曾 東 牛 嬌 李長(zhǎng)義 常 津 牛光良▲

1.北京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院口腔科，北京 100039；2.山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院口腔科，山西太原 030001；3.天津醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院院辦，天津 300070；4.天津大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院納米醫(yī)學(xué)研究所，天津 300072

口腔臨床中，無痛治療觀念的普及使局麻藥的應(yīng)用非常廣泛，且以局部注射麻醉為主，幾乎很少應(yīng)用口腔表面麻醉劑。表面麻醉劑具有無痛、無損傷等優(yōu)點(diǎn)[1]，更符合無痛治療理念。但是，現(xiàn)有商品化的表面麻醉劑普遍存在起效慢、作用表淺、麻醉效果不佳等缺點(diǎn)[1-2]，開發(fā)滲透力強(qiáng)、起效快、麻醉效果好的表面麻醉劑成為倍受關(guān)注的研究方向之一[3-4]，尤其以脂質(zhì)體為載體的透皮給藥系統(tǒng)為近年來新的研究方向[2]。

本課題組與天津大學(xué)材料學(xué)院納米生物技術(shù)研究所自主研發(fā)了新型表面麻醉劑-載鹽酸利多卡因葡聚糖基納米高分子脂質(zhì)體（Lidocaine hydrochloride lysine-linoleic acid modified dextran polymeric lipid vesicles，LID-LLD-PLVs），是以賴氨酸、亞油酸、葡聚糖和膽固醇合成的葡聚糖基納米高分子材料為載體，包載利多卡因（Lidocaine，LID）合成[5]，各項(xiàng)理化性能良好[5]，并具有優(yōu)越的透皮性能，可有效增加利多卡因的透皮量和滲透深度[6]。為了探討其口腔黏膜表面麻醉作用機(jī)制，本研究以家兔下頜前牙唇側(cè)牙齦為給藥部位，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time PCR）對(duì)牙齦、三叉神經(jīng)節(jié)和延髓中P 物質(zhì)（substance P，SP）、降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin gene related peptide，CGRP）和即刻早期基因（c-fos）進(jìn)行了mRNA 定量分析對(duì)比。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

1.1.1 材料與試劑

LID-LLD-PLVs，天津大學(xué)材料學(xué)院納米生物技術(shù)研究所實(shí)驗(yàn)室自制；Trizol，批號(hào)15596-026，Invitrogen生物科技公司；DEPC 處理水，批號(hào)BYL40387 上?；鶢栴D生物公司；異丙醇HPLC 級(jí)，上海國(guó)藥集團(tuán)；無水乙醇AR 級(jí)，上海國(guó)藥集團(tuán)；SYBRGreen PCR 試劑盒，批號(hào)F-415XL，反轉(zhuǎn)錄試劑盒，批號(hào)K1622，Thermo 科技有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

Real-time PCR 儀，ABI-7300，ABI 公司；旋渦振蕩器，XW-80A，上海青浦瀘西儀器廠；手握式電動(dòng)勻漿機(jī)，F(xiàn)6-10，德國(guó)FLUKO；低溫冷凍離心機(jī)，Sigma；移液器，吉爾森P 型移液器，3K15。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

新西蘭兔24 只，健康、口頜系統(tǒng)無異常，8 月齡，雌雄、顏色不限，體重（2.0±0.2）kg，購于北京隆安實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2014-0003，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：No.11401400000479。常溫普通飼料飼養(yǎng)1 周。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)天津醫(yī)科大學(xué)藥物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及給藥

將24 只家兔按體重分層隨機(jī)分組法分為4 組，每組6 只，為空白對(duì)照組（不給藥）、LID-LLD-PLVs 30 min、60 min 和90 min 組，給藥方法為下頜前牙唇側(cè)牙齦表面涂抹LID-LLD-PLVs 0.5 mL 30、60 min和90 min。

