李可欣，張男男，侯瑞麗，張文龍，高龍，苗曉涵，戈娜

(1.包頭醫(yī)學院營養(yǎng)與食品健康研究所，包頭 014040；2.包頭醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院骨外科，包頭 014010)

酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)是指長期和(或)大量酒精攝入所導致的肝臟損傷，肝細胞凋亡、脂肪變性、炎癥、壞死等是它的主要表現(xiàn)形式[1-2]。世界衛(wèi)生組織(WHO)在2018年《全球酒精與健康報告》中指出，全世界每年因飲酒而死亡的人數(shù)占全部死亡人數(shù)的5.3%，約300萬人，其中2013年北京302醫(yī)院接診的ALD患者人數(shù)是2002年的2倍[3]。因此積極尋找一種預防及輔助治療ALD的天然活性物質(zhì)具有重要意義。沙棘(HippophaerhamnoidesL.)蒙名其察日嘎納，含多種生物活性成分，是珍貴的藥食兩用植物[4]。本課題組前期從沙棘中提取的熊果酸是一種天然植物化合物，近年來已被廣泛應用于食品、藥品及化妝品中[5]。熊果酸具有保肝、抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種作用[6]。因此，本實驗以沙棘熊果酸為研究對象，通過酒精誘導大鼠肝損傷模型，探討沙棘熊果酸對酒精誘導性肝損傷的改善效果及可能的作用機制，為酒精誘導肝損傷的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1材料沙棘果由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學于呼和浩特市和林縣境內(nèi)野生沙棘林采集、提供，經(jīng)內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學生命科學學院王玉珍教授鑒定(Shaji-2012-1215)，分離純化由內(nèi)蒙古科技大學進行，并應用紅外光譜、氫核磁共振譜(1H-NMR)和碳核磁共振譜(13C-NMR)鑒定為五環(huán)三萜類化合物[7]。熊果酸分子式為C30H48O3，相對分子質(zhì)量為456.68，含量93.8%。

1.2主要試劑和儀器無水乙醇購自西隴科學股份有限公司；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、三酰甘油(TG)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒購自Roche公司(批號：11684817910)；鼠抗GAPDH多克隆抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司(批號：sc-47724)；BCA蛋白濃度試劑盒(批號：P0012)、超敏電化學發(fā)光試劑盒(批號：P0018FS)、RIPA裂解液(批號：P0013B)、苯甲基磺酰氟(批號：ST506)、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)蛋白上樣緩沖液(批號：P0015)均購自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所；羊抗兔Bcl-2(批號：MABC573)、Bax(批號：AB2915)、cleaved caspase-3(批號：ABC495)多克隆抗體購自美國Millipore公司；辣根酶標記山羊抗兔IgG(批號：ZB-2301)、辣根酶標記山羊抗小鼠IgG(批號：ZB-2305)均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

RM2135型石蠟切片機(德國LEICA公司)；CX41照相顯微鏡(日本Olympus公司)；BAYGENE電泳儀(北京百晶生物技術(shù)有限公司)；550型全自動多功能酶標儀(美國BIO-RAD公司)；UVP-GDS-8000凝膠成像分析系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司)。

1.3實驗動物與分組SPF級雄性Wistar大鼠50只，體質(zhì)量(190±10)g，購自山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(魯)2014-0001。大鼠于室溫(23±2)℃、相對濕度50%～60%、12 h光照循環(huán)的條件下進行飼養(yǎng)。

將適應性飼養(yǎng)7 d后的大鼠根據(jù)隨機數(shù)字表進行完全隨機分組，分為正常對照組、模型對照組和熊果酸小、中、大劑量組，共5組，每組10只。給藥方式參考馬浩然等[2]報道的方法，即模型對照組參考給予50%(V/V)乙醇8 mL·kg-1·d-1×2周+12 mL·kg-1·d-1×6周；正常對照組給予等體積的0.9%氯化鈉溶液；熊果酸小、中、大劑量組分別給予熊果酸50，100，150 mg·kg-1·d-1，1 h后給予和模型對照組等體積乙醇。持續(xù)灌胃8周，最后一次灌胃后禁食不禁水12 h，將大鼠稱重后用3%戊巴比妥鈉30 mg·kg-1麻醉。腹主動脈取血，將血清以3000 r·min-1離心15 min(r=15 cm)；留取肝組織，將部分肝組織進行固定，其余組織均置于-80 ℃冰箱中凍存。

1.4指標檢測

1.4.1蘇木精-伊紅(HE)染色法觀察每組大鼠肝組織病理情況將0.9 cm×0.9 cm×0.5 cm新鮮肝大葉組織放置于10%甲醛中固定，石蠟包埋切片，HE染色，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察各組大鼠肝組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變。

1.4.2沙棘熊果酸對各組大鼠血清轉(zhuǎn)氨酶及肝組織TG含量的影響各組大鼠ALT和AST水平檢測嚴格按照ALT/AST測定試劑盒說明書進行，用酶標儀測量505 nm處吸光度(A值)并計算ALT和AST的含量。

