劉亞東 李 剛 盧小偉（湖北省十堰市國藥東風總醫(yī)院，十堰442000）

骨關節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種與年齡密切相關的退行性疾病，也是導致老年人殘疾的重要原因［1-2］。隨著我國老齡化的加劇，其發(fā)病率明顯升高，已成為備受關注的社會問題［3-4］。目前，OA的發(fā)病機制尚不完全清楚，但與晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）誘導的軟骨細胞損傷密切相關。AGEs是非酶糖基化反應的最終產(chǎn)物，可通過誘導軟骨細胞凋亡、軟骨基質(zhì)降解、促進軟骨細胞炎癥和氧化應激反應等促進OA的發(fā)生［5］。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類非編碼RNA，可通過調(diào)控軟骨細胞凋亡、炎癥反應和氧化應激等參與OA的發(fā)生發(fā)展［6-8］。miR-31是miRNAs家族成員，被證實其過度表達可減輕炎癥反應和氧化應激誘導的神經(jīng)損傷［9］。有研究指出，miR-31在OA患者軟骨組織中表達下調(diào)，其過表達可通過靶向調(diào)控C-X-C基序趨化因子配體12表達促進軟骨細胞增殖［10］。然而，其對AGEs誘導的軟骨細胞損傷的影響并不清楚。本研究通過觀察上調(diào)miR-31表達對AGEs誘導的軟骨細胞凋亡、炎癥和氧化應激的影響，以揭示miR-31在OA發(fā)生發(fā)展中的作用，為OA的治療提供新線索。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠軟骨細胞（美國ATCC），DMEM培養(yǎng)基（美國Hyclone）；AGEs（美國Biovision）；二甲基亞砜、MTT和胰蛋白酶（美國Sigma）；胎牛血清（杭州四季青）；miR-31模擬物及其陰性對照（上海吉瑪公司）；Bcl-2、Bax和GAPDH抗體（美國Abcam）；HRP標記的IgG二抗（北京中杉金橋公司）；TRIzol試劑和轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine?2000（美國Invitro?gen）；青鏈霉素雙抗和Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒（北京索萊寶公司）；IL-1βELISA試劑盒和TNF-αELISA試劑盒（武漢伊艾博生物公司）；BCA蛋白濃度測定試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和Caspase-3活性檢測試劑盒（上海碧云天公司）；SOD、MDA試劑盒（南京建成公司）；LX-800酶標儀（美國Bio-Tek），CO2細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo）；FACSCantoⅡ流式細胞儀（美國BD）。

1.2 方法

1.2.1 軟骨細胞培養(yǎng)、分組與處理 采用含1%青鏈霉素雙抗和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)大鼠軟骨細胞。將對數(shù)生長期的軟骨細胞按照2×105個/孔接種至6孔細胞板上后，置于細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。實驗分為對照組：正常培養(yǎng)；AGEs組：給予100μg/ml AGEs作用3 d［11］；AGEs+miR-NC組：轉(zhuǎn)染陰性對照后給予100μg/ml AGEs作用3 d；AGEs+miR-31組：轉(zhuǎn)染miR-31模擬物后給予100μg/ml AGEs作用3 d。其中，每組設置3個復孔。待細胞達70%融合度時，參照Lipofectamine?2000說明書將miR-31模擬物和陰性對照轉(zhuǎn)染至AGEs+miR-31組和AGEs+miR-NC組細胞中。轉(zhuǎn)染5 h后，更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。經(jīng)AGEs處理后，收集各組細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.2 RT-PCR法檢測細胞中miR-31表達水平 采用TRIzol法提取軟骨細胞總RNA后，參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA合成單鏈cDNA。以cDNA為模板，根據(jù)上海生工生物工程合成的引物上PCR儀進行擴增，U6為管家基因，采用2-ΔΔCt法計算細胞中miR-31的表達水平。其中，PCR反應條件如下：95℃預變性5 min后，進入40個循環(huán)階段：95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s。PCR擴增引物序列如下：U6上游：5′-TGCGGGTGCTCGCTTCG?GCAGC-3′，下游：5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′；miR-31上游：5′-CTCGGATCCTGTGCATAACT?GCCTTCA-3′，下游：5′-CACAAGCTTGAAGTCAGGGCGAGACAGAC-3′。

1.2.3 MTT法檢測細胞活力 將對數(shù)生長期的各組軟骨細胞按照每孔1×106個接種至96孔細胞板上后，置于細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。待細胞貼壁后，按照1.2.1中的方法分組并處理細胞，另外將無細胞的培養(yǎng)基作為空白調(diào)零組。處理結(jié)束后，向各組細胞中加入20μl MTT試劑（濃度5 g/L）孵育4 h。棄上清液后，每孔加入150μl二甲基亞砜；搖床震蕩反應15 min后，采用酶標儀檢測各組細胞在570 nm處的OD值，并以（實驗組OD組-調(diào)零組OD值）/（對照組OD組-調(diào)零組OD值）×100%表示各組細胞存活率，實驗重復3次。