1.2.2 樣本采集

將家兔固定在手術(shù)臺(tái)上，體位選取仰臥位，麻醉方式為全麻，給藥途徑為經(jīng)耳緣靜脈，麻醉劑選擇20%烏拉坦，給藥劑量為3 mL/kg。按“1.2.1”給藥，然后同位置注射10%福爾馬林溶液25 μL。1 h 后，靜脈注射空氣致死，取給藥區(qū)牙齦，放入液氮速凍保存待測(cè)[7]。然后沿顱頂正中線做切口，長(zhǎng)度40～50 mm，分離骨膜，暴露前囟、人字縫和矢狀縫，確定開顱位置，咬骨鉗去除部分顱骨，暴露給藥同側(cè)三叉神經(jīng)節(jié)和延髓，取出放入液氮中速凍保存待測(cè)。每組兔子均進(jìn)行樣本采集[7]。

圖1 延髓的取出

1.2.3 應(yīng)用Real-time PCR 方法對(duì)牙齦、三叉神經(jīng)節(jié)和延髓中SP、CGRP 和c-fos 進(jìn)行mRNA 定量分析

1.2.3.1 總RNA 的抽提 取各組織100 mg 加入1 mL預(yù)冷Trizol；勻漿30～45 s（轉(zhuǎn)速8000 r/min），后移至無RNA 酶的離心管中，室溫放置5 min 后加入預(yù)冷的氯仿（200 μL 氯仿/1 mL Trizol），劇烈振蕩15 s，室溫放置10 min 后離心15 min（4℃，8000 r/min，12 000 g）；小心吸出上層水相500 μL 轉(zhuǎn)移至無RNA 酶的離心管中，加入等體積異丙醇顛倒混勻6～8 次，-20℃冰箱放置30 min，然后離心15 min（4℃，8000 r/min，10 000 g），可見RNA 沉淀；棄上清，650 μL 75%乙醇洗滌沉淀，離心5 min（4℃，8000 r/min，離心半徑10 cm），棄上清，重復(fù)洗滌1 次，棄上清，吸凈殘存乙醇，自然干燥5～10 min，20 μL DEPC 處理水，溶解RNA，-80℃冰箱保存待用[7]。

1.2.3.2 逆轉(zhuǎn)錄cDNA 將試劑盒從-80℃冰箱取出復(fù)溶，將5×逆轉(zhuǎn)錄buffer、dNTPs、MMLV、oligo（dT）10 000 r/min 數(shù)秒[7]。反應(yīng)體系為：5×逆轉(zhuǎn)錄buffer 4 μL，oligo（dT）0.5 μL，dNTPs 0.5 μL，逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV 1 μL，DEPC 處理水10 μL，RNA 模板4 μL，總體積20 μL。反應(yīng)條件：37℃1 h；95℃5min。滅活MMLV[7]。

1.2.3.3 real-time PCR 擴(kuò)增 擴(kuò)增體系為：SYBRGreen Mix 32.5 μL，上游引物F 0.5 μL，下游引物R 0.5 μL，ddH2O 水14.5 μL，cDNA 模板2 μL，總體積50 μL。條件：95℃10 min，95℃15 s，60℃45 s，40 循環(huán)[7]。溶解曲線：95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s，60℃15 s[7]。引物序列：SP，正向引物：5’-TGCCGCTTCATTTATGTC-3’；反向引物：5’-ACACTGTGCTTTGTTGAG-3’。CGRP，正向引物：5’-TGGGCTTCCTCAAGTTCTCC-3’；反向引物：5’-TCTGTCTCCTGCTGCTGTTC-3’。c-fos：正向引物：5’-CTGAGGATGGTGGAGTTG-3’；反向引物：5’-CACGAGAGTGAGGATGAG-3’。GAPDH，正向引物：5’-CTCCTGCGACTTCAACAGTG-3’；反向引物：5’TGAGGGCTCTTACTCCTTGG-3’。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用儀器自帶軟件ABI Prism 7300 SDS Software分析計(jì)算SP、CGRP 和c-fos 的mRNA 絕對(duì)定量值。采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 17.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

