崔艷麗 何利珍

河南省焦作市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 454000

食管癌是一種常發(fā)的嚴(yán)重腫瘤，引起食管癌的因素較多，以不良飲食習(xí)慣、經(jīng)濟(jì)社會(huì)地位和常吃粗糧等相關(guān)性比較高[1]。臨床上治療食管癌多以手術(shù)、放化療為主，且發(fā)生率和死亡率在國(guó)內(nèi)均較高。為了提高癌癥患者的生存率和存活時(shí)間，逐漸開始嘗試一些分子靶向療法，但在食管癌中還沒有成熟的分子靶點(diǎn)，需要進(jìn)一步揭示調(diào)控食管癌增殖的分子機(jī)制，找到好的分子治療靶點(diǎn)。

髓樣細(xì)胞白血病因子1(Myeloid cell leukemia-1，MCL1)最初被發(fā)現(xiàn)是細(xì)胞分化相關(guān)的一個(gè)基因，在白細(xì)胞分化過程中被發(fā)現(xiàn)其能夠誘導(dǎo)單核/巨噬細(xì)胞分化途徑。后來(lái)發(fā)現(xiàn)MCL1是一種腫瘤發(fā)生相關(guān)的蛋白，在多種消化道腫瘤中高表達(dá)，但是其在食管癌中表達(dá)情況及是否影響食管癌細(xì)胞增殖還不確定。本項(xiàng)目基于對(duì)臨床病例材料進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)MCL1在食管癌組織中高表達(dá)，并通過構(gòu)建MCL1的真核表達(dá)載體，探討其對(duì)食管癌細(xì)胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 組織樣品收集 食管癌樣本為2018年在本院手術(shù)切除癌組織樣本(男9例，女3例，平均年齡68.3歲)。對(duì)照樣本為對(duì)應(yīng)的癌周組織。將癌組織樣品及癌周組織碾磨，以Triol法提取RNA，然后用實(shí)時(shí)相對(duì)定量法(qRT-PCR)檢測(cè)食管癌組織中MCL1基因轉(zhuǎn)錄情況，所用定量引物序列為：Q-MCL1-F:5’-GAC GAG TTG TAC CGG CA GTC-3’,Q-MCL1-R:5’-TTT GTT ACG CCG TCG CTGA-3’。產(chǎn)物大小為266bp。內(nèi)參引物序列為：Q-β-actin-F:5’-GAG AAA ATC TGG CAC CAC ACC-3’，Q-β-actin-R:5’-GGA TAG CAC AGC CTG GAT AG CAA-3’。產(chǎn)物大小為177bp。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 食管癌細(xì)胞EC9706在37℃恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)液為添加10%胎牛血清和1%青鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基。其中，RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司，胎牛血清購(gòu)自依科賽生物科技有限公司，青鏈霉素購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 載體構(gòu)建 實(shí)驗(yàn)中用到的pCDNA3.1/myc-His載體購(gòu)自Addgene公司，基因擴(kuò)增自EC9706細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)中所用的克隆引物為：MCL1-F: CGG GAT TCA TGT TTG GCC TCA AAA GAA ACG CGG，MCL1-R: GGA ATT CTC TTA TTA GAT ATG CCA AA CCA。產(chǎn)物大小為：1 068bp(含酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基)。引物由生工上海生物工程(上海)股份有限公司合成。構(gòu)建的載體命名為：pCDNA3.1-MCL1-myc-His。

1.4 轉(zhuǎn)染試驗(yàn) EC9706細(xì)胞提前接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，次日細(xì)胞生長(zhǎng)至80%鋪滿皿底時(shí)，實(shí)驗(yàn)組每孔轉(zhuǎn)染pCDNA3.1-MCL1-myc-His質(zhì)粒3μg，對(duì)照組轉(zhuǎn)染pCDNA3.1/myc-His空質(zhì)粒3μg。轉(zhuǎn)染步驟按照Thermo Turbofect轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行，在轉(zhuǎn)染24h和48h后進(jìn)行收樣檢測(cè)。

