姜 松,朱 策

（上海理工大學(xué) 機(jī)械工程學(xué)院，上海 200093）

電穿孔現(xiàn)象最早發(fā)現(xiàn)于上世紀(jì)70年代，最初應(yīng)用在輔助細(xì)菌細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞的體外基因轉(zhuǎn)移方面[1]。電脈沖消融法是基于電穿孔現(xiàn)象提出的，所謂電穿孔：是指細(xì)胞在外加電場(chǎng)的作用下，細(xì)胞膜磷脂雙分子層上形成瞬時(shí)微孔的生物物理過(guò)程。當(dāng)細(xì)胞膜發(fā)生電穿孔時(shí)，膜的通透性會(huì)瞬時(shí)增大，使親水分子、DNA、蛋白質(zhì)、病毒顆粒、藥物和染料顆粒等正常情況下不能通過(guò)細(xì)胞膜的分子得以進(jìn)入細(xì)胞[2]。在外加脈沖電場(chǎng)取消后，如果微孔能夠閉合，則稱為可逆性電穿孔；如果微孔不能自我閉合，則稱為不可逆性電穿孔[3]。近年來(lái)，脈沖電場(chǎng)以其獨(dú)特的生物電效應(yīng)成為研究熱點(diǎn)，并廣泛應(yīng)用于基因轉(zhuǎn)染、藥物導(dǎo)入、腫瘤治療、創(chuàng)傷修復(fù)等領(lǐng)域[4-5]。電穿孔療法由日本Okino等[6]首次提出，隨后，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者陸續(xù)開(kāi)展了這方面的研究工作，并逐漸運(yùn)用到臨床實(shí)踐。美國(guó)Hofmann教授等將其用于頭頸癌、皮膚癌、胰腺癌、肝癌的臨床治療中，并獲得了成功[7-8]。重慶大學(xué)姚陳果等[9]利用流式細(xì)胞儀對(duì)脈沖電場(chǎng)處理后的細(xì)胞周期進(jìn)行了檢測(cè)，證明了脈沖電場(chǎng)抑制腫瘤細(xì)胞DNA的合成。在對(duì)動(dòng)物的臨床實(shí)驗(yàn)中，電穿孔療法也取得了不錯(cuò)的效果，結(jié)果表明腫瘤區(qū)域明顯減少[10]。該課題組隨后還研究了脈沖電場(chǎng)的生物非熱效應(yīng)及作用機(jī)理，將絕緣電介質(zhì)的電擊穿和生物電介質(zhì)的電穿孔聯(lián)系起來(lái)，通過(guò)調(diào)整電脈沖參數(shù)，提出了不用化學(xué)藥物，僅用高強(qiáng)度的脈沖電場(chǎng)，使腫瘤細(xì)胞發(fā)生不可逆電穿孔（即細(xì)胞死亡），從而實(shí)現(xiàn)非熱效應(yīng)治療腫瘤[11-12]。

本文以宮頸癌Hela細(xì)胞作為研究對(duì)象，經(jīng)脈沖電場(chǎng)處理后，利用臺(tái)盼藍(lán)染色原理分析細(xì)胞膜的穿孔程度。在固定脈沖寬度和個(gè)數(shù)的情況下，研究Hela細(xì)胞發(fā)生可逆和不可逆穿孔的場(chǎng)強(qiáng)閾值范圍，重點(diǎn)研究脈沖個(gè)數(shù)、脈沖寬度和電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)Hela細(xì)胞不可逆電穿孔的影響，并選擇優(yōu)化的參數(shù)組合。

1 實(shí)驗(yàn)材料、設(shè)備和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

以宮頸癌Hela細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，將其在恒溫培養(yǎng)箱中傳代大量培養(yǎng)后供實(shí)驗(yàn)使用。為保證細(xì)胞的活性，用于實(shí)驗(yàn)的均為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。

實(shí)驗(yàn)中用到的其他材料包括：臺(tái)盼藍(lán)染色劑、酒精、培養(yǎng)皿、磷酸緩沖鹽(phosphate buffer saline，PBS)溶液、小牛血清、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、移液槍、試管等。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

