何莉，鄭曦，楊剛

心力衰竭為各種心臟疾病的終末階段，具有高致殘率和致死率[1]。近來研究發(fā)現(xiàn)，某些基因的異常表達(dá)和調(diào)控在心力衰竭發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[2]。微小核糖核酸（miRNA）是長度為18～24nt的非編碼RNA分子，可與mRNA結(jié)合阻斷蛋白編碼基因表達(dá)。研究顯示，成熟的miRNA在心肌細(xì)胞增殖、分化、凋亡等過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，與心血管疾病發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[3]。線粒體是細(xì)胞進(jìn)行有氧呼吸的主要場所，被稱為能量泵。有研究發(fā)現(xiàn)，線粒體參與心肌細(xì)胞能量代謝、氧化應(yīng)激以及程序性細(xì)胞死亡過程，其功能障礙與心肌肥厚、心力衰竭的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[4]。盡管有多種miRNA被證實在心力衰竭存在表達(dá)失調(diào)，但miR-1為心臟中表達(dá)最為豐富的miRNA，同時可在心肌組織中特異性表達(dá)。梁勇等[5]研究發(fā)現(xiàn)，壓力超負(fù)荷大鼠所致的心肌肥厚心肌組織中miR-1呈低表達(dá)，通過上調(diào)miR-1表達(dá)水平可有效抑制心肌纖維化，并進(jìn)一步抑制心肌肥厚和心室重構(gòu)。許佳昕等[6]研究發(fā)現(xiàn)，miR-1-3p水平與急性ST段抬高型心肌梗死患者冠狀動脈病變嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)，參與疾病進(jìn)展過程。miR-1a-3p與miR-1和miR-1-3p具有相同的堿基序列。目前就miR-1a-3p在心力衰竭患者心肌組織表達(dá)及其對心肌細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)、細(xì)胞凋亡、心室重構(gòu)的影響研究尚少。本研究利用異丙腎上腺素構(gòu)建心力衰竭大鼠模型，并通過miR-1激動劑上調(diào)miR-1a-3p水平，旨在為臨床治療提供更多參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物Wistar大鼠30只，購置于南京君科生物工程有限公司，貨號J002，SPF級，雄性，8～10周，體重250～300 g，平均體重（278.63±3.24）g，單籠喂養(yǎng)，自由飲食和飲水，溫度20～26℃，濕度為50%～60%。

1.2 心力衰竭大鼠模型構(gòu)建和分組適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為空白對照組、陰性對照組和miR-1a-3p組，每組各10只。陰性對照組和miR-1a-3p組大鼠予以鹽酸異丙腎上腺素（美國Sigma公司），腹腔注射，2.5 mg/kg·次，1/d，空白對照組大鼠予以等量無菌0.9%氯化鈉溶液，腹腔注射，1/d；4周后行超聲心動圖檢查，測定左室舒張末期壓（LVEDP），以LVEDP≥15 mmHg提示造模成功。造模成功后miR-1a-3p組大鼠予以miR-1激動劑（廣州銳博生物科技有限公司），尾靜脈注射，100 μl，2次/周，陰性對照組和空白對照組大鼠予以等量無菌0.9%氯化鈉溶液，尾靜脈注射，2/周。

1.3 心功能檢查miR-1激動劑干預(yù)后1周，2%異氟烷吸入麻醉大鼠，行超聲心動圖檢查，測定左心室收縮末期內(nèi)徑（LVESD）、左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）、左心室收縮末期容積（LVESV）、左心室舒張末期容積（LVEDV），連續(xù)測量3個心動周期取平均值，計算左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）和左心室短軸縮短率（LVFS），LVEF=（LVEDV-LVESV）/LVEDV×100%，LVFS=（LVEDD-LVESD）/LVEDD×100%。

