張菁菁,王玉國(guó),馬定遠(yuǎn),劉 剛,羅春玉,胡 平,許爭(zhēng)峰

[南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院(南京市婦幼保健院)遺傳醫(yī)學(xué)中心,南京 210004]

脊髓性肌萎縮癥(spinal muscular atrophy,SMA)是一種常見(jiàn)的致死性神經(jīng)肌肉遺傳病,該病臨床表現(xiàn)差異較大,主要表現(xiàn)為進(jìn)行性、對(duì)稱性肌無(wú)力和肌萎縮的神經(jīng)變性疾病[1]。根據(jù)患者起病的年齡及嚴(yán)重程度分為4型(I～I(xiàn)V型)。I型為嬰兒型,病情最嚴(yán)重,約占總病例的45%,患兒出生后6月內(nèi)發(fā)病,大多數(shù)患兒2歲內(nèi)死于呼吸衰竭。II型為中間型,約占40%,出生后6～18個(gè)月發(fā)病,喪失獨(dú)坐或獨(dú)走的能力,多數(shù)只能活到成年。III型和IV型屬于青少年型和成人型,患者隨年齡的增長(zhǎng)逐漸喪失行走能力[2]。

SMA是一種常染色體隱性遺傳病,其發(fā)病概率為1/5000～1/10000,各個(gè)國(guó)家和地區(qū)群體攜帶率不同,約為1/35～1/85[3]。SMA的致病基因是位于5號(hào)染色體長(zhǎng)臂的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元生存基因(survival motor neuron,SMN),SMN基因有兩個(gè)高度同源的SMN1和SMN2基因,兩者編碼區(qū)僅在外顯子7上相差一個(gè)堿基,同源性＞99%,它們均編碼 SMN蛋白[4]。SMN1基因編碼有功能的全長(zhǎng)SMN蛋白,而SMN2基因僅能表達(dá)少量(大約10% ～20%)全長(zhǎng)有正常功能的SMN蛋白。所以,SMN1基因?yàn)镾MA的致病基因,而SMN2基因作為修飾基因與SMA表型的嚴(yán)重程度相關(guān)[5]。目前的研究顯示,約95%的SMA患者是由于SMN1基因第7外顯子缺失或第7、8外顯子同時(shí)缺失致病,其余5%是由于SMN1基因的缺失突變和點(diǎn)突變同時(shí)存在致病[6-7]。

SMA癥狀嚴(yán)重,致死率高且致病基因較明確,針對(duì)SMA攜帶者的篩查很早就受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。2008年ACMG(美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)會(huì))[8]建議,無(wú)論種族,SMA攜帶者篩查應(yīng)被提供給所有夫婦。2017年ACOG(美國(guó)婦產(chǎn)科學(xué)會(huì))[9]也建議,所有正在考慮懷孕或已懷孕的女性均應(yīng)進(jìn)行SMA攜帶者篩查。本研究應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)江蘇省5776例孕婦進(jìn)行SMA攜帶者篩查,首次明確本地區(qū)的攜帶者頻率,并對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)胎兒進(jìn)行產(chǎn)前診斷,以減少SMA患兒的出生。

