張小悅，蔡華戈，曾繁飛，楊偉忠

(惠州市第三人民醫(yī)院泌尿外科， 廣東 惠州 516000)

不孕不育癥在臨床上較為常見，會對人類的身心健康構成較大的危害。WHO相關調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，目前全球范圍內(nèi)育齡夫婦中，不孕不育癥夫婦占到了其中的1/5，并且男、女因素約各占50%[1]。在不育癥中，男性因素較為復雜，其誘發(fā)因素諸多，常見的如遺傳、環(huán)境、感染、免疫等。近年來，隨著生態(tài)環(huán)境污染的加重，人們生活方式的改變，男性精液質(zhì)量不斷下降，男性不育患者數(shù)量逐漸增加，極大地降低了人類的生育水平。相較于無精癥、少精癥引發(fā)的男性不育，弱精子癥引起男性不育更為常見，占比最大[2]。 LYZL6(lysozyme-like 6)基因屬于溶菌酶類似蛋白(Lysozyme-like proteins，LYZLs)中的一種，既往動物實驗提示其在精子發(fā)生的過程中發(fā)揮重要作用，其可能與精子活力相關。因此，通過對LYZL6基因在正常男性及弱精子癥患者精液精子的表達差異研究，可揭示LYZL6基因與精子活力的關系，可為弱精子癥的診治提供新的思路。為此，本研究納入我院收治的36例弱精子癥患者和15例精液健康男性進行分析，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 實驗試劑

RNA提取試劑盒All Prep DNA/RNA Mini Extraction kit(80204)購自 Qiagen。反轉錄試劑盒 Prime Script RT reagent Kit和熒光定量試劑盒SYBR Premix Ex TaqTM II 均購自 Takara。LYZL6一抗(PA5-44117) 購自Thermo Fisher,內(nèi)參GAPDH一抗 (AF0006)購自碧云天，HRP-羊抗兔IgG 二抗(31460)購自Thermo Fisher。

1.2 精液標本收集

選取我院2019-06～2020-06男科門診診治的患者進行研究。收集精液，精液采用全自動計算機輔助精液分析系統(tǒng)(CASA)對精液進行常規(guī)分析。弱精子組納入標準：(1)精液常規(guī)精液中的前向運動精子總數(shù)(PR)<32%，反復檢測3次并確診；(2)年齡≥22周歲，已婚；(3)精神和認知正常，可完成基本的交流和溝通；(4)臨床資料完善、齊全。排除標準：(1)感染所致弱精子癥者；(2)合并心肝腎等器官功能障礙者；(3)合并精索靜脈曲張曲張等；(4)其它傳染性疾病者。另納入同期接受檢查健康的正常生育男性精液樣本作為研究對象，視為對照組，所納入者均已婚已育。精液標本收集前均充分告知患者并取得患者的知情同意，并得到惠州市第三人民醫(yī)院倫理委員會的批準。

1.3 Percoll法分離精液純化精子

采用文獻報道[3]的1層法梯度離心法分離精子，并顯微鏡下確認純化效果，分離純化后的精子經(jīng)PBS溶液洗滌2次后離心，儲存于-80 ℃冰箱。

1.4 熒光定量PCR法檢測

采用熒光定量PCR法檢測LYZL6 mRNA表達：(1)采用 All Prep DNA/RNA Mini Extraction kit (80204，Qiagen，USA)提取精子總RNA，用20μL無RNase dd H2O溶解。(2)采用Nano Drop TM Spectrophotometers RNA濃度測定儀(Thermo Scientific，USA)，檢測總RNA濃度、A260/A280及A230/260比率。(3)每例1μg RNA模板，應用Takara逆轉錄試劑盒(Prime Script RT reagent Kit)進行逆轉錄反應，反應體系為20μL。(4)用Takara SYBR Premix Ex TaqTM 羅氏480熒光定量PCR行qPCR，LYZL6 引物如表1。擴增條件：94℃5min; 94℃30s；65℃45s；72℃30s，30循環(huán)。采用2-△△Ct相對定量來檢測LYZL6 mRNA在正常精液精子和弱精子癥精液精子的表達差異。

表1 基因 RT-PCR 引物序列信息

1.5 Western blot檢測

采用Western blot檢測LYZL6蛋白表達：(1)精液標本加入適量蛋白裂解液，用超聲細胞破碎儀進行超聲裂解，樣品置冰上3～5min，12000rpm離心20min，取上清置于管中，-80℃保存。(2)考馬斯亮藍法測定蛋白含量。(3)樣品在10%SDS聚丙烯酰胺凝膠上電泳，濃縮膠電壓80V，分離膠電壓120V。(4)使用電轉移儀將樣品轉至 PVDF 膜上(400mA電流冰上電轉移2h)。(5)將膜移至封閉液中封閉1h，TBST漂洗3次。(6)加入一抗，室溫下作用1h，TBST漂洗3次。(7)加入二抗，室溫下作用1h，TBST 漂洗3次。(8)辣根過氧化物酶-ECL 法顯影。(9)凝膠圖像系統(tǒng)分析目標條帶的灰度值，以分子Marker確定目標條帶分子量。