1.4 心肌組織miR-1a-3p表達(dá)2%異氟烷吸入麻醉大鼠，取正中切口，開胸后取心臟，無菌0.9%氯化鈉溶液沖洗，置于10%中性甲醛溶液中固定24 h；取出加入Trizol溶液（北京普利萊基因技術(shù)有限公司，貨號R1030）提取心肌組織總RNA，置于EP管內(nèi)，利用勻漿機(jī)勻漿處理，冰上靜置10 min；加入氯仿透明處理，4℃離心15 min，12000 rpm；取上清液置于新的EP管內(nèi)，加入異丙醇500 μl，4℃離心10 min，12000 rpm；棄去上清液，加入75%乙醇，置于振蕩儀上洗滌10 s，4℃離心5 min，7500 rpm；棄去上清液，晾干后加入無酶無菌水（北京索萊寶科技有限公司，貨號R1600）溶解沉淀；取提取的組織RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（德國Qiagen公司，貨號205111）說明書操作合成cDNA；按照One-Step qRT-PCR試劑盒（上海聯(lián)邁生物工程有限公司，貨號LM-0051）說明書操作進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，以β-action為內(nèi)參，β-action：上游引物：5＇-GTCCCTCACCCTCCCAAAAG-3＇，下游引物：5＇-GCTGCCTCAACACCTCAACCC-3＇，miR-1a-3p：莖環(huán)引物：5＇-UGGAAUGUAAAG AAGUAUGUAU-3＇，實驗重復(fù)3次取平均值。

1.5 心肌細(xì)胞凋亡采用TUNEL法。取心肌組織制成4 μm的組織切片，按照TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（廣州賽研生物科技有限公司，貨號11684817910）說明書操作，滴加甘油在視野下，利用熒光顯微鏡計數(shù)（200～500個細(xì)胞）并拍照。

1.6 心肌組織線粒體超微結(jié)構(gòu)取心尖部位心肌組織制成4 μm的組織切片，滴加醋酸雙氧鈾-檸檬酸鉛染液染色15 min，透射電子顯微鏡（日本日立公司，型號H-7650）下觀察心肌組織和線粒體結(jié)構(gòu)。

1.7 心肌線粒體SDH、COX和ND1表達(dá)采用蛋白免疫印跡法。制備組織勻漿液，離心10 min，12 000 rpm；取上清液，以體積比1:1加入1%巰基乙醇混合液，沸水浴10 min；按照BCA蛋白定量分析試劑盒（美國賽默飛世爾公司，貨號23221-23230）說明書操作，取5 ml樣品利用酶標(biāo)儀（美國賽默飛世爾公司，型號Multskan FC）測定其在562 nm波長處吸光度值；根據(jù)待測樣品分子量配置分離膠，加入四甲基乙二胺試劑（美國Sigma公司，貨號T7024），搖勻后即可灌膠，膠上加水液封，待水與膠間出現(xiàn)折射線時，3 min后倒掉膠上層水，吸水紙吸干剩余水分，按照上述方法配置濃縮膠，灌滿后插梳子，待濃縮膠凝固后拔出梳子；取相同量樣品，加PBS溶液至相同體積，沸水浴5 min，上樣進(jìn)行電泳；待溴酚蘭剛跑出終止電泳，取出電泳完成的膠，轉(zhuǎn)膜后加入5%BSA封閉液（北京索萊寶生物科技有限公司，貨號SW3015）；1 h后滴加線粒體琥珀酸脫氫酶（SDH）抗體、細(xì)胞色素C氧化酶（COX）抗體和NADH脫氫酶亞基1（ND1）抗體，購置于博奧森生物技術(shù)有限公司，室溫孵育1 h；滴加二抗工作液，室溫孵育1 h；PBS溶液沖洗3次，每次5 min；滴加ECL超敏發(fā)光液（北京百奧萊博科技有限公司，貨號BL1338）說明書操作，利用凝膠成像分析系統(tǒng)（美國伯樂公司，型號GelDoc XR+）分析目標(biāo)帶的分子量和凈光密度值，利用Image Lab軟件計算灰度值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以（）表示，三組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Snk-q檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組大鼠一般情況空白對照組大鼠呼吸均勻，毛發(fā)光澤，飲食和活動正常。陰性對照組大鼠呼吸急促，間斷喘息，毛發(fā)脫落且光澤欠佳，食欲不振，活動量減少。與陰性對照組大鼠比較，miR-1a-3p組大鼠呼吸急促緩解，毛發(fā)色澤恢復(fù)，食欲恢復(fù)，活動量增加。