實(shí)驗(yàn)所用的處理電源為自制的脈沖電源。該電源可輸出方波脈沖，脈寬在5～100μs內(nèi)精確可調(diào)，頻率在1～1000Hz內(nèi)精確可調(diào)。其實(shí)物如圖1所示。脈沖作用下負(fù)載兩端的輸出電壓波形如圖2所示。

實(shí)驗(yàn)采用的反應(yīng)器為電極杯，電極間的距離為0.2cm，容量為400μl。其橫截面如圖3所示。

圖3 反應(yīng)器橫截面Fig.3 Reactor cross section

實(shí)驗(yàn)中用到的其他設(shè)備還有示波器、液氮罐、水浴鍋、離心機(jī)、細(xì)胞計(jì)數(shù)板、熒光顯微鏡等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

樣品配置：先將Hela細(xì)胞放在綜合培養(yǎng)基（10%小牛血清、90%DMEM）中，然后將其置于恒溫培養(yǎng)箱（37℃，5%CO2）中傳代到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。將培養(yǎng)好的細(xì)胞用胰蛋白酶消化后離心，再用PBS溶液洗滌2次，重懸，制成濃度約為106cfu/ml的細(xì)胞懸液。

電場(chǎng)處理：用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75%的酒精清洗電極杯，取上述細(xì)胞懸液與臺(tái)盼藍(lán)試劑均勻混合，用移液槍吸取懸液分別裝入電極杯中，每組400 μl。設(shè)置電脈沖參數(shù)，脈沖電場(chǎng)處理過(guò)后，取10 μl細(xì)胞懸液滴入計(jì)數(shù)板并計(jì)算穿孔率（包含可逆與不可逆）。同等條件下取上述細(xì)胞懸液先經(jīng)電場(chǎng)處理后，再與臺(tái)盼藍(lán)試劑均勻混合，計(jì)算其不可逆電穿孔率。

細(xì)胞計(jì)數(shù)：臺(tái)盼藍(lán)是檢測(cè)細(xì)胞膜完整性最常用的生物染色劑，正常細(xì)胞會(huì)排斥這種染料，而對(duì)于膜的完整性喪失的細(xì)胞，通透性會(huì)增加，所以臺(tái)盼藍(lán)會(huì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)將其染色。

圖4和圖5分別為用胰蛋白酶消化后，顯微鏡下的Hela細(xì)胞和被臺(tái)盼藍(lán)試劑染色的細(xì)胞。

圖4 消化后的Hela細(xì)胞Fig.4 Digested Hela cells

圖5 被染色后的Hela細(xì)胞Fig.5 Stained Hela cells

2 電脈沖作用對(duì)細(xì)胞穿孔的影響

2.1 可逆與不可逆穿孔的場(chǎng)強(qiáng)范圍

設(shè)置電脈沖參數(shù)：脈寬為50μs；脈沖為20個(gè)；電場(chǎng)強(qiáng)度依次取250 ，500，750 ，1000，1 250，1 500，1 750V/cm。第一組實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞懸液與臺(tái)盼藍(lán)試劑均勻混合后施加脈沖電場(chǎng)作用，測(cè)量穿孔率；第二組實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞懸液先經(jīng)脈沖電場(chǎng)處理后，再與臺(tái)盼藍(lán)試劑均勻混合，測(cè)量不可逆電穿孔率。未施加電場(chǎng)強(qiáng)度的細(xì)胞懸液為對(duì)照組。細(xì)胞被染色，則說(shuō)明該細(xì)胞發(fā)生了穿孔。以樣品中被染色的量作為統(tǒng)計(jì)指標(biāo)，研究不同電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)細(xì)胞穿孔的影響，其結(jié)果如圖6所示。

圖6 脈沖強(qiáng)度對(duì)細(xì)胞穿孔的影響Fig.6 Effect of pulse intensity on cell perforation

