崔敏萱，沈歆，蓋守昌，井娟，王力彬，張生勇，劉雪英

(中國(guó)人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院四大隊(duì)；2.藥學(xué)系藥物化學(xué)教研室，西安 710032)

胰島素抵抗(insulin resistance，IR)是糖尿病發(fā)展進(jìn)程中首先出現(xiàn)的臨床表現(xiàn)。長(zhǎng)期IR會(huì)誘發(fā)一系列代謝性疾病，如肥胖、糖調(diào)節(jié)損傷、2型糖尿病、脂肪肝、脂代謝紊亂等[1]。肝臟是胰島素作用的主要靶器官，能夠儲(chǔ)存大量肝糖原，通過(guò)糖異生途徑將乳酸等代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟牵S持機(jī)體血糖穩(wěn)定。研究表明，2型糖尿病患者的肝臟糖異生水平較正常人明顯升高，因此肝臟糖異生是糖尿病治療中不可忽視的重要環(huán)節(jié)[2]。

建立IR肝細(xì)胞模型有助于深入研究IR發(fā)生機(jī)制，篩選抗IR藥物。目前已成熟應(yīng)用的、最常見(jiàn)的肝細(xì)胞模型是高胰島素誘導(dǎo)HepG2肝癌細(xì)胞IR模型[3]。大鼠正常肝細(xì)胞IR模型較少見(jiàn)，目前國(guó)內(nèi)僅有少量文獻(xiàn)報(bào)道，筆者尚未見(jiàn)國(guó)外文獻(xiàn)關(guān)于系統(tǒng)建立大鼠正常肝細(xì)胞IR模型及機(jī)制研究的報(bào)道，所以篩選出誘導(dǎo)正常肝細(xì)胞IR模型的條件有重要意義。

脂肪酸是構(gòu)成人體脂肪和類脂的基本物質(zhì)，大量流行病學(xué)研究表明，肥胖者血清游離脂肪酸(free fatty acid，F(xiàn)FA)水平普遍升高。高游離脂肪酸血癥是肥胖引發(fā)IR的重要致病因素[4]。高濃度FFA能夠抑制基礎(chǔ)狀態(tài)和胰島素刺激狀態(tài)的組織對(duì)葡萄糖的攝取與利用，造成組織對(duì)胰島素的敏感性降低。利用FFA的這種特性，可以將其作為誘導(dǎo)不同類型細(xì)胞產(chǎn)生IR的工具。油酸、硬脂酸和棕櫚酸是血液中FFA常見(jiàn)的3種類型，均屬飽和長(zhǎng)鏈脂肪酸。研究報(bào)道，利用棕櫚酸可以建立HepG2和3T3-L1細(xì)胞的IR模型[3，5]。

BRL-3A是大鼠正常肝細(xì)胞系，是研究正常肝細(xì)胞增殖及氧化損傷常用細(xì)胞模型。胰島素受體底物1(insulin receptor substance 1，IRS-1)與胰島素受體作用后，參與胰島素及其信號(hào)通路傳導(dǎo)，是胰島素信號(hào)通路上游的一個(gè)重要分子。IRS-1被抑制后，進(jìn)一步抑制磷脂酰肌醇-3'-羥基激酶(phosphoinositide-3-kinase，PI3K)途徑，使葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(glucose transporter 4，GLUT4)被抑制，從而使組織不能有效利用葡萄糖，發(fā)生IR[6]。本實(shí)驗(yàn)以BRL-3A細(xì)胞為研究對(duì)象，通過(guò)棕櫚酸誘導(dǎo)系統(tǒng)建立大鼠正常肝細(xì)胞IR模型，并初步探索其發(fā)生機(jī)制。

1 材料與方法

1.1主要儀器Western blotting系統(tǒng)(Bio-Rad，美國(guó))；酶標(biāo)儀(Molecular Devices，美國(guó))；高速低溫離心機(jī)(Eppendorf，美國(guó))；二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Electron，美國(guó))；YI-875SA醫(yī)用超凈工作臺(tái)(江蘇吳江市凈化設(shè)備總廠)。

