陳忠新，茍?chǎng)斡睿簿褒?，?穎，李 強(qiáng)

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱150040；2.哈爾濱維科生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司，黑龍江 哈爾濱150069）

清心蓮子飲是國(guó)家發(fā)布的第一批《經(jīng)典名方目錄》方藥之一，來(lái)源于《太平惠民和劑局方》，具有清心火，益氣陰，交心腎、清熱利濕、益氣扶正、生津、收斂浮陽(yáng)之功效[1]。主治：小便白濁，便赤如血，口舌干燥漸成消渴，男子五淋，婦人帶下赤白及病后氣不收斂，五心煩熱?，F(xiàn)今臨床仍廣泛應(yīng)用，多用于治療腎臟疾病及尿路感染等[2-4]。

該方由九味中藥組成，其中車(chē)前子清熱利濕為方中臣藥，其有效成分環(huán)烯醚萜類(lèi)京尼平苷酸具有抗炎作用[5,6]。本研究以京尼平苷酸為指標(biāo)性成分，采用HPLC測(cè)定其含量，為清心蓮子飲的后續(xù)研究及應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 儀器、試藥及藥材

1.1 儀器

ThermoU3000型高效液相色譜儀（賽默飛世爾科技有限公司）;AB204-N型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）;KQ-500D型超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司）;GLZY-0.5B型真空冷凍干燥機(jī)（上海浦東冷凍干燥設(shè)備有限公司）。

1.2 試藥及藥材

購(gòu)自中檢所的京尼平苷酸對(duì)照品（批號(hào)：111828-201403）；色譜甲醇采購(gòu)于迪馬科技有限公司；甲醇、HAc等分析純?cè)噭┚?gòu)自天津天大化學(xué)試劑有限公司；方中九味藥材均為道地藥材，其中車(chē)前子購(gòu)自河北省滄州市。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

選用Elite HPLC C18（4.6×25mm，5μm）色譜柱，以甲醇-0.5% HAc（體積比5→32∶95→68）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，將檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)定為254nm，柱溫采用30℃，流速設(shè)置為1.0mL·min-1。

2.2 供試品溶液的制備

按《太平惠民和劑局方》記載，稱(chēng)取蓮子30g、黃芩20g、車(chē)前子20g、茯苓30g、麥冬20g、地骨皮20g、炙黃芪30g、人參30g、炙甘草20g?；旌头鬯檫^(guò)篩并混勻，稱(chēng)取粗粉12g，加麥冬3g，300mL水煎煮兩次，每次1h，得240mL標(biāo)準(zhǔn)煎液。制備成凍干粉，備用。精取凍干粉0.22g，用20mL 60%甲醇超聲溶解20min，濾過(guò)，蒸干，甲醇定容至10mL容量瓶中，即得。

2.3 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取京尼平苷酸對(duì)照品4.5mg，甲醇溶解并定容至50mL容量瓶中，制成濃度為0.09mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，即得。

2.4 陰性樣品溶液的制備

稱(chēng)取處方中除車(chē)前子外的其他八味藥材，按2.2項(xiàng)下方法制備成陰性對(duì)照樣品溶液。

2.5 專(zhuān)屬性考察

按2.1項(xiàng)下色譜條件，取對(duì)照品溶液、供試品溶液以及陰性對(duì)照液，進(jìn)行色譜測(cè)定，結(jié)果在246nm條件下，對(duì)照品溶液及供試品溶液在相同的保留時(shí)間呈現(xiàn)一致的特征峰，而陰性樣品溶液無(wú)對(duì)應(yīng)色譜峰，因此說(shuō)明，陰性對(duì)照樣品對(duì)京尼平苷酸的測(cè)定無(wú)干擾。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 對(duì)照品、供試品及陰性對(duì)照色譜圖Fig.1 Chromatograms of standard,test sample and negative control

2.6 線性關(guān)系考察

精密吸取2.3項(xiàng)下京尼平苷酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液各2、4、6、8、10μL，注入高效液相色譜儀，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以含量為X軸，峰面積比值為Y軸進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=11.185X+0.065，R2=0.9999。結(jié)果表明京尼平苷酸含量在0.18～0.90μg之間線性關(guān)系良好。

2.7 精密度考察

取2.2項(xiàng)下供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣測(cè)定6次，每次10μL，計(jì)算京尼平苷酸峰面積的RSD值為0.76%（RSD＜3%），表明儀器精密度良好。

2.8 重復(fù)性考察

分別量取2.2項(xiàng)下各凍干粉0.22g按后續(xù)方法進(jìn)行處理，制成6份供試品溶液，各進(jìn)樣10μL，測(cè)得京尼平苷酸平均值為4.8025mg·劑-1，RSD值為2.65%（RSD＜3%），表明方法重復(fù)性良好。

2.9 穩(wěn)定性考察

取配制好的同一供試品溶液，在0、2、4、6、8、10、12h各進(jìn)樣10μL，測(cè)得京尼平苷酸峰面積RSD值為2.59%（RSD＜3%），表明樣品在配制完成后的12h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.10 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)取2.2項(xiàng)下制備的6份清心蓮子飲凍干粉各0.11g，分別加入0.14mg·mL-1的京尼平苷酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液各1mL，制備成供試品溶液，測(cè)定條件參照2.1項(xiàng)，每次進(jìn)樣量同上，計(jì)算回收率，結(jié)果符合加樣回收率要求，見(jiàn)表1。

2.11 樣品含量測(cè)定

分別取不同批次的清心蓮子飲凍干粉各0.22g，精密稱(chēng)定，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液。分別取10μL注入高效液相色譜儀中，記錄峰面積，計(jì)算京尼平苷酸含量。3批樣品京尼平苷酸含量分別為4.8244、4.8770和5.0073mg·劑-1，考慮到實(shí)驗(yàn)誤差的存在，各基準(zhǔn)物質(zhì)含量略有差異，在合理的波動(dòng)范圍之間。

3 結(jié)論

清心蓮子飲化學(xué)成分復(fù)雜，車(chē)前子為方中臣藥，京尼平苷酸為車(chē)前子的主要有效成分。本實(shí)驗(yàn)建立了一種高效液相色譜方法，并對(duì)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行了方法學(xué)考察，并用該方法對(duì)3個(gè)平行批次樣品中該指標(biāo)性成分的含量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)方法比較成熟，科學(xué)合理，穩(wěn)定可靠，重復(fù)性好，在線性范圍內(nèi)具有良好的靈敏度和加樣回收率，為清心蓮子飲有效成分的含量測(cè)定、質(zhì)量控制以及臨床的合理應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論支持。