位小杰，劉東璞，賈詩(shī)慧 ，薛 超，盧鳳美

(1.佳木斯大學(xué)研究生院，黑龍江 佳木斯 154007；2.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

肝臟纖維化的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜多樣，肝細(xì)胞損傷原因不單一，當(dāng)肝細(xì)胞發(fā)生炎癥壞死刺激后使原本具有儲(chǔ)脂功能的細(xì)胞肝星狀細(xì)胞活化轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，并釋放出大量細(xì)胞外基質(zhì)，和其生成和吸收之間的平衡打破,最后形成肝纖維化。因此，肝星狀細(xì)胞的活化是肝纖維化的關(guān)鍵。實(shí)驗(yàn)證明大黃酸具有抗炎，抗纖維化作用。紅景天有抗氧化應(yīng)激和抑制自由基的形成的功效。在本課題在前期實(shí)驗(yàn)中得出大黃酸和紅景天聯(lián)合用藥對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化有較好的治療效果，現(xiàn)為探索大黃酸聯(lián)合紅景天對(duì)膽汁淤積致肝纖維化的治療作用，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)采用BDL肝纖維化模型，觀察大黃酸聯(lián)合紅景天對(duì)膽汁淤積性肝纖維化治療作用并對(duì)其作用機(jī)制做初步探索。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康成年SD雄性大鼠40只，180～220g重。進(jìn)行觀察喂養(yǎng)5d，挑出健康和營(yíng)養(yǎng)狀況在同一水平的大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組

將40只大鼠隨機(jī)平均分為4組。分別為：假手術(shù)組(Sham組)：膽總管游離術(shù)后利用同等體積的生理鹽水進(jìn)行灌胃；模型組(Model組)：行BDL術(shù)和生理鹽水灌胃；大黃酸組(R組)：行BDL術(shù)和大黃酸灌胃；大黃酸聯(lián)合紅景天組(RR組)：行BDL術(shù)和大黃酸聯(lián)合紅景天灌胃。

1.2.2 肝纖維化模型制備

大鼠肝纖維化模型是利用膽總管雙重結(jié)扎誘導(dǎo)的肝纖維化模型，將大鼠用4%水合氯醛麻醉后，備皮消毒后開(kāi)腹，分離膽總管，用0號(hào)線(xiàn)雙重結(jié)扎后從中間剪斷膽總管防止再通，生理鹽水沖洗后關(guān)腹，術(shù)后觀察后常規(guī)喂養(yǎng)。

1.2.3 藥物治療

BDL術(shù)后24h后，R組和RR組在造模的同時(shí)，給予治療。R組：按100mg/kg劑量進(jìn)行灌胃處理。方法：大黃酸用生理鹽水?dāng)嚢枞芙?。RR組：將大黃酸紅景天用生理鹽水溶解后按劑量大黃酸100mg/kg，紅景天400mg/kg劑量進(jìn)行灌胃處理，每周3次，共4周。

1.2.4 進(jìn)行生化指標(biāo)的檢測(cè)

取大鼠眼內(nèi)眥靜脈血采用生化分析儀進(jìn)行檢測(cè)AST、ALT、TBIL、DBIL、生化指標(biāo)檢測(cè)。

1.2.5 計(jì)算大鼠肝體比

按照公式：肝臟體重(g)/大鼠抽血前體重(g)×100%計(jì)算肝體比。

1.2.6 大鼠組織病理學(xué)觀察

將大鼠肝組織用無(wú)水乙醇固定后，進(jìn)行取材，脫水透明，侵蠟，做成蠟塊。將蠟塊進(jìn)行切片，撈片，烘干后進(jìn)行HE染色，使用普通光學(xué)顯微鏡觀察肝組織形態(tài)，任選5個(gè)視野拍照。

1.2.7采用RT-PCR測(cè)定α-SMA、Hab18G/CD147mRNA的表達(dá)

肝組織提取總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄并進(jìn)行RNA的擴(kuò)增。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠的一般狀況

S組大鼠整體狀況良好，精神狀況佳，飲食正常，體重逐漸增長(zhǎng)。二便正常，尿清，大便成形。M組大鼠在手術(shù)實(shí)施后表現(xiàn)痛苦，姿勢(shì)呈弓背狀，有明顯炸毛病態(tài)狀，精神萎靡嗜睡，飲食量減少，幾乎不活動(dòng)，隨后飲食恢復(fù)，體重少量增加，大便呈白陶土樣。R組大鼠精神可，飲食可，活動(dòng)量少。RR組大鼠飲食良好，精神狀況欠佳，體重持續(xù)增長(zhǎng)。

2.2 大鼠生化指標(biāo)

由表1 可以觀察到，與S組比較，M組大鼠血清中TBIL、DBIL、ALT和AST水平均顯著升高(P<0.05) ，提示BDL模型大鼠的膽道梗阻明顯，肝細(xì)胞受到嚴(yán)重?fù)p害。R組和RRALT、AST、TBIL和DBIL的水平與模型對(duì)照組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0. 05)。說(shuō)明大黃酸和紅景天用藥能夠降低BDL誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠的黃疸水平及肝損傷程度。

表1 不同處理方法對(duì)大鼠血清生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果的影響

2.3 大鼠肝體比

由表2可以看出，各組大鼠肝體比均較S組升高(P<0.05)，說(shuō)明BDL肝纖維化模型中肝臟有不同程度的損害；R組、RR組肝體比較M組降低(P<0.05)，說(shuō)明大黃酸單獨(dú)用藥和大黃酸和紅景天聯(lián)合用藥均能夠降低肝臟損害；RR組較R組肝體比降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)說(shuō)明大黃酸和紅景天兩種藥物有協(xié)同治療的作用。