1.2試藥與試劑棕櫚酸(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：1001002747，含量≥99%)；胰島素(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：18883664，含量≥99%)，MEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司，批號(hào)：AD21573269)；胎牛血清(美國(guó)Hyclone公司，批號(hào)：P140022)；牛血清清蛋白(albumin from bovine serum，BSA，美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：CO0332，含量≥98%)；CCK8檢測(cè)盒(七海生物科技有限公司)；葡萄糖檢測(cè)盒(南京建成生物工程研究所)；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所，批號(hào)：P00125)；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrop-horesis，SDS-PAGE)試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所，批號(hào)：P0012A)；IRS-1、PI3K、磷酸化絲氨酸-蘇氨酸激酶(phosphorylated serine-threonine kinase，p-AKT)、AKT、GLUT4抗體(美國(guó)Abcam公司，批號(hào)分別為：GR95405-23，GR266942-1，GR242901-23，GR242901-21，GR262376-1)。

1.3細(xì)胞BRL-3A大鼠正常肝細(xì)胞(陜西帆昌生物科技公司)。

1.4棕櫚酸、胰島素儲(chǔ)備液配置取棕櫚酸25.6 mg[7]溶于無(wú)水乙醇1 mL中，制成100 mmol·L-1棕櫚酸溶液，溶解時(shí)加熱至50 ℃，取0.25 mL 加入預(yù)熱55 ℃的10% BSA溶液4.75 mL 溶解，得到終濃度為5 mmol·L-1的棕櫚酸母液。經(jīng)孔徑0.2 μm水相濾膜濾過(guò)后，-20 ℃保存，實(shí)驗(yàn)前37 ℃預(yù)熱后按比例稀釋。取胰島素固體2.904 mg溶于5 mL、pH值2～3的鹽酸(HCl)中，制成1×10-4mol·L-1胰島素母液。經(jīng)孔徑0.2 μm水相濾膜濾過(guò)后，-20 ℃保存，實(shí)驗(yàn)前按比例稀釋。

1.5BRL-3A細(xì)胞培養(yǎng) BRL-3A細(xì)胞復(fù)蘇后，培養(yǎng)于含10% 胎牛血清、100 kU·L-1青鏈霉素的MEM培養(yǎng)基中，在5%二氧化碳(CO2)、37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待匯合度達(dá)90%后，1：2傳代，或按每孔約1×104個(gè)接種于96孔培養(yǎng)板，匯合度超過(guò)80%后分組實(shí)驗(yàn)。

1.6棕櫚酸、胰島素對(duì)BRL-3A細(xì)胞增殖的影響(CCK8實(shí)驗(yàn)) 將細(xì)胞以每孔約1×104個(gè)接種于96孔培養(yǎng)板中。按“1.5”項(xiàng)方法培養(yǎng)至匯合度超過(guò)80%后。然后分成正常對(duì)照組、棕櫚酸組(0.025，0.05，0.1，0.2，0.25，0.4，0.6 mmol·L-1棕櫚酸)、胰島素組(1×10-7mol·L-1胰島素)及空白試劑組(5×10-7mol·L-1HCl、0.6%乙醇)，每組設(shè)置8組復(fù)孔。采用CCK8法分別測(cè)定6，12，24，36 h時(shí)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況。CCK8檢測(cè)：終止培養(yǎng)后，加入含CCK8的新培養(yǎng)液100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，充分反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm處各孔的吸光度值。

1.7不同時(shí)間不同濃度棕櫚酸、胰島素對(duì)BRL-3A細(xì)胞葡萄糖代謝的影響 實(shí)驗(yàn)分組：正常對(duì)照組、棕櫚酸組(0.025，0.05，0.1，0.2，0.25，0.4 mmol·L-1棕櫚酸)，每組設(shè)置12組復(fù)孔。按“1.5”項(xiàng)方法將細(xì)胞接種于96孔板，待匯合度超過(guò)80%后，按實(shí)驗(yàn)分組加入含不同誘導(dǎo)因素的MEM培養(yǎng)基。通過(guò)葡萄糖氧化酶-過(guò)氧化物酶法[8]，分別測(cè)定2，6，12，24 h時(shí)培養(yǎng)液中含有葡萄糖的濃度，即可通過(guò)計(jì)算得到各組細(xì)胞的葡萄糖消耗量。

