角度揭示多成分-多靶點(diǎn)-多通路的相互協(xié)調(diào)的作用特點(diǎn)。選取與NAFLD密切相關(guān)的NAFLD通路、胰島素抵抗通路和乙型肝炎通路，反向?qū)ふ伊伺c這些通路相關(guān)的靶點(diǎn)、化合物及藥材，并使用Cytoscape分析網(wǎng)絡(luò)特征，觀察化合物與靶點(diǎn)的作用情況以及靶點(diǎn)在生物通路中的分布情況。網(wǎng)絡(luò)中介度和緊密度越高表示該靶點(diǎn)或化合物在生物網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用[8]。通過網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)INS、JUN、TNF、PPARA、RELA、IKBKB和IL-6等介度較高的7個靶點(diǎn)可能是紅花三味散調(diào)控NAFLD、胰島素抵抗和乙型肝炎三條通路的關(guān)鍵靶點(diǎn)，詳細(xì)信息見圖6、表4。紅花三味散調(diào)控NAFLD通路的機(jī)制：在單純性脂肪肝(simple steatosis)通路中化合物槲皮素、山奈酚及木犀草素等活性成分有效地抑制IL-6、TNF及INS等靶點(diǎn)，從而降低高胰島素血癥的產(chǎn)生及新脂肪酸的合成；在非酒精性脂肪肝炎通路(non-alcoholic steatohepatitis)中，紅花三味散的有效成分槲皮素、黃芩苷元、MOL002694等能夠抑制TNF-α、CYP2E1、IL-1、IL-6、IKBKB、FAS及TGF-β1等靶點(diǎn)，拮抗脂肪肝炎形成、細(xì)胞死亡、炎癥反應(yīng)、肝臟纖維化及肝細(xì)胞損傷。

圖5 活性成分-靶點(diǎn)-通路圖

圖6 NAFLD通路、胰島素抵抗通路、乙型肝炎通路相關(guān)網(wǎng)絡(luò)模型

表4 NAFLD通路、胰島素抵抗通路和乙型肝炎通路網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)

3 討論

蒙藥是蒙醫(yī)臨床用于治療和預(yù)防疾病的一種主要途徑，也是蒙醫(yī)藥研究的熱點(diǎn)之一。蒙醫(yī)方劑由多味藥靈活配伍而成，其多成分、多靶點(diǎn)既是蒙醫(yī)藥的特點(diǎn)，也是深入研究蒙藥的難點(diǎn)及重點(diǎn)。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)整合了化學(xué)、醫(yī)學(xué)、生物數(shù)據(jù)、網(wǎng)絡(luò)模擬方法，其多靶點(diǎn)、多途徑、多層次的評價體系與策略，目前在中醫(yī)藥及民族醫(yī)藥的研究中有很大的預(yù)測作用[9]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究為探討蒙藥的作用機(jī)制及發(fā)現(xiàn)蒙藥的潛在作用靶點(diǎn)提供了新途徑。

本研究發(fā)現(xiàn)紅花三味散治療NAFLD的化合物以黃酮類化合物為主，拓?fù)鋵W(xué)分析結(jié)果表明槲皮素的作用靶點(diǎn)最多，其次是山奈酚、木犀草素、異鼠李素、黃芩苷元。這些成分與NAFLD預(yù)測的核心靶標(biāo)有高度相關(guān)性。紅花藥材中槲皮素、山奈酚及木犀草素的含量分別為0.197，0.394，1.45 μg·g-1[10-11]。梔子藥材中西紅花酸和京尼平龍膽雙糖苷的含量分別為0.889，35.566 mg·g-1[12-13]。梔子藥材中金合歡素、槲皮素、木犀草素、蒙花苷、二咖啡?？鼘幩岬暮糠謩e為1.760，2.515，50.63 mg·g-1、0.301%和0.833 mg·g-1[14-17]。研究表明，槲皮素可以降低肝星狀細(xì)胞活化，預(yù)防肝纖維化，通過抑制TGF-β1/Smads信號通路和激活PI3K/AKT信號通路，抑制肝纖維化引起的自噬，從而減輕肝損傷[18]。山奈酚對急性肝衰竭小鼠具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能通過調(diào)控核因子-κB信號通路而減輕肝臟炎癥反應(yīng)[19]。木犀草素具有緩解乙醇所致的肝損傷的作用，其機(jī)制可能與降低自由基生成、減輕脂質(zhì)過氧化有關(guān)[20]。異鼠李素對醋氨酚致人肝細(xì)胞的損傷具有拮抗作用，作用機(jī)制可能為提高細(xì)胞活性，改善受損細(xì)胞形態(tài)，提高超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶活性，降低丙二醛含量，降低丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)的釋放量[21]。由此得知上述degree值大的化合物通過不同的作用機(jī)制發(fā)揮保肝作用。

通過KEGG信號通路分析發(fā)現(xiàn)，紅花三味散治療NAFLD主要通過調(diào)控胰島素抵抗通路、NAFLD通路、PPAR信號通路、乙型肝炎通路、癌癥通路、TNF信號通路及MAPK信號通路而實(shí)現(xiàn)。NAFLD發(fā)病機(jī)制尚不明確，臨床研究發(fā)現(xiàn)幾乎所有患者都有肝臟及周圍組織胰島素抵抗，其嚴(yán)重程度與NAFLD病情進(jìn)展正相關(guān)[22]。周偉青等[23]研究發(fā)現(xiàn)茵陳蒿湯對NAFLD伴胰島素抵抗大鼠具有保肝作用，其機(jī)制可能是調(diào)節(jié)脂肪因子水平、改善糖脂代謝紊亂，從而逆轉(zhuǎn)肝細(xì)胞損傷有關(guān)。MAPK信號通路也是胰島素抵抗信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一，目前發(fā)現(xiàn)5種MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[24]。王昱[25]發(fā)現(xiàn)油橄欖葉提取物可通過調(diào)節(jié)TLR4-p38 MAPK信號通路緩解肝臟脂肪變性和炎癥因子反應(yīng)，抑制NAFLD的進(jìn)展。PPAR對維持脂質(zhì)代謝的平衡起著十分重要的調(diào)節(jié)作用。PPARα在肝臟高表達(dá)，它可通過調(diào)節(jié)與脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)脂肪酸β氧化，并減少脂肪酸和三酰甘油的合成，從而減輕肝臟內(nèi)脂質(zhì)蓄積[26]。趙喜等[27]研究發(fā)現(xiàn)二苯乙烯經(jīng)PPARα信號通路激活自噬從而治療大鼠高脂性脂肪肝。由此可知紅花三味散治療NAFLD是通過直接或間接調(diào)控胰島素抵抗信號通路、MAPK信號通路、PPAR信號通路和NAFLD通路等來實(shí)現(xiàn)。

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法初步預(yù)測了紅花三味散治療NAFLD的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、核心靶點(diǎn)及可能的作用機(jī)制，為紅花三味散的后續(xù)開發(fā)研究提供了新思路和方向，下一步課題組將結(jié)合分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。