SPmRNA 定量統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果：LID-LLD-PLVs30min組牙齦的SP mRNA 定量低于LID-LLD-PLVs 60 min，90 min 組，LID-LLD-PLVs 60 min 組低于LIDLLD-PLVs 90 min 組，各LID-LLD-PLVs 組均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；LID-LLD-PLVs 30 min、60 min 和90 min 三組延髓和三叉神經(jīng)節(jié)中的SP mRNA 定量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但都低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2A。

CGRP mRNA 定量統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果：LID-LLDPLVs 60 min 組牙齦的CGRP mRNA 定量低于LIDLLD-PLVs 30 min、90 min 組，LID-LLD-PLVs 30 min組低于LID-LLD-PLVs 90 min 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；LID-LLD-PLVs 90 min 組與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。LID-LLD-PLVs 30 min組延髓中CGRP mRNA 定量低于LID-LLD-PLVs 60 min 和90 min 組，LID-LLD-PLVs 各組均低于對(duì)照組。LID-LLD-PLVs 60 min 組三叉神經(jīng)節(jié)中CGRP mRNA 定量低于LID-LLD-PLVs 30 min 和90 min組，各LID-LLD-PLVs 組均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2B。

c-fos mRNA 定量統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果：LID-LLD-PLVs 30 min 組牙齦的c-fos mRNA 定量與LID-LLD-PLVs 60 min 組和90 min 組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。LID-LLD-PLVs 60 min 組延髓的c-fos mRNA 定量低于LID-LLD-PLVs 30 min 和90 min 組，LID-LLDPLVs 各組均低于對(duì)照組。LID-LLD-PLVs 60 min 和90 min 組三叉神經(jīng)節(jié)中c-fos mRNA 定量低于LIDLLD-PLVs 30 min 組，各LID-LLD-PLVs 組均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2C。

圖2 各組家兔牙齦、三叉神經(jīng)節(jié)和延髓中SP、CGRP 和c-fos 的mRNA 定量（，n=6）

3 討論

口頜面部疼痛的產(chǎn)生和傳遞主要由三叉神經(jīng)介導(dǎo)。當(dāng)口頜面部受到外界刺激，包括各種物理、化學(xué)刺激，伸入口頜面部組織內(nèi)的初級(jí)感覺神經(jīng)元的外軸突（位于三叉神經(jīng)傳入纖維內(nèi)）將信息上傳至胞體，胞體位于三叉神經(jīng)節(jié)內(nèi)。初級(jí)感覺神經(jīng)元的中樞突與延髓內(nèi)的三叉神經(jīng)脊束核相連，完成外周信息向三叉神經(jīng)脊束核的傳導(dǎo)，之后繼續(xù)上傳，到達(dá)腦中樞，完成初級(jí)感覺信息的傳導(dǎo)。痛覺信息的產(chǎn)生、傳遞過程非常復(fù)雜，很多物質(zhì)參與其中，在信息的傳遞與調(diào)節(jié)過程中起著至關(guān)重要的作用，通常將這類物質(zhì)叫做神經(jīng)遞質(zhì)[7,9-10]。已有研究顯示，與口頜面部疼痛相關(guān)的物質(zhì)有SP、CGRP、c-fos 基因等[6-7,11-12]。SP 和CGRP 屬于肽類神經(jīng)遞質(zhì)，在口腔頜面部疼痛機(jī)制研究中涉及較多，以往的研究[13-14]多集中在牙髓炎[15]、牙周炎[16]、正畸[17]加力引致的疼痛等方面，c-fos 的研究相對(duì)較少。而關(guān)于局麻藥對(duì)SP、CGRP 和c-fos 等物質(zhì)表達(dá)的影響，幾乎沒有相關(guān)研究。