葡萄糖氧化酶-過(guò)氧化物酶檢測(cè)：終止培養(yǎng)后，吸出所有培養(yǎng)液并按說(shuō)明書(shū)操作加入工作液，混勻后37 ℃，保溫15 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)在505 nm各孔的吸光度值。

1.8不同時(shí)間不同濃度棕櫚酸誘導(dǎo)后BRL-3A細(xì)胞對(duì)基礎(chǔ)糖轉(zhuǎn)運(yùn)和胰島素刺激糖轉(zhuǎn)運(yùn)的影響 在檢測(cè)“1.7”項(xiàng)各組培養(yǎng)液中所剩糖濃度后，吸出原培養(yǎng)液，每組一分為二，即每組6個(gè)復(fù)孔：一半加入含1×10-7mol·L-1胰島素的MEM培養(yǎng)基，另一半加入空白的MEM，分別測(cè)2，24，48，72 h后培養(yǎng)液中所剩葡萄糖濃度。葡萄糖含量測(cè)定同“1.7”項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。

1.9免疫印跡法檢測(cè)棕櫚酸誘導(dǎo)BRL-3A細(xì)胞產(chǎn)生IR后IRS-1等靶蛋白表達(dá)的變化 實(shí)驗(yàn)分組：正常對(duì)照組、IR組。按“1.5”項(xiàng)方法培養(yǎng)至匯合度超過(guò)90%后，正常對(duì)照組加入空白的MEM培養(yǎng)基，IR組加入含0.2 mmol·L-1棕櫚酸的MEM培養(yǎng)基，作用12 h后，采用免疫印跡法，將各組細(xì)胞用預(yù)冷的組織裂解液裂解并用超聲儀打碎，然后在4 ℃以12 000×g離心15 min，取上清液作樣本，用BCA蛋白定量法測(cè)定各樣本蛋白含量。用10%SDS-PAGE 凝膠分離蛋白，然后用半干電轉(zhuǎn)的方法將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯[poly(vinylidene fluoride)，PVDF]膜上，再用5%脫脂奶粉封閉，室溫下封閉1 h后加入一抗4 ℃封閉過(guò)夜，洗膜后加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫輕搖封閉1 h。PBST充分洗膜后，加入適量電化學(xué)發(fā)光液涂勻，凝膠成像分析系統(tǒng)顯影、攝像、分析。

2 結(jié)果

2.1BRL-3A細(xì)胞的培養(yǎng)結(jié)果 BRL-3A細(xì)胞復(fù)蘇后形成細(xì)胞懸液，吹勻后按要求種于96孔板或者培養(yǎng)瓶中，6～10 h形成單層貼壁細(xì)胞，鏡下觀察細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，不規(guī)則排列，形態(tài)多為梭形、三角形或者多邊形，呈上皮樣外觀。

2.2棕櫚酸、胰島素對(duì)BRL-3A細(xì)胞增殖的影響 空白試劑組(5×10-7mol·L-1HCl、0.6%乙醇)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的吸光度值與正常對(duì)照組比較均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明空白試劑對(duì)細(xì)胞活性無(wú)干擾。結(jié)果見(jiàn)圖1。0.025～0.2 mmol·L-1棕櫚酸及1×10-7mol·L-1胰島素作用于BRL-3A細(xì)胞36 h以內(nèi)，其吸光度值與正常對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明其對(duì)細(xì)胞增殖沒(méi)有抑制作用。0.25 mmol·L-1棕櫚酸作用于細(xì)胞時(shí)，從24 h開(kāi)始吸光度值與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，0.4和0.6 mmol·L-1棕櫚酸從6 h開(kāi)始其吸光度值與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，顯示其對(duì)BRL-3A細(xì)胞增殖產(chǎn)生抑制作用。結(jié)果見(jiàn)圖2。