1.5 Western blot檢測(cè) 上述1.4中細(xì)胞樣品，棄去培養(yǎng)基，用添加蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液100μl在冰上裂解細(xì)胞15min，然后添加6×loading buffer, 蛋白樣品95℃煮樣10min后備用。聚丙烯酰胺凝膠電泳(100V，1.5h)分散蛋白后，將膠上蛋白轉(zhuǎn)膜(250mA，100min)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，脫脂奶粉封閉2h后，以抗磷酸化MEK1(p-MEK1)抗體(1∶1 000，購(gòu)自Abclone公司)、以抗MEK1抗體(1∶1 000，購(gòu)自Abclone公司)、β-actin抗體(1∶5 000，購(gòu)自Abclone)為一抗分別孵育PVDF膜4℃過夜；PBST溶液清洗PVDF膜3次后；以HRP標(biāo)記的羊抗鼠/兔二抗(1∶5 000，購(gòu)自Abclone公司)室溫孵育1h；然后用PBST溶液清洗PVDF膜3次；ECL化學(xué)發(fā)光液(購(gòu)自Millipore公司)顯色，化學(xué)發(fā)光儀拍照。

1.6 細(xì)胞計(jì)數(shù) 將細(xì)胞接種至12孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%左右時(shí)轉(zhuǎn)染MCL1真核表達(dá)載體和對(duì)照的空載體，分別在轉(zhuǎn)染后0、24和48h，用胰酶消化細(xì)胞，以血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，每組3個(gè)樣品，每個(gè)樣品重復(fù)計(jì)數(shù)3次。

1.7 細(xì)胞劃痕試驗(yàn) 細(xì)胞生長(zhǎng)至80%左右時(shí)轉(zhuǎn)染超表達(dá)MCL1的質(zhì)粒，并同期轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒作為對(duì)照。在次日細(xì)胞長(zhǎng)滿皿底時(shí)，以無(wú)菌移液器吸頭在細(xì)胞皿內(nèi)劃線，分別在劃線后0、24和48h后拍照，檢測(cè)細(xì)胞遷移能力變化情況。

1.8 細(xì)胞周期檢測(cè) 上述1.4中細(xì)胞樣品，以PBS清洗細(xì)胞后，胰酶消化后再次以PBS清洗細(xì)胞1遍，離心棄去PBS，以預(yù)冷的70%乙醇在4℃固定細(xì)胞48h，然后離心棄去乙醇，以PBS懸浮細(xì)胞，加入細(xì)胞周期用PI溶液，在37℃孵育30min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.9 qRT-PCR檢測(cè) 上述1.4中細(xì)胞樣品，棄去培養(yǎng)基并以PBS清洗1遍后，每孔加入1ml Trizol試劑(購(gòu)自Takara公司)，提取細(xì)胞總RNA，然后以反轉(zhuǎn)錄試劑盒(購(gòu)自天根生化科技有限公司)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，再以熒光定量試劑盒(天根生化科技北京有限公司)檢測(cè)相關(guān)下游基因表達(dá)情況。Q-C-MYC-F:5’-CCG ACC AGC TGG AGA TGG TGA-3’，Q-C-MYC-R:5’-AGC CTG GTA GGA GGC CAG CTT-3’；Q-C-FOS-F:5’-CTA TGC AGC AGA CTG GG AGC-3’，Q-C-FOS-R:5’-AGA CGT GTA AGC AGT GC AGC-3’；Q-CCND1-F:5’-AGC TGT GCA TCT ACA CC GAC-3’，Q-CCND1-R:5’-GAA ATC GTG CGG GGT CA TTG-3’。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 Graphpad Prism5 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 MCL1在食管癌組織中高表達(dá) 2018年1—12月在本院收集的12例手術(shù)切除的食管癌組織(Cancer tissue) 樣品及其癌周組織(Control)樣品，通過qRT-PCR檢測(cè)，將對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)等比例換算后，發(fā)現(xiàn)在其中10份臨床樣品中，MCL1在食管癌組織中表達(dá)量高于對(duì)應(yīng)的癌周組織，僅2例差異不顯著，如圖1所示。

圖1 相對(duì)定量PCR檢測(cè)12例癌組織(Cancer tissue)和癌周組織(Control)中MCL1表達(dá)量 兩組比較，*P≤0.05；**P≤0.01；***P≤0.001

2.2 構(gòu)建表達(dá)MCL1的真核表達(dá)載體 通過PCR的方法，用保真酶將MCL1基因擴(kuò)增出來(lái)(圖2A)；雙酶切后裝至pCDNA3.1/myc-His載體上，酶切驗(yàn)證構(gòu)建的目的載體pCDNA3.1-MCL1-myc-His，結(jié)果顯示獲得和預(yù)期大小的條帶(圖2B)，測(cè)序后序列無(wú)突變。這些結(jié)果提示載體pCDNA3.1-MCL1-myc-His構(gòu)建成功。