1.2.4 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 胰蛋白酶消化收集對照組、AGEs組、AGEs+miR-NC組和AGEs+miR-31組細胞后，以預冷的磷酸緩沖液洗滌細胞2次。加入結(jié)合緩沖液重懸細胞后，向100μl細胞懸液（含105個細胞）中加入5μl Annexin-V-FITC和5μl PI避光反應15 min。補加上樣緩沖液200μl后，在1 h內(nèi)上流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。實驗重復3次。

1.2.5 比色法檢測細胞Caspase-3活性 收集AG?Es處理結(jié)束后AGEs組、AGEs+miR-NC組、AGEs+miR-31組和正常培養(yǎng)的對照組細胞，以磷酸緩沖液洗滌1次。加入細胞裂解液抽提細胞總蛋白后，參照Caspase-3活性檢測試劑盒說明書步驟檢測各組細胞Caspase-3活性。實驗重復3次。

1.2.6 Western blot法檢測細胞中Bcl-2和Bax蛋白表達水平 向待測的軟骨細胞中加入細胞裂解液抽提細胞總蛋白后，采用BCA法檢測總蛋白的濃度與純度。將蛋白樣品與等體積上樣緩沖液混勻后，置于沸水浴中煮沸5 min。將變性后的蛋白樣品按照每孔50μg上樣至SDS-PAGE凝膠中進行電泳分離。電泳結(jié)束后，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上。經(jīng)5%脫脂奶粉封閉2 h后，加入按照1：1 000比例稀釋的Bcl-2抗體、Bax抗體和GAPDH抗體在4℃下孵育過夜。次日，加入按照1：2 000比例稀釋的二抗室溫孵育2 h。經(jīng)化學發(fā)光劑顯影曝光后，以GAPDH為內(nèi)參，采用凝膠成像分析系統(tǒng)掃描分析各組細胞中Bcl-2和Bax蛋白的表達水平。實驗重復3次。

1.2.7 細胞上清液中IL-1β、TNF-α和SOD、MDA含量檢測 收集AGEs處理結(jié)束后AGEs組、AGEs+miR-NC組、AGEs+miR-31組和正常培養(yǎng)的對照組細胞上清液，參照IL-1βELISA試劑盒、TNF-αELISA試劑盒、SOD試劑盒和MDA試劑盒說明書步驟分別檢測各組細胞上清液中IL-1β、TNF-α和SOD、MDA含量。實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學分析 以±s形式表示實驗所得數(shù)據(jù)，采用SPSS22.0軟件進行統(tǒng)計學分析，多組間比較使用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染后各組細胞中miR-31表達水平 與對照組比較，給予AGEs處理后軟骨細胞中miR-31表達水平明顯降低（P＜0.05）；與AGEs組比較，轉(zhuǎn)染陰性對照后軟骨細胞中miR-31表達水平無明顯改變（P＞0.05）；但轉(zhuǎn)染miR-31模擬物后軟骨細胞中miR-31表達水平明顯高于AGEs+miR-NC組或AGEs組（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組細胞中miR-31表達水平的比較Fig.1 Comparison of miR-31 expression levels in cells of each group

2.2 上調(diào)miR-31表達對AGEs誘導的軟骨細胞活力的影響 與對照組比較，AGEs組軟骨細胞存活率明顯降低（P＜0.05）；與AGEs組比較，AGEs+miRNC組軟骨細胞存活率無顯著變化（P＞0.05）；與AG?Es組或AGEs+miR-NC組比較，AGEs+miR-31組軟骨細胞存活率明顯升高（P＜0.05）。見圖2。

2.3 上調(diào)miR-31表達對AGEs誘導的軟骨細胞凋亡的影響 與對照組比較，AGEs組細胞凋亡率和Caspase-3活性顯著升高（P＜0.05）；與AGEs組比較，AGEs+miR-NC組細胞凋亡率和Caspase-3活性無明顯變化（P＞0.05）；然而，AGEs+miR-31組細胞凋亡率和Caspase-3活性明顯低于AGEs組或AGEs+miRNC組（P＜0.05）。見圖3。

2.4 上調(diào)miR-31表達對AGEs誘導的軟骨細胞中Bcl-2和Bax蛋白表達的影響 與對照組比較，AGEs組細胞中Bcl-2蛋白表達水平明顯降低，而Bax蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05）；與AGEs組比較，AG?Es+miR-NC組細胞中Bcl-2和Bax蛋白表達水平均無明顯差異（P＞0.05）；與AGEs+miR-NC組或AGEs組比較，AGEs+miR-31組細胞中Bcl-2蛋白表達水平明顯升高，而Bax蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05）。見圖4。

圖2 各組細胞存活率的比較Fig.2 Comparison of cell survival rate in each group

圖3 各組細胞流式細胞儀檢測各組細胞凋亡（A）、凋亡率（B）、Caspase-3、Caspase-9活性的比較（C）Fig.3 Comparison of apoptosis（A），apoptosis rate（B），Caspase-3 and Caspase-9 activities in each group by flow cytometry（C）