2.2 三組大鼠心功能指標(biāo)變化陰性對照組大鼠LVESD和LVEDD顯著大于空白對照組，LVFS和LVEF顯著小于空白對照組（P＜0.05）；miR-1a-3p組大鼠LVESD和LVEDD顯著小于陰性對照組，LVFS和LVEF顯著大于陰性對照組（P＜0.05），表1。

2.3 三組大鼠心肌組織miR-1a-3p表達(dá)陰性對照組大鼠心肌組織miR-1a-3p表達(dá)水平顯著低于空白對照組（P＜0.05）；miR-1a-3p組大鼠心肌組織miR-1a-3p表達(dá)水平顯著高于陰性對照組（P＜0.05），圖1。

表1 三組大鼠心功能指標(biāo)比較（）

注：LVESD：左心室收縮末期內(nèi)徑；LVEDD：左心室舒張末期內(nèi)徑；LVFS：左心室短軸縮短率；LVEF：左心室射血分?jǐn)?shù)；與空白對照組比較，aP＜0.05；與陰性對照組比較，bP＜0.05

2.4 三組大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況陰性對照組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率顯著高于空白對照組（P＜0.05）；miR-1a-3p組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率顯著低于陰性對照組（P＜0.05），圖2。

2.5 三組大鼠心肌組織線粒體超微結(jié)構(gòu)空白對照組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)清晰，粗細(xì)肌絲形成明暗交替且排列整齊有序的紋路，明帶中央黑線清晰，線粒體呈圓形或橢圓形，密集且均勻分布于肌絲間（圖3A、3B）；陰性對照組大鼠心肌組織有脂質(zhì)沉積，肌絲排列紊亂，可見肌絲斷裂或溶解，線粒體呈空泡樣改變（圖3C、3D）；與陰性對照組大鼠比較，miR-1a-3p組大鼠心肌組織脂質(zhì)沉積變少，肌絲排列相對整齊，線粒體形態(tài)恢復(fù)（圖3E、3F）。

2.6 三組大鼠心肌線粒體SDH、COX和ND1表達(dá)陰性對照組大鼠心肌線粒體SDH、COX和ND1表達(dá)水平顯著低于空白對照組（P＜0.05）；miR-1a-3p組大鼠心肌線粒體SDH、COX和ND1表達(dá)水平顯著高于陰性對照組（P＜0.05），表2。

3 討論

圖1 三組大鼠心肌組織miR-1a-3p表達(dá)水平

圖2 三組大鼠心肌細(xì)胞凋亡

圖3 三組大鼠心肌組織線粒體超微結(jié)構(gòu)

表2 三組大鼠心肌線粒體SDH、COX和ND1表達(dá)水平比較（）

表2 三組大鼠心肌線粒體SDH、COX和ND1表達(dá)水平比較（）

注：SDH：心肌線粒體琥珀酸脫氫酶；COX：細(xì)胞色素C氧化酶；ND1：NADH脫氫酶亞基1；與空白對照組比較，aP＜0.05；與陰性對照組比較，bP＜0.05

研究顯示，隨著人口老齡化的加劇，心力衰竭的發(fā)病率逐年上升[7]。同時由于心力衰竭患者以老年人群為主，多合并基礎(chǔ)疾病且營養(yǎng)狀態(tài)相對于成年人差，導(dǎo)致再入院率、致殘率和死亡率均處于較高水平[8]。研究心血管疾病的有效療法成為目前迫切需要解決的問題。大量研究證實，心衰過程中某些基因表達(dá)和調(diào)控的異常發(fā)揮重要作用[9]?；蛑委熓峭ㄟ^將外源正常基因?qū)氚屑?xì)胞，糾正或補(bǔ)償因基因缺陷和異常引起的疾病的治療手段。丁秋蓉等[10]在報道中指出，基因治療在先天性和后天性心血管疾病治療中均具有廣闊的發(fā)展前景。miRNA是一類在發(fā)育和疾病過程中調(diào)控轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)的非編碼RNA分子。越來越多研究顯示，miRNA表達(dá)的變化在心肌肥厚和心衰中發(fā)揮著重要作用[11]。

