王 明，張家瑋，于 濤,魏 巍

(1．佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨外二科，黑龍江 佳木斯 154003；2.佳木斯市腫瘤結(jié)核醫(yī)院乳腺外科，黑龍江 佳木斯 154007)

骨轉(zhuǎn)移癌是指原發(fā)性惡性腫瘤向骨轉(zhuǎn)移引起的骨破壞。晚期癌癥的骨轉(zhuǎn)移率一般在80%以上。癌細(xì)胞向骨轉(zhuǎn)移時，常出現(xiàn)與運(yùn)動系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)有關(guān)的癥狀，如骨痛、病理性骨折等，將大大縮短骨轉(zhuǎn)移患者的生存率。當(dāng)前，確診癌癥是否骨轉(zhuǎn)移的常規(guī)辦法有：腫瘤標(biāo)志物檢查、放射線、核素骨掃描、磁共振等，但當(dāng)上述檢查出現(xiàn)改變時，往往意味著骨質(zhì)已經(jīng)破壞，同時敏感度與特異度較差，組織活檢為金標(biāo)準(zhǔn)但取材困難，為有創(chuàng)檢查，易造成腫瘤進(jìn)一步擴(kuò)散。由于確診較晚，即使通過藥物、射線、手術(shù)等相關(guān)治療，預(yù)后仍然很差。近年來，miRNA被發(fā)現(xiàn)在人類生命活動中有著不可替代的作用，同時也是腫瘤增值、侵襲、轉(zhuǎn)移的橋梁，本文旨在探討mir-335-5p在外周血中的表達(dá)與肺癌及其骨轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選取2019-10～2020-01佳木斯市腫瘤結(jié)核醫(yī)院收治的30例肺癌患者血樣。骨轉(zhuǎn)移組15例，平均年齡(59.33±11.61)歲，納入標(biāo)準(zhǔn)：①均經(jīng)過病理切片確診；②均通過PET-CT或ECT確診為骨轉(zhuǎn)移。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有其他原發(fā)腫瘤；②患者本人不同意參加實(shí)驗(yàn)。原位癌組15例，平均年齡(62.33±12.58)歲，納入標(biāo)準(zhǔn)：均經(jīng)過病理切片確診；排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有其他原發(fā)腫瘤；②患者本人不同意參加實(shí)驗(yàn)。以及12例正常人血液樣本。實(shí)驗(yàn)經(jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn)，患者知情同意，兩組受試者年齡無顯著性差異。

1.2 全血mir-335-5p的檢測

1.2.1 標(biāo)本采集

采用含6%乙二胺四乙酸的一次性BD-Vacutainer1管靜脈輸注采集所有患者外周血樣2mL。于抗凝管內(nèi)混勻后將樣本分為4份各250μL置于4個1.5mL無RNA酶離心管內(nèi)，將分裝后樣本標(biāo)記并置于-80℃低溫保存。

1.2.2 實(shí)時熒光定量PCR檢測miRNA-335-5P

Trizol法提取外周血中的miRNA，使用生工mirna反轉(zhuǎn)錄試劑盒(加尾法)將mirna合成cDNA。反應(yīng)溫度為：37°作用60min；85°作用5min。Q-PCR反應(yīng)體系與程序按生工熒光定量PCR試劑盒(染料法)說明書推薦進(jìn)行。mir-335-5p引物序列為：上游引物：5’-CGCGCTCAAGAGCAATAACGAAAAATG-3’,下游引物：為反轉(zhuǎn)錄試劑盒中下游通用引物(Universal PCR Primer R(10μL))。U6內(nèi)參引物為反轉(zhuǎn)錄試劑盒中U6(Universal U6 Primer F(10μL))和下游通用引物(Universal PCR Primer R(10μL))。反應(yīng)體系：2Xmirna qPCR master mix 10μL；上下游引物各0.5μL；cDNA 2μL；ROX Reference Dye(H)1μL；RNase-free water 6μL；應(yīng)用7300 real time PCR進(jìn)行檢測。反應(yīng)條件為：95°30s；(95°5s +60°30s)進(jìn)行40個循環(huán)；溶解曲線以7300 real time PCR儀推薦的程序自動設(shè)定。每份樣本均在同等條件下進(jìn)行mir-335-5p的檢測，每個樣本進(jìn)行2次重復(fù)。濃度相對水平進(jìn)行對數(shù)( 2^-△△CT) 處理后，計(jì)算 miR - 335 - 5p 基因的起始模板量從而反映出mir-335-5p基因的濃度相對水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 外周血中miRNA-335-5p在正常人、肺癌原位癌、肺癌骨轉(zhuǎn)移患者中的表達(dá)水平