圖2 核酸電泳結(jié)果

2.3 細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)超表達(dá)MCL1促進(jìn)EC9706細(xì)胞增殖 將構(gòu)建好的MCL1真核表達(dá)載體pCDNA3.1-MCL1-myc-His轉(zhuǎn)染至EC9706細(xì)胞內(nèi)，同時(shí)以轉(zhuǎn)染pCDNA3.1/myc-His空質(zhì)粒為對(duì)照組，在轉(zhuǎn)染后24和48h分別檢測(cè)兩組的細(xì)胞數(shù)量，結(jié)果顯示超表達(dá)MCL1組的細(xì)胞數(shù)量高于對(duì)照組，其中在轉(zhuǎn)染48h，差異顯著，如圖3所示。

圖3 細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞數(shù)量差異 兩組比較，*P≤0.01

2.4 細(xì)胞周期檢測(cè)超表達(dá)MCL1促進(jìn)EC9706細(xì)胞增殖 以流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染24h后對(duì)照組(Control)和超表達(dá)MCL1組(MCL1)的G1期比例分別為(72.44±0.56)%、(70.05±1.05)%(P≤0.05)；在轉(zhuǎn)染質(zhì)粒48h后G1期細(xì)胞比例分別為(73.95±0.05)%、(71.55±0.55)%(P≤0.01)；對(duì)應(yīng)的S+G2期細(xì)胞比例在超表達(dá)MCL1后高于超表達(dá)空質(zhì)粒的對(duì)照組。以上結(jié)果提示超表達(dá)MCL1能夠增加S+G2期細(xì)胞比例，提高了細(xì)胞增殖能力，如圖4所示。

圖4 流式檢測(cè)超表達(dá)MCL1后細(xì)胞周期變化

2.5 超表達(dá)MCL1促進(jìn)EC9706細(xì)胞遷移 細(xì)胞轉(zhuǎn)染MCL1后，次日細(xì)胞將近鋪滿皿底，以移液器吸頭劃線，并將培養(yǎng)基換成無(wú)血清培養(yǎng)基，在劃線后0、24和48h拍照。結(jié)果顯示，超表達(dá)MCL1的細(xì)胞顯示更好的遷徙能力，尤其在48h時(shí)差異較顯著，如圖5所示。

2.6 抑制MAPK信號(hào)通路能夠抑制EC9706細(xì)胞增殖 用抑制劑U0126(100nM)處理細(xì)胞，Western blot檢測(cè)MEK含量降低，磷酸化MEK含量增加(圖6)；細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)用U0126抑制劑處理細(xì)胞24和48h后，細(xì)胞數(shù)量較僅加溶劑的對(duì)照組(Control)明顯減少，如圖7所示。以上結(jié)果顯示抑制MAPK-MEK信號(hào)通路能夠抑制EC9706細(xì)胞增殖。

2.7 超表達(dá)MCL1激活MEK信號(hào)通路 在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染pCDNA3.1-MCL1-myc-His來(lái)超表達(dá)MCL1蛋白，以轉(zhuǎn)染空載體pCDNA3.1/myc-His的細(xì)胞為對(duì)照組(Control)，Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MCL1能夠減少M(fèi)EK含量，增加p-MEK含量(圖8)；qRT-PCR檢測(cè)MEK下游靶基因C-MYC、C-FOS和CCND1，結(jié)果顯示，EC9706細(xì)胞中超表達(dá)MCL1后能夠激活MEK下游靶基因的轉(zhuǎn)錄, 差異顯著有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，如圖9所示。

圖5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)超表達(dá)MCL1后對(duì)細(xì)胞遷移的影響

圖6 Western blot 檢測(cè)U0126處理細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)MEK1含量變化

圖7 細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)U0126處理細(xì)胞后細(xì)胞增殖情況 兩組比較，*P≤0.05

圖8 Western blot 檢測(cè)超表達(dá)MCL1后細(xì)胞內(nèi)MEK含量變化

3 討論

MCL1能夠和Bcl2互作，在抗細(xì)胞凋亡方面發(fā)揮作用，癌細(xì)胞通常由正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化產(chǎn)生，因此，抗凋亡和調(diào)控細(xì)胞分化的BCL1基因可能和癌細(xì)胞的生成存在相關(guān)性。除了在骨髓瘤中檢測(cè)其和癌癥的預(yù)后相關(guān)外，在前列腺癌[2]、胃癌[3]等均和癌癥的發(fā)生存在相關(guān)性。但是，MCL1是否可以作為食管癌的標(biāo)記基因，在食管癌中的表達(dá)規(guī)律還不清楚。本研究通過對(duì)近期臨床上收集的12份食管癌組織樣品進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)大部分癌組織中均高表達(dá)MCL1基因。因此，筆者推測(cè)在食管癌發(fā)生中，MCL1也可能發(fā)揮重要作用。