異丙腎上腺素為常見的β受體激動劑，具有正性肌力和頻率的作用，可致心肌耗氧量增加誘導(dǎo)心肌纖維化和心臟重塑，最終引起心衰[12]。不同注入方法、劑量以及誘導(dǎo)時間對誘導(dǎo)大鼠心衰存在差異。本研究以2.5 mg/kg異丙腎上腺素腹腔注射，連續(xù)4周，成功建立了心力衰竭大鼠模型[13]。超聲心動圖發(fā)現(xiàn)，心力衰竭大鼠LVESD和LVEDD顯著大于空白對照組，LVFS和LVEF顯著小于空白對照組，心肌細(xì)胞凋亡率顯著高于空白對照組，提示心力衰竭大鼠存在心室的重構(gòu)和心肌細(xì)胞凋亡。線粒體為細(xì)胞中制造和提供能量的細(xì)胞器。有文獻(xiàn)報道，心肌線粒體融合和分裂過程失衡，可引起線粒體形態(tài)和功能紊亂，損害心臟結(jié)構(gòu)和功能，參與心力衰竭等心血管疾病的發(fā)生與進(jìn)展[14]。本研究利用透射電子顯微鏡觀察心肌線粒體超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，心力衰竭大鼠心肌組織有脂質(zhì)沉積，肌絲排列紊亂，可見肌絲斷裂或溶解，線粒體呈空泡樣改變，符合以往研究結(jié)果，提示心衰與心肌線粒體形態(tài)及結(jié)構(gòu)的破壞具有一定關(guān)聯(lián)。本研究結(jié)果顯示，心力衰竭大鼠心肌組織miR-1a-3p表達(dá)水平顯著低于空白對照組，提示心肌組織miR-1a-3p的低表達(dá)參與心衰的發(fā)生發(fā)展。miR-1激動劑是經(jīng)過特殊化學(xué)修飾的miR激動劑，可通過模擬內(nèi)源性miRISC復(fù)合物，調(diào)節(jié)靶基因mRNA表達(dá)。與miR mimic比較，miR激動劑具有更高的穩(wěn)定性和活性。本研究經(jīng)尾靜脈注射miR-1激動劑干預(yù)心力衰竭大鼠發(fā)現(xiàn)，與陰性對照組比較，miR-1a-3p組大鼠心肌組織miR-1a-3p表達(dá)水平升高，LVESD和LVEDD減小，LVFS和LVEF增加，心肌細(xì)胞凋亡率降低，提示通過上調(diào)miR-1a-3p水平可有效抑制心力衰竭大鼠心肌病理性結(jié)構(gòu)改變和心肌細(xì)胞凋亡。同時透射電子顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，與陰性對照組大鼠比較，miR-1a-3p組大鼠心肌組織脂質(zhì)沉積變少，肌絲排列相對整齊，線粒體形態(tài)恢復(fù)，提示通過上調(diào)miR-1a-3p水平可有效抑制心肌纖維化，減輕心肌線粒體結(jié)構(gòu)和功能損害。SDH、COX和ND1均位于線粒體內(nèi)膜上，為細(xì)胞電子傳遞鏈上的主要成員。本研究結(jié)果顯示，心力衰竭大鼠心肌線粒體SDH、COX和ND1表達(dá)水平顯著降低，提示心衰存在線粒體膜電位及功能的異常。通過上調(diào)miR-1a-3p水平發(fā)現(xiàn)，心力衰竭大鼠心肌線粒體SDH、COX和ND1表達(dá)水平顯著升高，提示miR-1a-3p有可能通過增加心肌線粒體SDH、COX和ND1表達(dá)，抑制心肌細(xì)胞凋亡，減輕心肌線粒體結(jié)構(gòu)和功能損害，改善心功能，miR-1a-3p有可能成為心衰基因治療的新靶點。

綜上所述，異丙腎上腺素致心力衰竭大鼠心肌組織miR-1a-3p呈低表達(dá)，上調(diào)miR-1a-3p有可能通過增加心肌線粒體SDH、COX和ND1表達(dá)，抑制心肌細(xì)胞凋亡，減輕心肌線粒體結(jié)構(gòu)和功能損害，從而改善心功能。