1.6 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 兩組精液分析的主要參數(shù)比較

按以上納入及排除標準，收集36例弱精子癥患者精液標本及15例正常對照組精液標本，收集并分析兩組間精液樣本參數(shù)，發(fā)現(xiàn)兩組樣本在年齡、精液體積、精子濃度上沒有統(tǒng)計學差異(P>0.05),但正常組中前向運動精子率、精子總活力、形態(tài)正常精子率均高于弱精子癥組，具有統(tǒng)計學差異(P<0.01),見表2。

表2 兩組精液分析的主要參數(shù)比較

2.2 兩組LYZL6 mRNA表達的比較

經(jīng)熒光定量PCR檢測LYZL6 mRNA在精液中表達，發(fā)現(xiàn)LYZL6 mRNA在弱精子癥患者和正常生育男性精液精子中均未見明顯表達。

2.3 兩組LYZL6 蛋白表達的比較

為進一步檢測LYZL6蛋白在弱精子癥患者及正常對照組的表達情況，采用Western blot技術檢測了15例正常精子樣本和35例弱精子癥樣本中LYZL6蛋白的表達水平。運用Image Lab圖像分析軟件進行灰度值分析，計算LYZL6蛋白的相對表達量，弱精子癥組LYZL6蛋白表達與正常對照組相比，顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖1。

圖1 LYZL6蛋白在正常對照組和弱精子癥患者精子中的表達

3 討論

男性弱精子癥是男性不育常見原因，根據(jù)《WHO人類精液及精子-宮頸黏液相互作用實驗室建議手冊》，將前向運動精子百分率低于32%，診斷為弱精子癥[4]。精子的頂體、尾部軸絲和纖維鞘的結構異常，都可能導致精子運動能力下降，進而導致弱精子癥。精子的發(fā)生包括了精原細胞的自我更新、精母細胞的減數(shù)分裂和精子細胞的變態(tài)過程，在這些過程中存在著復雜的基因表達與調(diào)控，任一環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題都會導致男性不育。目前對弱精子癥的病因及發(fā)病機制不明。

研究發(fā)現(xiàn)，DNAH1、CRISP2、Ropporin等[5～7]基因與弱精子癥的發(fā)生相關。 LYZL6基因屬于溶菌酶類似蛋白中的一種。目前研究發(fā)現(xiàn)溶菌酶蛋白如(LYZL2、LYZL4、SPACA3)表達于雄性動物(如小鼠或人)的生殖系統(tǒng)，定位于精子上，參與受精過程。LYZL6蛋白為屬于典型的C型溶菌酶, 是一種分泌蛋白，LYZL6蛋白表達于精子頂體后和后段及中段。在前期的動物實驗中我們發(fā)現(xiàn)，Lyzl6基因在小鼠21d齡及之前的睪丸中沒有表達，28d睪丸中開始持續(xù)高表達，Lyzl6 mRNA在14種小鼠組織中呈現(xiàn)睪丸顯著高表達[8]。采用Western Blot法檢測LYZL6 的表達情況進行了分析，在睪丸和附睪中檢測到了LYZL6蛋白的分布，類似其他類溶菌酶蛋白在男性生殖系統(tǒng)中的特異性分布。既往研究發(fā)現(xiàn)LYZL6可能在受精過程中發(fā)揮重要作用，LYZL6基因表達可能與精子活力相關[9]。本研究收集男性精液標本，采用計算機輔助精液分析儀，根據(jù) WHO 標準，篩選出正常精液標本及弱精子癥標本。采用 Percoll 不連續(xù)梯度法分離精子，分離后的精子進行熒光定量PCR法、Western blot法等檢測，通過對比分析弱精子癥患者和正常生育男性精液中，LYZL6 mRNA表達和LYZL6蛋白發(fā)現(xiàn)，LYZL6 mRNA在弱精子癥患者和正常生育男性精液精子中均未見明顯表達，提示精子為分化成熟細胞，LYZL6 mRNA在精

子分化成熟后可能停止表達，精子中的LYZL6蛋白可能是由生精過程中精母細胞產(chǎn)生分泌后附著于精子。通過Western blot法比較LYZL6蛋白在弱精子癥患者和正常組精子的表達發(fā)現(xiàn)弱精子癥LYZL6蛋白表達均明顯低于正常組(P<0.05)，提示了在弱精子癥患者中，的確存在LYZL6蛋白 表達異常的現(xiàn)象。根據(jù)本實驗結果，可以初步得出結論：LYZL6表達的異常，參與了弱精子癥的形成過程，對男性不育產(chǎn)生了較大的影響。但由于臨床關于相關方面的報道較少，再加上選取的樣本數(shù)量不足，可能會對本研究的結果產(chǎn)生影響，因此需在日后進一步深入研究。

綜上所述，LYZL6在弱精子癥患者精液精子中存在低表達的現(xiàn)象，提示LYZL6蛋白可能其在弱精子癥中扮演著非常重要的角色, LYZL6蛋白低表達可能是造成男性不育的因素之一，為揭示弱精子癥的病因及其臨床診療提供新思路。