骨轉(zhuǎn)移組對數(shù)變化(0.69±0.17)較原發(fā)性肺癌組對數(shù)變化(0.42±0.19)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖1。

圖1 正常對照組、原位癌組、骨轉(zhuǎn)移組之間的差異表達(dá)

2.2 ROC水平曲線分析

ROC曲線顯示mir-335-5p能夠明顯的區(qū)分肺癌原位癌和骨轉(zhuǎn)移癌。見圖2。ROC曲線下面積AUC為：0.838,95%置信區(qū)間為(0.689～0.985)(P<0.01)。

圖2 ROC水平曲線

2.3 mir-335-5p于肺癌骨轉(zhuǎn)移患者臨床相關(guān)性

mir-335-5p的表達(dá)在肺癌患者年齡(>60歲；≤60歲)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與患者化療前和化療后，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與骨轉(zhuǎn)移發(fā)生與否，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 mir-335-5p臨床特性的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

3 討論

MicroRNA是一類僅有21-25個核苷酸的小非編碼RNA家族，它通過與靶mRNA的互補(bǔ)位點(diǎn)配對，抑制信使RNA(mRNA)的翻譯，促進(jìn)mRNA的降解[1]。MicroRNA與人類多種惡性腫瘤的生物學(xué)行為密切相關(guān)，在這些惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用[2]。目前在肺癌及其骨轉(zhuǎn)移中，以miRNA作為其診斷標(biāo)志物的研究越來越廣泛。肺癌骨轉(zhuǎn)移中有兩種類型的miRNA改變，上調(diào)的有：miR-660-5p、mir-203、mir-125b-5p、mir-125b-2-3p等。下調(diào)的有：miR-192-5p、mir-335-5p、miR-139-5p、mir-29c、mir-21-3p等。MiRNA-335-5p屬于下調(diào)中的一員。mir-335-5p已被發(fā)現(xiàn)在多種惡性腫瘤中表達(dá)異常，例如：TGF-β1通過下調(diào)mir-335-5p的表達(dá)誘導(dǎo)NSCLC轉(zhuǎn)移[3];在結(jié)直腸癌中，mir-335-5p可通過下調(diào)IDHB抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[4];MiR-335通過上調(diào)CRKL抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖和遷移[5]；在骨肉瘤中DNACR可以通過miR-335-5p促進(jìn)腫瘤生長的和肺轉(zhuǎn)移[6]。除上述幾種惡性腫瘤外，尚有多種惡性腫瘤與mir-335-5p的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，包括前列腺癌，子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌等。

目前，mir-335-5p在肺癌骨轉(zhuǎn)移相關(guān)的研究較少。mir-335-5p在NSCLC中的表達(dá)顯著降低。在體外，恢復(fù)mir-335-5p的表達(dá)可以削弱NSCLC的侵襲能力[7],隨著疾病的發(fā)展，mir-335-5p 的表達(dá)持續(xù)下降，預(yù)后不良，總生存率降低；Mir-335-5p 在小細(xì)胞癌骨轉(zhuǎn)移瘤患者中的表達(dá)明顯下調(diào)。重建 mir-335-5p 的表達(dá)可顯著抑制小細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移。

已有多項(xiàng)研究表明在肺癌中，組織(腫瘤組織、骨轉(zhuǎn)移組織)、細(xì)胞(原位癌細(xì)胞、高轉(zhuǎn)移細(xì)胞)、生物學(xué)預(yù)測都已證明，相比于正常人mir-335-5p的表達(dá)明顯下調(diào)，并且隨著腫瘤進(jìn)一步發(fā)展直至發(fā)展到最終的骨轉(zhuǎn)移，mir-335-5p會進(jìn)一步降低。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明mir-335-5p的表達(dá)水平的顯著下調(diào)與肺癌從正常人到原位癌再到骨轉(zhuǎn)移的疾病進(jìn)展方向一致，mir-335-5p的表達(dá)在肺癌患者年齡差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；肺癌中mir-335-5p的表達(dá)在外周血、組織、細(xì)胞三者均隨著疾病進(jìn)展持續(xù)下降。mir-335-5p表達(dá)下調(diào)的機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，Mir-335-5p可作為肺癌診斷和治療及肺癌骨轉(zhuǎn)移的研究熱點(diǎn)，但本實(shí)驗(yàn)樣本量小，mir-335-5p在肺癌進(jìn)展為骨轉(zhuǎn)移的進(jìn)程中的潛在作用及其作為生物標(biāo)志物的臨床實(shí)用性有待進(jìn)一步研究。