圖9 相對(duì)定量PCR檢測(cè)超表達(dá)MCL1后EC9706細(xì)胞內(nèi) C-MYC、C-FOS和CCND1基因表達(dá)量變化 兩組比較，*P≤0.05；**P≤0.01

癌細(xì)胞和正常細(xì)胞的一個(gè)差異是癌細(xì)胞能夠持續(xù)增殖，前期研究表明，MCL1是維持T細(xì)胞存活重要的基因[4]。在前列腺癌細(xì)胞中，MCL1是一個(gè)治療靶點(diǎn)，抑制MCL1的表達(dá)能夠誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞增殖[5]。這些結(jié)果表明MCL1在調(diào)控癌細(xì)胞增殖時(shí)發(fā)揮重要作用，為檢測(cè)在食管癌中過表達(dá)MCL1是否影響細(xì)胞增殖和遷移，實(shí)驗(yàn)中通過構(gòu)建表達(dá)MCL1的真核表達(dá)載體，驗(yàn)證了超表達(dá)的MCL1能夠促進(jìn)EC9706細(xì)胞增殖并促進(jìn)其遷移。這些結(jié)果提示，MCL1對(duì)食管癌細(xì)胞EC9706的增殖也很重要。

能夠調(diào)控EC9706細(xì)胞增殖的因素較多，一些中藥有效成分如六君子湯，乙酸乙酯部位可以調(diào)控IL-6/STAT3信號(hào)通路進(jìn)而調(diào)控EC9706增殖[6]；壁虎活性肽[7]和兗州卷柏總黃酮[8]能夠通過調(diào)節(jié)其線粒體凋亡通路相關(guān)蛋白促進(jìn)EC9706細(xì)胞凋亡抑制其增殖。這些結(jié)果表明，有多種藥物可以調(diào)控EC9706細(xì)胞增殖。而MCL1調(diào)控細(xì)胞增殖的機(jī)制研究也比較多，有研究顯示，在黑色素瘤細(xì)胞中，同時(shí)靶向MCL1和ERK1/2信號(hào)通路能夠改善患者的預(yù)后[9]；在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，沉默MCL1基因后能夠?qū)е翽I3K/AKT信號(hào)通路的抑制，進(jìn)而促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡[10]。但是，對(duì)于MCL1調(diào)控EC9706細(xì)胞增殖的機(jī)制還不清楚。有研究顯示靶向MCL1和MEK的抑制劑共同使用，利于非小細(xì)胞肺癌[11]、急性髓系白血病細(xì)胞[12]和胰腺癌細(xì)胞[13]凋亡，這些結(jié)果提示，MCL1可能和MEK共同發(fā)揮作用對(duì)癌細(xì)胞抑制明顯，推測(cè)二者起協(xié)同互補(bǔ)作用，但是MCL1和MEK是否存在相互調(diào)節(jié)還沒有研究。本實(shí)驗(yàn)中在EC9706細(xì)胞中超表達(dá)MCL1，檢測(cè)到下游MEK蛋白磷酸化增加，這些結(jié)果提示MCL1不僅和MEK是兩個(gè)協(xié)同互補(bǔ)的靶點(diǎn)，相互之間還存在調(diào)控關(guān)系。

MEK信號(hào)通路激活，除了本身磷酸化水平的增加，其下游靶分子也能被激活。MEK下游靶分子有C-FOS、cyclinD1和C-MYC等。C-FOS、C-MYC和 cyclinD1等是處于MEK下游調(diào)控細(xì)胞增殖的基因[14]，實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)這些MEK下游基因表達(dá)量提高，進(jìn)一步證明MCL1能夠激活MEK信號(hào)通路。

總之，實(shí)驗(yàn)證明MCL1促進(jìn)細(xì)胞增殖能夠通過靶向MAPK-MEK信號(hào)通路發(fā)揮作用，為MCL1調(diào)控癌細(xì)胞增殖機(jī)制提供新的理論依據(jù)。