A.正常對(duì)照組；B.空白試劑組(5×10-7 mol·L-1 HCl)；C.空白試劑組(0.6%乙醇)。

A.正常對(duì)照組；B.0.6 mmol·L-1棕櫚酸組；C.0.4 mmol·L-1棕櫚酸組；D.0.25 mmol·L-1棕櫚酸組；E.0.2 mmol·L-1棕櫚酸組；F.0.1 mmol·L-1棕櫚酸組；G.0.05 mmol·L-1棕櫚酸組；H.0.025 mmol·L-1棕櫚酸組；I.1×10-7 mol·L-1胰島素組。①與正常對(duì)照組比較，t=3.061～59.900，P<0.01；②與正常對(duì)照組比較，t=2.592，18.860，P<0.05。

2.3不同時(shí)間不同濃度棕櫚酸對(duì)BRL-3A細(xì)胞葡萄糖代謝的影響 BRL-3A細(xì)胞用不同濃度棕櫚酸培養(yǎng)2 h后，0.4 mmol·L-1棕櫚酸組葡萄糖消耗量較正常對(duì)照組低(P<0.01)，表明高濃度棕櫚酸作用2 h后BRL-3A細(xì)胞已開(kāi)始出現(xiàn)IR；6 h后，0.25，0.2 mmol·L-1PA組葡萄糖消耗量開(kāi)始降低，與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；12 h后，0.4，0.25，0.2 mmol·L-1PA組葡萄糖消耗量與正常對(duì)照組比較明顯降低(P<0.01)，表明3種濃度作用12 h后均出現(xiàn)顯著IR表征；24 h后，0.4，0.25，0.2及0.1 mmol·L-1PA組葡萄糖消耗量均較正常對(duì)照組低(P<0.01，P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)圖3。

A.正常對(duì)照組；B.0.4 mmol·L-1棕櫚酸組；C.0.25 mmol·L-1棕櫚酸組；D.0.2 mmol·L-1棕櫚酸組；E.0.1 mmol·L-1棕櫚酸組；F.0.05 mmol·L-1棕櫚酸組；G.0.025 mmol·L-1棕櫚酸組。①與正常對(duì)照組比較，t=4.262～31.400，P<0.01；②與正常對(duì)照組比較，t=2.185～2.685，P<0.05。

2.4不同時(shí)間不同濃度棕櫚酸誘導(dǎo)后BRL-3A細(xì)胞對(duì)基礎(chǔ)糖消耗和胰島素刺激糖消耗的影響 0.25，0.2 mmol·L-1棕櫚酸誘導(dǎo)BRL-3A細(xì)胞12，24 h和0.1 mmol·L-1棕櫚酸誘導(dǎo)BRL-3A細(xì)胞24 h后，加胰島素刺激的糖轉(zhuǎn)運(yùn)和不加胰島素刺激的基礎(chǔ)糖轉(zhuǎn)運(yùn)與正常對(duì)照組比較，2，12，24 h時(shí)培養(yǎng)液中葡萄糖的濃度均較高，說(shuō)明其對(duì)胰島素刺激的糖轉(zhuǎn)運(yùn)和基礎(chǔ)糖轉(zhuǎn)運(yùn)均產(chǎn)生抑制，且抑制作用可持續(xù)24 h。并且0.25和0.2 mmol·L-1棕櫚酸加胰島素刺激的糖轉(zhuǎn)運(yùn)組培養(yǎng)液中葡萄糖的濃度減少的程度呈現(xiàn)時(shí)間累加效應(yīng)。0.4 mmol·L-1棕櫚酸誘導(dǎo)BRL-3A細(xì)胞6 h后，加胰島素刺激的糖轉(zhuǎn)運(yùn)和不加胰島素刺激的基礎(chǔ)糖轉(zhuǎn)運(yùn)與正常對(duì)照組比較，2，12，24 h時(shí)培養(yǎng)液中葡萄糖的濃度均較高，說(shuō)明其作用6 h即能對(duì)胰島素刺激的糖轉(zhuǎn)運(yùn)和基礎(chǔ)糖轉(zhuǎn)運(yùn)產(chǎn)生抑制作用。結(jié)合“2.2”項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，表明0.4 mmol·L-1棕櫚酸作用6 h和0.25 mmol·L-1棕櫚酸作用24 h后對(duì)BRL-3A細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。另外，BRL-3A細(xì)胞IR模型與棕櫚酸作用的時(shí)間和濃度有一定的劑量-時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。結(jié)果見(jiàn)表1，2。