表2 不同處理方法對(duì)大鼠肝體比檢測(cè)結(jié)果的影響

2.4 大鼠組織病理學(xué)觀察

切片進(jìn)行HE染色后，觀察假手術(shù)組大鼠切片，肝小葉排列整齊，肝細(xì)胞形態(tài)正常，未發(fā)生纖維化。模型組大鼠肝臟肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝條索間隙增寬，排列紊亂，伴肝細(xì)胞脂肪變，肝小葉間大量纖維膠原大量增生，向小葉間插入，形成纖維變形。大黃酸組肝小葉間有纖維膠原增生，肝細(xì)胞大小均一，有少量的脂肪變，纖維化程度減輕。大黃酸聯(lián)合紅景天組纖維組織明顯減少，肝組織纖維化程度最輕。上述結(jié)果由兩名資深病理科醫(yī)師診斷判定。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠組織學(xué)觀察(×100)

2.5 實(shí)驗(yàn)大鼠肝組織細(xì)胞因子α-SMA、Hab18G/CD147 mRNA 表達(dá)

為了證實(shí)大黃酸聯(lián)合紅景天抗 BDL引起的肝纖維化作用和α-SMA，Hab18G/CD147表達(dá)有關(guān)，我們測(cè)定了大鼠肝組織中的 α-SMA 、Hab18G/CD147m RNA 水平。由表3可以看出與S組相比，各組α-SMA、Hab18G/CD147mRNA 水平顯著增高(P<0.05)；與M組相比，R組、RR組α-SMA、Hab18G/CD147mRNA表達(dá)顯著降低；RR組較R組α-SMA、Hab18G/CD147mRNA表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 大鼠肝組織中細(xì)胞因子表達(dá)情況

3 討論

膽汁淤積性肝損傷是威脅人們健康的重要原因之一。慢性膽石癥、膽汁淤積性肝炎等均可發(fā)展為膽汁淤積性肝纖維化，其特點(diǎn)是以膽管增生、肝細(xì)胞壞死、肝臟纖維化為特征的病理過(guò)程，目前臨床上尚未有行之有效的方法[1,2]。BDL誘導(dǎo)的肝纖維化模型與人類(lèi)膽汁淤積性肝纖維化病變特點(diǎn)有極大的相似之處，具有造模時(shí)間短，成功率高，成活性高等特點(diǎn)。由于膽汁淤積及膽汁酸長(zhǎng)期作用于肝臟，肝細(xì)胞可出現(xiàn)進(jìn)行性損傷。膽汁淤積性損傷是肝纖維化、肝硬化的誘發(fā)因素[3,4]。在實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行膽總管結(jié)扎后，出現(xiàn)黃疸，膽管增生，肝細(xì)胞壞死，纖維結(jié)締組織增生等病理變化。大黃酸聯(lián)合紅景天給藥四周干預(yù)后，大鼠肝纖維化程度明顯好轉(zhuǎn)。說(shuō)明大黃酸聯(lián)合紅景天給藥對(duì)肝纖維化有一定的治療作用。

肝臟炎癥會(huì)引起肝實(shí)質(zhì)的損害，當(dāng)肝臟受到慢性肝損傷的侵害時(shí)，肝臟會(huì)啟動(dòng)修復(fù)的機(jī)制，肝纖維化物質(zhì)會(huì)增加，而降解該物質(zhì)的細(xì)胞因子不足或者活性受到抑制從而引起肝纖維化，但是肝纖維化是任何一種肝病走向肝硬化的必經(jīng)之路，有研究證明肝纖維化是可逆轉(zhuǎn)的[5]。肝纖維化的過(guò)程中，檢測(cè)血清生化指標(biāo)如 AST、ALT 等都能不同程度地體現(xiàn)出肝臟病變的水平[6]。在實(shí)驗(yàn)中我們觀察到在肝纖維化造模構(gòu)造期間，大鼠肝體比，AST，ALT水平與空白組比較均明顯升高。說(shuō)明造模過(guò)程中肝細(xì)胞損害嚴(yán)重。TBIL、DBIL為膽汁淤積的血清生化指標(biāo)，與S組相比，M組大鼠TBIL、DBIL值較高，證實(shí)膽總管結(jié)扎后引起了進(jìn)行性的肝臟損害。給藥四周后，大黃酸組、大黃酸紅景天聯(lián)合用藥組與模型組比較，上述指標(biāo)均降低，肝纖維化程度有所改善。說(shuō)明在藥物的作用下肝臟有一定的自愈能力。肝纖維化過(guò)程中，肝星狀細(xì)胞活化是關(guān)鍵步驟，活化的肝星狀細(xì)胞表達(dá)于α-SMA，BDL肝纖維化類(lèi)型α-SMA主要表達(dá)在門(mén)脈區(qū)[7]。而有研究證明Hab18G/CD147能夠激活肝星狀細(xì)胞，并在肝星狀細(xì)胞中表達(dá)[8]。使肝組織中膠原纖維增生，細(xì)胞外基質(zhì)分泌和降解平衡被打破，是造成肝纖維化密切相關(guān)。當(dāng)大黃酸和紅景天用藥后，α-SMA、Hab18G/CD147mRNA 的表達(dá)均明顯降低，說(shuō)明大黃酸和紅景天作用的基質(zhì)可能與降低α-SMA、Hab18G/CD147mRNA表達(dá)有關(guān)。綜上所述，大黃酸聯(lián)合紅景天對(duì)BDL誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化有一定的治療作用。