由圖6可知，在脈沖寬度和脈沖個(gè)數(shù)不變的情況下，隨著脈沖電場(chǎng)強(qiáng)度的增加，Hela細(xì)胞被染色的數(shù)量越來(lái)越多，最終會(huì)趨于飽和。由第一組實(shí)驗(yàn)可知，當(dāng)場(chǎng)強(qiáng)在500 V/cm時(shí)，細(xì)胞幾乎未被染色；當(dāng)場(chǎng)強(qiáng)達(dá)到750 V/cm時(shí)，有少量細(xì)胞呈現(xiàn)藍(lán)色。依據(jù)臺(tái)盼藍(lán)染色原理可知，被染色的細(xì)胞的細(xì)胞膜破裂發(fā)生了穿孔，此時(shí)，并不能確定細(xì)胞膜穿孔是可逆的還是不可逆的。在第二組實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)場(chǎng)強(qiáng)為750V/cm時(shí)，并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)被染色的細(xì)胞，說(shuō)明在該場(chǎng)強(qiáng)作用下的第一組實(shí)驗(yàn)中，被染色的細(xì)胞發(fā)生了可逆性穿孔，細(xì)胞膜上形成的微孔短時(shí)間內(nèi)又自我修復(fù)了；當(dāng)場(chǎng)強(qiáng)為1000 V/cm時(shí)，少量細(xì)胞被染色。由此可以推出：在脈寬為50μs和20個(gè)脈沖作用下，Hela細(xì)胞發(fā)生可逆性電穿孔的場(chǎng)強(qiáng)閾值范圍為500～750V/cm；同理，Hela細(xì)胞發(fā)生不可逆性電穿孔的場(chǎng)強(qiáng)閾值范圍為750～1000 V/cm。

細(xì)胞膜基本上是一個(gè)絕緣體，兩面浸在含離子的電解質(zhì)溶液中，外加電場(chǎng)會(huì)引起兩邊的離子去極化，從而形成外加的膜電位差，此電位差就稱為跨膜電壓。在外加電場(chǎng)的誘導(dǎo)下，當(dāng)外加電場(chǎng)頻率很低或?yàn)橹绷麟妶?chǎng)時(shí)，跨膜電位的表達(dá)式可簡(jiǎn)化為[13]

式中：R為細(xì)胞半徑；E為外加電場(chǎng)強(qiáng)度；為細(xì)胞膜上任意一點(diǎn)的徑向與電場(chǎng)方向之間的夾角。細(xì)胞模型如圖7所示。由細(xì)胞跨膜電位的計(jì)算公式可知，相同強(qiáng)度的外加電場(chǎng)對(duì)大細(xì)胞的跨膜電位更高。即使是同種類細(xì)胞，其大小也有偏差。因此，電穿孔首先出現(xiàn)在那些大細(xì)胞上?？缒る娢坏拇笮∫搽S著外加電場(chǎng)強(qiáng)度的增大而增大，細(xì)胞膜上的微孔將首先出現(xiàn)在0°和180°的兩個(gè)極點(diǎn)處。隨著電場(chǎng)強(qiáng)度的進(jìn)一步增大，電穿孔出現(xiàn)的位置一般按cosθ的值由大到小順序進(jìn)行擴(kuò)展。在90°和270°時(shí)，cosθ為0，跨膜電位始終為0，不會(huì)發(fā)生電穿孔。

圖7 簡(jiǎn)化的細(xì)胞模型Fig.7 Simplified cell model

圖8是細(xì)胞的等效電路圖。根據(jù)細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)的電特性，細(xì)胞膜可等效為電容C1和電阻R1的并聯(lián)；細(xì)胞核膜可等效為電容C2和電阻R2的并聯(lián)；細(xì)胞質(zhì)可等效為電阻R3；細(xì)胞外液可等效為電阻R4；Um表示外加的跨膜電壓大小。當(dāng)給細(xì)胞懸液加電壓時(shí)，容性細(xì)胞膜充電，當(dāng)超過(guò)細(xì)胞膜穿孔的閾值后，細(xì)胞膜發(fā)生穿孔，此時(shí)細(xì)胞內(nèi)外離子流動(dòng)大大削弱了細(xì)胞膜的屏蔽作用。如果將細(xì)胞中更小的細(xì)胞器如線粒體考慮進(jìn)來(lái)，也可以把這些細(xì)胞器等效為細(xì)胞核。

圖8 細(xì)胞等效電路圖Fig. 8 Cell equivalent circuit diagram

2.2 脈沖個(gè)數(shù)對(duì)細(xì)胞不可逆穿孔的影響

根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)得到的Hela細(xì)胞發(fā)生不可逆電穿孔的場(chǎng)強(qiáng)閾值范圍，本次實(shí)驗(yàn)固定場(chǎng)強(qiáng)1000V/cm和脈寬50μs不變，在不同脈沖個(gè)數(shù)的作用下研究細(xì)胞不可逆穿孔率，其結(jié)果如圖9所示。