2.5 上調(diào)miR-31表達對AGEs誘導的軟骨細胞炎癥因子的影響 與對照組比較，AGEs組細胞上清液中IL-1β和TNF-α含量均明顯升高（P＜0.05）；與AGEs組比較，AGEs+miR-NC組細胞上清液中IL-1β和TNF-α含量均無明顯變化（P＞0.05）；但，AGEs+miR-31組細胞上清液中IL-1β和TNF-α含量均明顯低于AGEs組或AGEs+miR-NC組。見圖5。

2.6 上調(diào)miR-31表達對AGEs誘導的軟骨細胞氧化應激指標的影響 與對照組比較，AGEs組細胞上清液中SOD含量明顯降低，而MDA含量明顯升高（P＜0.05）；與AGEs組比較，AGEs+miR-NC組細胞上清液中SOD和MDA含量均無明顯變化（P＞0.05）；與AGEs+miR-NC組或AGEs組比較，AGEs+miR-31組細胞上清液中SOD含量明顯升高，而MDA含量明顯降低（P＜0.05）。見圖6。

圖4 Western blot檢測各組細胞中Bcl-2和Bax蛋白（A）及統(tǒng)計量結(jié)果（B）表達Fig.4 Western blot detection of Bcl-2 and Bax protein（A）and statistical results（B）expressions in each group of cells

圖5 各組細胞上清液中IL-1β和TNF-α含量的比較Fig.5 Comparison of IL-1βand TNF-αcontents in super?natant of each group

圖6 各組細胞上清液中SOD和MDA含量的比較Fig.6 Comparison of SOD and MDA contents in superna?tant of cells in each group

3 討論

miRNAs是一類廣泛存在于生物體內(nèi)的內(nèi)源性短鏈RNA，可通過與靶mRNA結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控相關靶基因的表達，參與細胞增殖、凋亡和免疫應答等過程，與腫瘤、心血管疾病和OA等多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關［12-15］。作為miRNAs的重要成員之一，miR-31具有促進瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖和抑制細胞凋亡的作用，miR-31還可通過抑制炎癥細胞因子受體IL-17R和信號蛋白GP130降低小鼠結(jié)腸上皮的炎癥反應［16-17］。另外，miR-31過表達可通過抑制JAK/STAT3信號通路和下調(diào)PKD1蛋白的表達降低炎癥因子IL-1β、TNF-α和氧化應激指標MDA含量以及促凋亡蛋白Caspase-3、Bax蛋白的表達，并氧化應激指標SOD含量增加，減輕炎癥反應及氧化應激誘導的缺血性腦卒中神經(jīng)損傷［9］。盡管，已有研究［10］指出，在OA骨關節(jié)患者中miR-31表達下調(diào)，且miR-31發(fā)揮著促進軟骨細胞增殖、遷移和增加膠原蛋白表達的作用；但其是否參與炎癥或氧化應激介導的軟骨細胞損傷并不清楚。

軟骨細胞在維持細胞外基質(zhì)代謝和軟骨組織穩(wěn)態(tài)等過程中起著重要作用，而軟骨細胞數(shù)量減少和外基質(zhì)代謝紊亂等是OA重要的病理特征［18］。隨著年齡的增加，軟骨細胞逐漸衰老，導致其代謝能力降低，進而合成軟骨細胞基質(zhì)維持軟骨組織功能的能力減弱，促進OA的發(fā)生［19-20］。AGEs被認為是導致OA患者患病的分子學基礎，正常情況下，AGEs在體內(nèi)的水平處于一個平衡狀態(tài)，衰老、糖尿病或者攝入高溫食物時可使AGEs水平升高，AGEs可通過與特異性受體結(jié)合促進氧化應激、炎癥反應，引起軟骨細胞凋亡，加重軟骨細胞損傷，導致機體病理改變［21］。本研究以AGEs刺激后軟骨細胞存活率、SOD含量、Bcl-2蛋白表達水平明顯降低，而IL-6、TNF-α、MDA含量和細胞凋亡率、Caspase-3活性、Bax蛋白表達水平升高。結(jié)果表明AGEs刺激可加重軟骨細胞炎癥和氧化應激反應并促進軟骨細胞凋亡。這提示，AGEs刺激可引起軟骨細胞損傷。此外，AGEs刺激后軟骨細胞中miR-31表達水平明顯降低。這提示miR-31可能在AGEs誘導的軟骨細胞損傷中發(fā)揮著重要作用。轉(zhuǎn)染miR-31模擬物成功上調(diào)miR-31表達后發(fā)現(xiàn)，AGEs誘導的細胞凋亡、炎癥反應和氧化應激均明顯受到抑制。結(jié)果表明，上調(diào)miR-31表達可通過抑制細胞凋亡、炎癥反應和氧化應激改善AGEs誘導的軟骨細胞損傷。這提示，在OA發(fā)生發(fā)展過程中，miR-31可能通過抑制軟骨細胞凋亡、炎癥反應和氧化應激發(fā)揮著重要的保護作用。

綜上所述，本研究初步揭示了miR-31在OA發(fā)生發(fā)展中的作用，上調(diào)miR-31表達可通過抑制AG?Es誘導的細胞凋亡、炎癥反應和氧化應激起到保護軟骨細胞損傷的作用，但其具體的作用機制還有待后續(xù)進一步深入探討。