1 資料與方法

1.1 資料來(lái)源 選取2019年8月至2020年7月在南京市婦幼保健院遺傳醫(yī)學(xué)中心就診的16549例表型正常的孕期女性,對(duì)其進(jìn)行SMA攜帶者篩查的宣教,其中5776例孕婦自愿接受SMA攜帶者篩查,接受率約為34.9%。孕婦年齡17～47歲,平均(29.9±4.6)歲,孕周11～22周,平均(16.5±1.9)周,且否認(rèn)SMA家族史和生育史。本研究符合醫(yī)學(xué)倫理審查委員會(huì)所制定的標(biāo)準(zhǔn)并獲得批準(zhǔn)(寧婦倫字KY-004號(hào)),所有接受篩查的孕婦均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 使用EDTA抗凝管采集自愿參加篩查的孕婦外周靜脈血2mL,對(duì)于需進(jìn)行產(chǎn)前診斷的孕婦于孕18～24周采集羊水10mL,采用 DNA提取試劑盒(QIAamp,QIAGEN公司,德國(guó))提取外周血或羊水基因組DNA,Nanodrop分光光度計(jì)(ThermoFisher,美國(guó))測(cè)定DNA濃度,并且把 DNA濃度稀釋在 10～20ng/μL,OD260nm/OD280nm比值在1.8～2.0之間。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 運(yùn)用SMN1外顯子缺失檢測(cè)試劑盒(上海五色石醫(yī)學(xué)研究股份有限公司,中國(guó))對(duì)SMN1基因拷貝數(shù)進(jìn)行檢測(cè)。該試劑盒采用MGB探針實(shí)時(shí)多重?zé)晒舛縋CR的方法,使用人RPP40基因作為內(nèi)標(biāo)基因,分別對(duì)SMN1基因第7外顯子和第8外顯子進(jìn)行擴(kuò)增并對(duì)拷貝數(shù)進(jìn)行相對(duì)定量檢測(cè)。反應(yīng)設(shè)空白對(duì)照品,缺失對(duì)照品和3個(gè)梯度的正常對(duì)照品DNA,每個(gè)樣本分兩個(gè)反應(yīng)管(E7和E8反應(yīng))。每個(gè)反應(yīng)20μL包含反應(yīng)液2.0μL,主反應(yīng)混合液10μL,反應(yīng)輔助液1.2μL,去離子水2.8μL,模板DNA 4.0μL。反應(yīng)體系配置完成后,振蕩均勻,2000r/min離心10s,再放入ABI StepOne熒光定量PCR儀(TermoFisher,美國(guó))。PCR擴(kuò)增反應(yīng):95℃熱啟動(dòng)10min后,95℃變性15s,58℃退火與延伸40個(gè)循環(huán),實(shí)時(shí)收集目的基因FAM和內(nèi)標(biāo)基因VIC熒光信號(hào)。首先分別計(jì)算各個(gè)梯度對(duì)照品目的基因與內(nèi)標(biāo)基因間的ΔCt值,ΔCt=Ct_FAM-Ct_VIC,再計(jì)算出正常對(duì)照品3個(gè)梯度的ΔCt值的平均值,記為ΔCt_a,其次分別計(jì)算待測(cè)樣本目的基因與內(nèi)標(biāo)基因的ΔCt值,記為ΔCt_s,最后得出 ΔΔCt=ΔCt_s-ΔCt_a。 ΔΔCt＞0.8 時(shí),判定 E7 或E8 純合缺失;-0.5＜ΔΔCt＜0.5 時(shí),判定雜合性缺失;ΔΔCt＜-0.6時(shí),判定未見(jiàn)缺失。

1.2.3 多重連接依賴探針擴(kuò)增技術(shù)(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA) 利用MLPA P460試劑盒(荷蘭MRC,荷蘭)對(duì)于SMN1基因E7和E8外顯子拷貝數(shù)變異進(jìn)行驗(yàn)證。MLPA P460試劑盒中探針包含SMN1基因E7和E8以及SMN2基因E7,經(jīng)變性、雜交、連接以及擴(kuò)增后,產(chǎn)物通過(guò)ABI3500基因分析儀(ThermFisher,美國(guó))進(jìn)行檢測(cè),得到的數(shù)據(jù)用Coffalyser V8.0軟件分析(http://www.mlpa.com/coffalyser)。目標(biāo)片段超過(guò)30%的增加或減少分別判定為目標(biāo)外顯子的重復(fù)或缺失。

2 結(jié) 果

5776例孕婦血樣中,E7單拷貝的人群有100例(100/5776,1.73%),其中E8單拷貝有93例,E8雙拷貝有7例,沒(méi)有E8大于雙拷貝的;E7雙拷貝的人群有5356例(5356/5776,92.73%),其中E8單拷貝有28例,E8雙拷貝有5216例,E8大于雙拷貝有112例;E7大于雙拷貝有 320例(320/5776,5.54%),其中沒(méi)有E8單拷貝,E8雙拷貝有14例,E8大于雙拷貝有306例(表1)。

表1 5776例孕婦的SMN1基因外顯子7和外顯子8的拷貝數(shù)

共篩查到100例孕婦(100/5776,1.73%)攜帶SMN1基因E7單拷貝或E7和E8單拷貝,其中E7和E8單拷貝的孕婦有93例,單純E7單拷貝有7例,攜帶者頻率為1∶58,即人群中每58例中有1個(gè)SMA攜帶者。對(duì)100例攜帶者進(jìn)行充分的遺傳咨詢后,其中91例(91/100,91%)配偶自愿接受SMA篩查,最終有3對(duì)夫婦均為SMA攜帶者,并且對(duì)3例高風(fēng)險(xiǎn)胎兒進(jìn)行了產(chǎn)前診斷,結(jié)果提示這3個(gè)胎兒均為SMN1基因單拷貝,即SMA攜帶者(圖1)。

圖1 SMA篩查和產(chǎn)前診斷流程

3 討 論

對(duì)于各種遺傳病攜帶者的篩查,在世界范圍內(nèi)已開(kāi)展了近三十年。早在1969年,對(duì)猶太人的家族性黑蒙性癡呆進(jìn)行攜帶者篩查,有效降低了該疾病在猶太人群中的發(fā)病概率。隨后又開(kāi)展了囊性纖維化、血紅蛋白病、脆X綜合征等疾病的攜帶者篩查[10]。2008年美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)會(huì)(ACMG)的指南提出[8],符合以下條件的疾病適合于攜帶者篩查:(1)疾病的臨床表現(xiàn)嚴(yán)重;(2)在人群中具有較高的攜帶者頻率;(3)檢測(cè)技術(shù)具有較高的特異性和敏感性;(4)適合于進(jìn)行產(chǎn)前診斷;(5)可進(jìn)行遺傳咨詢。SMA完全符合以上所有條件,所以ACMG[8]和ACOG[9]均建議備孕或孕期女性應(yīng)進(jìn)行SMA攜帶者篩查。