圖9 脈沖個(gè)數(shù)對(duì)不可逆穿孔率的影響Fig.9 Effect of the number of pulses on irreversible perforation rate

由圖9可知，固定場(chǎng)強(qiáng)1000V/cm和脈寬50μs不變的情況下，隨著脈沖個(gè)數(shù)的增加，被染色的細(xì)胞數(shù)量也越來(lái)越多，電脈沖對(duì)細(xì)胞的不可逆穿孔率也隨之增加。當(dāng)70個(gè)脈沖時(shí)，不可逆穿孔率達(dá)到90.07%；當(dāng)80個(gè)脈沖時(shí)，不可逆穿孔率達(dá)到92.10%；隨著脈沖個(gè)數(shù)的繼續(xù)增加，Hela細(xì)胞的不可逆穿孔率會(huì)趨于飽和。所以，對(duì)于優(yōu)化參數(shù)的選擇，本次實(shí)驗(yàn)中脈沖個(gè)數(shù)選擇70個(gè)。

由脈沖個(gè)數(shù)對(duì)細(xì)胞的不可逆電穿孔實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，脈沖電場(chǎng)對(duì)細(xì)胞膜的穿孔作用具有累積效應(yīng)。單對(duì)細(xì)胞膜而言，膜電位主要由電荷的總量所控制，細(xì)胞膜可以看作是一個(gè)等效電容，在電脈沖的作用下，脈沖寬度T1、脈沖間隔時(shí)間T2、細(xì)胞膜的充電時(shí)間T3和細(xì)胞膜的彈性恢復(fù)時(shí)間T4，這4個(gè)時(shí)間量是非常重要的參數(shù)。對(duì)于脈沖個(gè)數(shù)的增加，相當(dāng)于增加了作用時(shí)間，累積效應(yīng)主要發(fā)生在T1+T2

2.3 脈沖脈寬對(duì)細(xì)胞不可逆穿孔的影響

根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)選取的70個(gè)脈沖，再固定脈沖電場(chǎng)強(qiáng)度為1000V/cm，在不同的脈沖寬度作用下研究細(xì)胞的不可逆穿孔率，其結(jié)果如圖10所示。

圖10 脈沖寬度對(duì)不可逆穿孔率的影響Fig.10 Effect of pulse width on irreversible perforation rate

由圖10可知，固定場(chǎng)強(qiáng)1000V/cm和70個(gè)脈沖的情況下，隨著脈沖寬度的增加，細(xì)胞的不可逆穿孔率先緩慢增加，在20μs時(shí)有明顯增大趨勢(shì)，50μs之后逐漸趨于飽和。所以，對(duì)于優(yōu)化參數(shù)的選擇，本次實(shí)驗(yàn)中脈沖寬度選取60μs，該條件下不可逆穿孔率為93.24%。

脈沖電場(chǎng)與細(xì)胞的相互作用是基于細(xì)胞膜充電，細(xì)胞膜可等效為一個(gè)電容。當(dāng)外電場(chǎng)對(duì)細(xì)胞膜充電后，膜兩側(cè)存在相反的電荷，膜內(nèi)電場(chǎng)力增加，細(xì)胞膜變薄，膜厚度的衰減程度取決于細(xì)胞膜的彈性模量。就脈寬為微秒級(jí)的單個(gè)脈沖而言，通常認(rèn)為細(xì)胞膜電穿孔所需脈沖寬度的下限必須大于膜充電時(shí)間和膜的彈性恢復(fù)時(shí)間，這樣才能在單個(gè)電脈沖的作用下維持孔洞的開(kāi)放。一般來(lái)說(shuō)，在kV/cm級(jí)的脈沖作用下，細(xì)胞膜穿孔所需時(shí)間至少達(dá)到5μs[14]。脈沖寬度的增加會(huì)擴(kuò)大單個(gè)細(xì)胞穿孔的程度，如果脈沖寬度小于膜充電時(shí)間，則必須提供較大的電場(chǎng)強(qiáng)度以驅(qū)使膜電位達(dá)到穿孔的臨界值。