表1 不同時(shí)間不同濃度棕櫚酸誘導(dǎo)BRL-3A細(xì)胞后培養(yǎng)液中葡萄糖的濃度

2.5棕櫚酸誘導(dǎo)的BRL-3A細(xì)胞IR模型穩(wěn)定性評(píng)估

2.5.1IR模型BRL-3A細(xì)胞長(zhǎng)期基礎(chǔ)葡萄糖消耗變化 通過(guò)上述“2.3”“2.4”項(xiàng)葡萄糖消耗實(shí)驗(yàn)，以及“2.2”項(xiàng)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，初步確定使用0.2 mmol·L-1棕櫚酸作用12 h作為誘導(dǎo)BRL-3A細(xì)胞IR模型的條件。使用該條件誘導(dǎo)BRL-3A細(xì)胞IR后，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，發(fā)現(xiàn)其基礎(chǔ)葡萄糖消耗量較正常對(duì)照組低(t2 h=2.842，P<0.05；t12 h=11.280，t24 h=17.430，t48 h=35.750，P<0.01)，且隨著培養(yǎng)時(shí)間增加，細(xì)胞葡萄糖消耗量與正常對(duì)照組比較減少量逐漸增加，表明該IR模型在48 h內(nèi)較穩(wěn)定。結(jié)果見(jiàn)圖4。

①與正常對(duì)照組比較，P<0.05；②與正常對(duì)照組比較，P<0.01。

表2 不同時(shí)間不同濃度棕櫚酸和胰島素刺激BRL-3A細(xì)胞后培養(yǎng)液中葡萄糖的濃度

2.5.2胰島素抵抗BRL-3A細(xì)胞長(zhǎng)期胰島素刺激的葡萄糖消耗變化 同“2.5.1”項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，使用0.2 mmol·L-1棕櫚酸作用12 h作為誘導(dǎo)BRL-3A細(xì)胞IR模型的條件。使用該條件誘導(dǎo)BRL-3A細(xì)胞產(chǎn)生IR后，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，同樣發(fā)現(xiàn)其胰島素刺激的葡萄糖消耗量與正常對(duì)照組比較明顯降低(t2 h=6.336，t12 h=12.090，t24 h=19.550，t48 h=27.550，P<0.01)，且隨著培養(yǎng)時(shí)間增加，細(xì)胞葡萄糖消耗量與正常對(duì)照組比較減少量逐漸增加，表明該IR模型在48 h內(nèi)較穩(wěn)定。結(jié)果見(jiàn)圖5。

①與正常對(duì)照組比較，P<0.01。

2.6免疫印跡法檢測(cè)棕櫚酸誘導(dǎo)BRL-3A細(xì)胞產(chǎn)生IR后IRS-1等靶蛋白表達(dá)的變化 同“2.5”項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，使用0.2 mmol·L-1棕櫚酸作用12 h作為誘導(dǎo)BRL-3A細(xì)胞IR模型的條件，觀察胰島素相關(guān)蛋白表達(dá)變化。與正常對(duì)照組比較，IR組細(xì)胞IRS-1、PI3K、p-AKT/AKT、GLUT4表達(dá)均明顯下降(t=10.950，6.307，6.728，8.045，P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)圖6。

A.正常對(duì)照組；B.IR組。①與正常對(duì)照組比較，P<0.05。

3 討論

IR是指機(jī)體靶器官、靶組織對(duì)胰島素反應(yīng)的敏感性下降，從而導(dǎo)致生理濃度的胰島素不能將機(jī)體血糖維持在正常水平。IR是2型糖尿病的重要致病因子，也是其最主要的病理表現(xiàn)。目前，IR的致病機(jī)制并不完全清楚。建立適宜的IR細(xì)胞模型有助于在細(xì)胞及分子水平深入研究其發(fā)生機(jī)制，也為體外篩選防治IR的藥物提供便利條件。肝臟是胰島素作用的重要靶器官，能夠維持體內(nèi)糖脂代謝平衡，并與肝臟IR、IR綜合征及脂肪肝等病癥密切相關(guān)[9]。目前使用的肝細(xì)胞IR模型多為HepG2肝癌細(xì)胞，正常肝細(xì)胞模型較少被提及。