取新鮮肝組織1 g，經(jīng)過漂洗，拭干，剪碎后，加入適量磁珠及0.9%氯化鈉溶液900 μL勻漿5 min，經(jīng)3000 r·min-1離心15 min(r=15 cm)后取上清液，檢測方法嚴格按照TG說明書進行，用酶標儀測量500 nm處A值，樣本含量與A值成正比，以mmol·g-1表示。

1.4.3TUNEL染色法檢測各組大鼠肝細胞的凋亡情況取新鮮肝臟組織做石蠟切片，嚴格按照TUNEL細胞凋亡試劑盒進行操作，光鏡下(×200)觀察，以凋亡細胞核內(nèi)為黃色或棕黃色顆粒沉淀物為判定標準，計算肝細胞總數(shù)、凋亡肝細胞數(shù)、肝細胞凋亡率，分析大鼠肝細胞凋亡情況。

1.4.4免疫印跡法(Western blotting)測定每組大鼠肝組織Bcl-2、Bax及cleaved caspase-3的蛋白表達量 裂解大鼠肝組織提取總蛋白，12 000 ×g離心20 min，并收集上清液，采用BCA法測定蛋白濃度。按5份樣品體積與1份loading buffer混勻，100 ℃孵育3 min，上樣體積為10～20 μL，經(jīng)5%～12% SDS-PAGE分離樣品后將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，以5%脫脂奶粉封閉2 h，按操作加入相應的一抗(GAPDH抗體1：800、Bcl-2抗體1：1000、Bax抗體1：1000、cleaved caspase-3抗體1：1000)及適當稀釋倍數(shù)的二抗。凝膠成像系統(tǒng)攝相分析。以GAPDH作為內(nèi)參，用靶蛋白積分吸光度(IA)值/GAPDH(IA)值顯示靶蛋白相對水平。

2 結(jié)果

2.1沙棘熊果酸對酒精誘導肝損傷大鼠肝組織病理改變的影響HE染色結(jié)果顯示，正常對照組肝細胞輪廓完整且結(jié)構(gòu)緊密、以中央靜脈為中心向四周呈放射狀分布；模型對照組肝細胞排列紊亂，且細胞質(zhì)內(nèi)散在空泡，肝組織內(nèi)炎癥細胞聚集，肝細胞呈現(xiàn)片狀壞死；而熊果酸小、中、大劑量組肝細胞索排列均有不同程度的改善，炎癥細胞浸潤程度及壞死區(qū)域降低明顯(圖1)。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.熊果酸大劑量組；D.熊果酸中劑量組；E.熊果酸小劑量組。

2.2沙棘熊果酸對酒精所致肝損傷大鼠血清ALT、AST及肝臟TG含量的影響見表1。模型對照組大鼠血清ALT、AST及肝臟TG含量均明顯高于正常對照組(P<0.05)；而熊果酸中、大劑量組大鼠血清ALT、AST的活力及肝臟TG含量均明顯降低(P<0.05)，且逐漸接近于正常對照組，熊果酸小劑量組大鼠血清ALT、AST的活力及肝臟TG含量與模型對照組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表1 5組大鼠血清ALT、AST及肝臟TG含量比較

2.3沙棘熊果酸對酒精誘導肝損傷大鼠肝細胞凋亡的影響TUNEL結(jié)果顯示，正常對照組染色較淡，偶見凋亡細胞；模型對照組染色不均勻，可見大量棕褐色固縮或呈碎片狀的細胞核，且染色的陽性細胞多集中在肝小葉、中央靜脈肝附近，肝細胞凋亡率高達77%，與正常對照組比較，明顯增高(P<0.05)；與模型對照組比較，熊果酸小、中、大3個劑量組染色陽性細胞逐漸減少，染色變淺，核碎裂現(xiàn)象明顯降低，凋亡率分別為63%，47%和30%，且熊果酸小劑量組與熊果酸大劑量組比較，肝細胞凋亡率明顯升高(P<0.05)(圖2和圖3)。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.熊果酸大劑量組；D.熊果酸中劑量組；E.熊果酸小劑量組。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.熊果酸大劑量組；D.熊果酸中劑量組；E.熊果酸小劑量組。①與正常對照組比較，t=-69.823～-9.457，P<0.05；②與模型對照組比較，t=3.561～17.611，P<0.05；③與熊果酸小劑量組比較，t=-6.767，P<0.05。