2.4 脈沖場(chǎng)強(qiáng)對(duì)細(xì)胞不可逆穿孔的影響

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)，固定脈寬60μs和70個(gè)脈沖不變，在不同的電場(chǎng)強(qiáng)度作用下研究細(xì)胞的不可逆穿孔率，其結(jié)果如圖11所示。

由圖11可知，在固定脈寬60μs和70個(gè)脈沖不變的情況下，隨著電場(chǎng)強(qiáng)度的增加，細(xì)胞膜的不可逆穿孔率也隨之增加。當(dāng)外加場(chǎng)強(qiáng)達(dá)1 500 V/cm，不可逆穿孔率為93.42%，隨后趨于飽和。

圖11 電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)不可逆穿孔率的影響Fig. 11 Effect of electric field intensity on Irreversible perforation rate

細(xì)胞膜破裂的根本原因均是由于外加脈沖電場(chǎng)誘導(dǎo)下細(xì)胞膜跨膜電壓所形成的跨膜電場(chǎng)所導(dǎo)致的。細(xì)胞膜的厚度約為5～10nm，在無(wú)外加電場(chǎng)時(shí)，細(xì)胞為了維持自身的正常生理功能，細(xì)胞膜內(nèi)外存在著50～70 mV的電位差[15]。在跨膜電位的作用下，細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和形態(tài)產(chǎn)生了不可逆的變化，即使電脈沖的作用時(shí)間極短，但對(duì)生物體的破壞也是相當(dāng)大的。

2.5 結(jié)果與討論

由上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，不同的脈沖參數(shù)會(huì)引發(fā)細(xì)胞膜不可逆穿孔程度的不同，其中脈沖個(gè)數(shù)、脈沖寬度和脈沖場(chǎng)強(qiáng)對(duì)細(xì)胞不可逆穿孔率的影響有相似之處。Hela細(xì)胞不可逆穿孔率都是隨著脈沖個(gè)數(shù)、脈沖寬度和脈沖場(chǎng)強(qiáng)的增加而增加的。在脈沖電場(chǎng)作用下，細(xì)胞主要經(jīng)歷無(wú)影響（電脈沖劑量低）、可逆性電穿孔（存活）和不可逆性電穿孔（死亡）3個(gè)階段。

對(duì)于脈沖個(gè)數(shù)的增加，主要是作用于擴(kuò)大電脈沖作用的累積效應(yīng)；對(duì)于脈沖寬度的增加，主要是作用在細(xì)胞膜上形成微孔后，能夠維持孔洞的開(kāi)放；對(duì)于脈沖場(chǎng)強(qiáng)的增加，就是增大細(xì)胞膜的跨膜電壓，會(huì)擴(kuò)大穿孔區(qū)域的面積。通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)，對(duì)于這3種電脈沖參數(shù)的優(yōu)化組合，宜選擇場(chǎng)強(qiáng)1 500V/cm、脈寬60μs和70個(gè)脈沖。

3 結(jié) 論

以宮頸癌Hela細(xì)胞為研究對(duì)象，通過(guò)外加脈沖電場(chǎng)處理和臺(tái)盼藍(lán)染色，進(jìn)行穿孔率的檢測(cè)。在脈寬50μs和20個(gè)脈沖的情況下，Hela細(xì)胞發(fā)生可逆穿孔的場(chǎng)強(qiáng)范圍為500～750 V/cm，發(fā)生不可逆穿孔的場(chǎng)強(qiáng)范圍為750～1000 V/cm。在電脈沖的作用下，隨著脈沖場(chǎng)強(qiáng)、脈寬和個(gè)數(shù)的增加，Hela細(xì)胞的不可逆穿孔率也隨之增加。最終，選取電脈沖參數(shù)1 500V/cm、60μs和70個(gè)脈沖為優(yōu)化的參數(shù)組合，該參數(shù)下Hela細(xì)胞不可逆穿孔率達(dá)到93.42%。

電穿孔主要的生物學(xué)效應(yīng)是使細(xì)胞膜發(fā)生可逆和不可逆擊穿，仍需大量實(shí)驗(yàn)研究將電穿孔的應(yīng)用推向臨床，不斷完善電化學(xué)療法的臨床應(yīng)用。