胰島素能夠通過(guò)PI3K/AKT信號(hào)通路維持機(jī)體血糖穩(wěn)態(tài)。胰島素首先與細(xì)胞膜外的胰島素受體結(jié)合，使胰島素受體發(fā)生構(gòu)象變化，其細(xì)胞膜內(nèi)的酪氨酸位點(diǎn)發(fā)生自磷酸化，進(jìn)一步吸引IRS和胰島素受體結(jié)合，導(dǎo)致自身酪氨酸位點(diǎn)磷酸化。磷酸化的胰島素受體底物會(huì)進(jìn)一步與PI3K的調(diào)節(jié)亞基結(jié)合，激活PI3K下游小分子如PIP3，PIP3與AKT結(jié)合，促進(jìn)AKT被磷酸化，增加活性。從而激活GLUT4，促進(jìn)葡萄糖吸收，增加葡萄糖消耗[10]。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，棕櫚酸可以成功誘導(dǎo)BRL-3A細(xì)胞胰島素模型，0.4 mmol·L-1棕櫚酸作用6 h、0.25 mmol·L-1棕櫚酸和0.2 mmol·L-1PA作用12 h以及0.1 mmol·L-1PA作用24 h均能成功誘導(dǎo)BRL-3A細(xì)胞產(chǎn)生IR。0.4 mmol·L-1棕櫚酸處理6，12，24 h，0.25 mmol·L-1棕櫚酸和0.2 mmol·L-1處理12，24 h后均可抑制胰島素刺激的糖轉(zhuǎn)運(yùn)和無(wú)胰島素刺激的基礎(chǔ)糖轉(zhuǎn)運(yùn)，說(shuō)明此誘導(dǎo)模型已經(jīng)產(chǎn)生IR，這種抑制作用呈劑量-時(shí)間依賴性。并且通過(guò)移除棕櫚酸刺激后長(zhǎng)期培養(yǎng)該細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)抑制作用可以持續(xù)48 h。0.4和0.25 mmol·L-1棕櫚酸均可成功誘導(dǎo)BRL-3A細(xì)胞產(chǎn)生IR，但同時(shí)對(duì)BRL-3A細(xì)胞增殖產(chǎn)生影響，分別從6 h和24 h開(kāi)始出現(xiàn)毒性作用。而低濃度的棕櫚酸(0.2 mmol·L-1)作用12 h后也能誘導(dǎo)BRL-3A細(xì)胞產(chǎn)生IR，同時(shí)能夠抑制胰島素刺激的糖轉(zhuǎn)運(yùn)和不加胰島素刺激的基礎(chǔ)糖轉(zhuǎn)運(yùn)，并且在36 h內(nèi)對(duì)BRL-3A細(xì)胞增殖無(wú)影響。

綜上所述，0.2 mmol·L-1棕櫚酸處理12 h可作為誘導(dǎo)BRL-3A細(xì)胞IR模型的方法。在成功誘導(dǎo)的BRL-3A細(xì)胞IR模型中，IRS-1、PI3K、p-AKT/AKT、GLUT4表達(dá)均明顯下降，提示棕櫚酸可能通過(guò)抑制IRS-1表達(dá)，導(dǎo)致PI3K/AKT通路被抑制，進(jìn)一步下調(diào)GLUT4表達(dá)，使糖代謝受阻，導(dǎo)致IR。本研究成功建立了BRL-3A細(xì)胞IR模型，并初步在蛋白水平闡述了棕櫚酸可能的作用機(jī)制，為進(jìn)一步探究大鼠正常肝細(xì)胞產(chǎn)生IR及相關(guān)藥物體外篩選提供參考依據(jù)。