2.4沙棘熊果酸對ALD大鼠肝組織Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3蛋白表達的影響 與正常對照組比較，模型對照組大鼠肝組織中Bcl-2蛋白表達量降低明顯(P<0.05)，Bax及cleaved caspase-3蛋白表達量均明顯增高(P<0.05)；熊果酸中、大劑量干預的大鼠相較模型對照組而言，肝組織Bcl-2蛋白表達量明顯增高(P<0.05)，而熊果酸小劑量組大鼠肝組織Bcl-2蛋白表達量無明顯差異，熊果酸大劑量組大鼠肝組織Bax蛋白表達量明顯減少(P<0.05)，熊果酸小劑量組、中劑量組大鼠肝組織Bax蛋白表達量與模型對照組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，熊果酸中、大劑量組大鼠肝組織cleaved caspase-3蛋白表達量較模型對照組明顯降低(P<0.05)，但熊果酸小劑量組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖4。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.熊果酸大劑量組；D.熊果酸中劑量組；E.熊果酸小劑量組；①與正常對照組比較，t=-19.682～12.778，P<0.05；②與模型對照組比較，t=-14.409～20.195，P<0.05；③與熊果酸小劑量組比較，t=-11.288～15.734，P<0.05。

3 討論

目前關(guān)于大鼠酒精致肝損傷的造模方式有4種：自由飲用模型、胃內(nèi)喂養(yǎng)模型、腹腔注射模型及酒精灌胃模型[8]，但由于飲用量無法控制、攝入途徑不符合等不可控因素，本研究選用酒精灌胃方式，與酒精誘導肝損傷的生理生化和病理特征及人的飲酒習慣相結(jié)合，給予階梯式灌胃，成功建立酒精致肝損傷大鼠模型[9]。HE染色觀察肝組織變化是臨床上反映肝臟損傷程度的金標準[10]，ALT和AST是檢測肝臟損傷的敏感指標[11]，其活性水平的高低可在一定程度上體現(xiàn)生物體內(nèi)肝細胞損傷的情況[12]。實驗表明，慢性酒精中毒可引起肝細胞中TG不能正常輸出，導致肝臟中TG的堆積[13]。本研究表明，模型對照組血清ALT、AST及肝組織TG含量均明顯升高，肝細胞部分呈現(xiàn)片狀壞死，肝細胞索排列不規(guī)則，且存在大量脂肪空泡，這與肝損傷導致TG堆積互相印證。而經(jīng)熊果酸干預8周后，大鼠肝細胞壞死程度明顯降低，肝細胞索排列較為整齊，血清ALT、AST及肝組織TG含量均有不同程度下降。

長期攝入酒精可致生物體內(nèi)肝細胞異常凋亡，其凋亡程度與酒精致肝損傷程度呈正相關(guān)[14]，故如何減輕肝細胞凋亡程度對ALD的預防與治療具有重要意義。參與肝細胞凋亡發(fā)生發(fā)展的基因有許多，與其關(guān)系最密切的調(diào)控基因為Bcl-2家族的Bcl-2及Bax基因[15]。Bcl-2基因具有抗肝細胞凋亡的作用，而Bax基因可促進肝細胞凋亡，這對基因分別以同源及異源二聚體存在[16]。當Bcl-2過表達時形成異源二聚體Bcl-2-Bax，可有效減輕多因素誘導的肝細胞凋亡；當Bax過表達時形成Bax同源二聚體，可直接誘導肝細胞發(fā)生凋亡[17]。因此，Bcl-2與Bax的表達在體內(nèi)常呈現(xiàn)一種平衡狀態(tài)。一旦失衡，將對肝細胞的存活或凋亡產(chǎn)生影響。通過增加Bcl-2的表達可抑制caspase-3的激活而減緩肝細胞凋亡的進程[18]。細胞凋亡的程序啟動大多由天冬氨酸的特異水解酶(caspase)引發(fā)，caspase-3是caspase家族中細胞凋亡促進過程中最主要的執(zhí)行者[19]。caspase-3在一般情況下以無活性的酶原(Pro-caspase)形式存在，當肝細胞凋亡程序被激活時，Pro-caspase將轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘牧呀鈉aspase-3，其可促進肝細胞的凋亡過程[20]。所以，cleaved caspase-3常被作為判斷肝細胞凋亡情況的重要指標之一。caspase-3激活將使Bcl-2的功能由抑制凋亡轉(zhuǎn)變?yōu)橛|發(fā)凋亡，而阻止caspase-3的激活將抑制Bcl-2的降解[21]。本研究結(jié)果顯示，熊果酸組大鼠肝組織中Bax蛋白表達明顯受到抑制，而Bcl-2蛋白的表達明顯增加，阻止caspase-3的活化。提示熊果酸可能通過調(diào)節(jié)肝組織中Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3蛋白的表達起到抗凋亡作用，進而發(fā)揮防治ALD的作用。

綜上所述，沙棘熊果酸能夠明顯改善ALD，其機制可能為調(diào)節(jié)抑凋亡蛋白Bcl-2、促凋亡蛋白Bax和執(zhí)行凋亡蛋白cleaved caspase-3的表達，進而降低肝細胞異常凋亡。因此，沙棘熊果酸可作為一種具有潛在保肝作用及藥用價值的天然植物化合物，值得進一步開發(fā)和研究。