本研究對(duì)16549例孕婦進(jìn)行SMA篩查的宣教,其中5776例孕婦自愿接受SMA篩查,接受比率為34.9%。相較于2011年報(bào)道的臺(tái)灣地區(qū)的接受率(10.6%),有了大幅度的提高[11],但是比其他國(guó)家的接受率低得多。Prior等[12]報(bào)道,美國(guó)人群中98.7%接受SMA攜帶者篩查[12]。Ben等[13]報(bào)道,以色列人群中93%要求進(jìn)行SMA攜帶者篩查。分析國(guó)內(nèi)接受程度比較低的原因主要與人群對(duì)于SMA疾病不了解,且沒(méi)有相關(guān)家族史相關(guān),其次與費(fèi)用相關(guān)。因此,加強(qiáng)SMA篩查的宣教以及政府機(jī)構(gòu)的相關(guān)政策的實(shí)施將有利于提高SMA篩查的人群接受程度。

中國(guó)人群中首次大樣本量的SMA篩查是在中國(guó)臺(tái)灣地區(qū),2005年至2009年共篩查臺(tái)灣地區(qū)10萬(wàn)余例孕婦,共檢出2262例SMA攜帶者,該地區(qū)的攜帶者頻率為1∶48[11]。2013年[14]上海地區(qū)報(bào)道了4719例孕婦的攜帶者篩查,該地區(qū)的攜帶者頻率為1∶52。近兩年,廣西[15]、陜西[16]及云南地區(qū)[17]分別報(bào)道了本地區(qū)的攜帶者頻率,分別為1∶81、1∶54和1∶49。本研究首次對(duì)江蘇地區(qū)5776例孕婦進(jìn)行SMA攜帶者篩查,共發(fā)現(xiàn)100例SMA攜帶者,攜帶者頻率為1∶58。根據(jù)已有文獻(xiàn)報(bào)道,國(guó)內(nèi)除了廣西地區(qū)報(bào)道的攜帶者頻率較低外,其余地區(qū)的攜帶者頻率均相近。

每一種遺傳病的攜帶者篩查都存在一定的殘余風(fēng)險(xiǎn),對(duì)于SMA篩查,人群中有少量攜帶者是普通的篩查方案無(wú)法檢出的,包括SMN1基因“2+0”型、“1+1D”和“2+1D”。即一條染色體上有兩個(gè)SMN1基因,而另一條染色體上沒(méi)有SMN1基因或SMN1基因點(diǎn)突變;或者,一條染色體上有一個(gè)SMN1基因,而另一條染色體上SMN1基因點(diǎn)突變[18]。如果夫婦雙方有一方為SMA攜帶者,另一方雖然SMN1基因?yàn)殡p拷貝,但不能排除以上幾種可能性,所以在篩查咨詢中要關(guān)注殘余風(fēng)險(xiǎn)的存在。

建議標(biāo)準(zhǔn)化的SMA篩查流程對(duì)于臨床開(kāi)展該項(xiàng)目有著至關(guān)重要的作用。(1)對(duì)孕婦人群進(jìn)行宣教,讓孕婦充分了解SMA疾病的病因、臨床表現(xiàn)和嚴(yán)重程度,提高篩查接受程度;(2)簽署知情同意書,告知該檢測(cè)的目的、方法及局限性,孕婦自愿接受該項(xiàng)篩查;(3)出具報(bào)告,對(duì)于SMN1基因E7或E7/8單拷貝人群,即SMA攜帶者,通知配偶進(jìn)行SMA篩查;(4)如果夫婦雙方均為SMA攜帶者,則建議遺傳咨詢與產(chǎn)前診斷門診就診,對(duì)于高風(fēng)險(xiǎn)胎兒進(jìn)行SMN1和SMN2基因檢測(cè),SMN1基因如果為零拷貝,則可根據(jù)SMN2基因的拷貝數(shù)推測(cè)胎兒出生后的臨床表現(xiàn)。近年來(lái)SMA的治療手段有了長(zhǎng)足的進(jìn)展[19],特別是2019年首個(gè)SMA治療藥物諾西那生鈉的國(guó)內(nèi)上市。SMA治療方案在遺傳咨詢中不應(yīng)被忽略,應(yīng)將檢測(cè)結(jié)果、臨床表現(xiàn)及治療方案充分告知夫婦雙方。在整個(gè)篩查流程中,完善的遺傳咨詢、全面的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估以及充分殘余風(fēng)險(xiǎn)告知尤其重要。