SP 是最早被研究者發(fā)現(xiàn)的肽類神經(jīng)遞質(zhì)[16]，也是最早在牙髓中發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)肽，它在組成結(jié)構(gòu)上含有11 個(gè)氨基酸。CGRP 是1983 年由Lénárd 等[18]發(fā)現(xiàn)的一種由37 個(gè)氨基酸組成的生物活性多肽。二者均由三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞合成并釋放輸送至延髓和牙髓、牙周組織等部位[21]。SP 通過擴(kuò)張血管、產(chǎn)生內(nèi)源性致痛物質(zhì)而致痛[22]。CGRP 存在范圍較廣，其釋放量與疼痛程度成正相關(guān)，即疼痛程度越強(qiáng)，它的釋放量越大。CGRP對(duì)SP 有正、反雙向調(diào)控作用，包括增加SP 的釋放[22]和傳導(dǎo)，降低降解速度[22]，延長(zhǎng)衰變等調(diào)控達(dá)到加強(qiáng)痛覺傳導(dǎo)的作用[7]。c-fos 基因[23-24]是一種即刻早期基因，無疼痛刺激時(shí)，c-fos 基因不表達(dá)，受到刺激后，迅速表達(dá)，所以在疼痛的早期即可在生物體內(nèi)出現(xiàn)[25]，有部分研究者在頜面部炎性疼痛的研究中，把三叉神經(jīng)脊束核的神經(jīng)元內(nèi)c-fos 表達(dá)水平作為判斷刺激強(qiáng)度的指標(biāo)[26]。

以往研究結(jié)果認(rèn)為，在疼痛信息的產(chǎn)生、傳遞與調(diào)節(jié)過程中，因?yàn)榇碳しN類、部位不同，參與的神經(jīng)遞質(zhì)及表達(dá)亦不同[7]。本研究應(yīng)用福爾馬林對(duì)牙齦致痛，對(duì)照組牙齦、三叉神經(jīng)節(jié)和延髓內(nèi)SP、c-fos、CGRP 均出現(xiàn)了高表達(dá)，證實(shí)了疼痛會(huì)誘發(fā)機(jī)體釋放這幾種神經(jīng)遞質(zhì)。應(yīng)用LID-LLD-PLVs 后再以福爾馬林在牙齦致痛，牙齦、三叉神經(jīng)節(jié)和延髓內(nèi)SP、CGRP 和c-fos均有不同程度的表達(dá)降低，且在90 min 內(nèi)作用未消失，推測(cè)LID-LLD-PLVs 對(duì)疼痛信息的傳遞起到了抑制作用，且作用時(shí)間＞90 min，肯定了其藥效的持久性。但在不同部位的相同時(shí)間、或同一部位的不同時(shí)間mRAN 的表達(dá)影響未發(fā)現(xiàn)一致性規(guī)律。分析原因可能是：神經(jīng)遞質(zhì)的合成、釋放兩種行為同時(shí)發(fā)生，最終的表達(dá)量取決于這兩種行為相互抵消的結(jié)果。當(dāng)傷害性刺激產(chǎn)生時(shí)，神經(jīng)遞質(zhì)在不同部位及不同時(shí)間的表達(dá)并不一致，表現(xiàn)為合成速度和釋放速度的不同，且不是維持在定量水平，而是處在動(dòng)態(tài)變化中，最終的表達(dá)量往往是不可預(yù)測(cè)的。而且即使在同一個(gè)部位，參與疼痛傳遞的神經(jīng)遞質(zhì)也不是唯一的，有部分因子已有研究證實(shí)，但是可能還包括很多未知因子，他們均可能對(duì)那些已知因子包括本研究涉及的SP、CGRP 和c-fos 的表達(dá)造成影響。另外在本實(shí)驗(yàn)中，家兔于全麻下完成實(shí)驗(yàn)，個(gè)體間麻醉深度的差異也可能影響SP、CGRP 和c-fos 的表達(dá)。所以，未來實(shí)驗(yàn)方向可以為進(jìn)一步確定是否有起決定性作用的某一神經(jīng)遞質(zhì)存在，并作為評(píng)價(jià)同類藥物作用機(jī)制的標(biāo)準(zhǔn)。