衛(wèi)雪紅， 臧曉南， 石佳偉， 叢曉梅， 昝佳偉

(中國海洋大學海洋生物遺傳與育種教育部重點實驗室， 山東 青島 266003)

亞硫酸還原酶 (Sulfite reductase, SiR) 催化亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化成硫化物，是亞硫酸同化代謝路徑中的關(guān)鍵酶。有研究表明，SiR活性對擬南芥正常生長是必不可少的，其下調(diào)會引起嚴重的一級和二級代謝適應(yīng)性反應(yīng)[16]。亞硫酸還原酶在高等植物中研究廣泛，目前已在玉米、高粱、水稻等植物中克隆得到亞硫酸還原酶基因，并對酶進行了分析[17]。但在藻類中對亞硫酸還原酶的研究較少。

本文首次克隆和分析了雨生紅球藻的sir基因，并用qRT-PCR方法檢測了sir基因在不同亞硫酸鹽濃度下的變化，驗證了其與硫代謝的相關(guān)性，最后檢測了不同硫酸鹽濃度對雨生紅球藻生長和sir基因轉(zhuǎn)錄水平的影響。本研究為了解雨生紅球藻硫代謝機理奠定了基礎(chǔ)，也為雨生紅球藻培養(yǎng)基的優(yōu)化提供了理論指導。

1 材料與方法

1.1 藻種和培養(yǎng)條件

本實驗選用的雨生紅球藻藻株(HaematococcuspluvialisHOUC9)來源于中國海洋大學藻類遺傳學實驗室。雨生紅球藻綠色生長階段選用的培養(yǎng)基為改良型BG-11培養(yǎng)基(g/L)：0.255 NaNO3，0.045 6 K2HPO4·3H2O，0.68 NaAc·3H2O，0.026 64 CaCl2，0.125 7 MgSO4·7H2O， 0.075 95 Ferric citrate，0.01 EDTA·Na2，0.000 5 VB12，1 mL A5+Co solution(g/L: 28.6 H3BO4，18.1 MnCl2·4H2O，2.22 ZnSO4·7H2O，3.9 Na2MoO4·2H2O，0.79 CuSO4·5H2O，0.494 Co(NO3)2·6H2O)。培養(yǎng)在250 mL三角瓶中，每瓶培養(yǎng)液體積為100 mL。光源為日光燈，光照40 μmol·m-2·s-1，光暗周期為12 h/12 h，溫度為(23±1)℃。取對數(shù)生長期的藻以1∶10的比例接種，每天搖瓶3次。

1.2 引物設(shè)計及合成

所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，見表1。

表1 雨生紅球藻sir基因擴增及定量PCR分析所用引物

1.3 雨生紅球藻DNA的提取

采用DNA提取試劑盒E.Z.N.A.TMHigh Performance (HP) Plant DNA Kit(Omega)，按照有關(guān)說明，提取雨生紅球藻DNA。使用Nanodrop 2000c(Thermo Scientific，USA)測定DNA濃度及OD260/OD280，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性，檢測合格后待用。

1.4 總RNA的提取和cDNA的合成

實驗采用RNA提取試劑盒R6827 Plant RNA Kit(Omega)提取雨生紅球藻總RNA，具體操作參考R6827 Plant RNA Kit試劑盒的說明書。使用Nanodrop 2000c 測定濃度及OD260/OD280，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。 采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser對提取的RNA進行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第一鏈。

1.5 sir DNA克隆

根據(jù)實驗室前期雨生紅球藻轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果[18]，設(shè)計引物sir-1/sir-2(見表1)。以提取的雨生紅球藻DNA為模板，進行PCR擴增。用1%的瓊脂糖凝膠對PCR產(chǎn)物進行電泳檢測，使用膠回收試劑盒(Omega)將清晰的目的條帶進行切膠回收，將膠回收產(chǎn)物與pEASY?-T3 Cloning Vector載體(TaKaRa)進行連接，連接后轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞E.coliDH5α中，然后在含有100 μg/mL氨芐青霉素的固體LB瓊脂培養(yǎng)基上進行篩選。將震蕩培養(yǎng)后的菌液作為模板，M13F/M13R作為通用引物進行菌落PCR檢測；電泳檢測后將篩選得到陽性克隆菌株進行測序鑒定，陽性克隆由北京基因組研究所(BGI)進行測序。

1.6 sir cDNA克隆與測序

根據(jù)DNA序列全長，使用軟件DNAMAN[19]設(shè)計引物sir-3/sir-4(見表1)，以cDNA第一鏈為模板進行PCR擴增，得到雨生紅球藻亞硫酸還原酶cDNA序列。使用CLUSTALX[20]比較DNA和cDNA序列后，預測外顯子和內(nèi)含子序列。

1.7 sir 基因序列分析

應(yīng)用DNAMAN軟件進行氨基酸序列的預測和翻譯。ExPASy ProtParam工具(https://web.expasy.org/protparam/)預測蛋白質(zhì)的等電點和分子量。使用InterPro (http://www.ebi.ac.uk/interpro/) 軟件分析預測雨生紅球藻sir編碼的蛋白質(zhì)家族、結(jié)構(gòu)域和保守序列。使用BLAST程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)和GenBank核酸數(shù)據(jù)庫進行同源性分析[21]。對蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)的分析采用軟件NPS@: GOR4[22]和SWISS-MODEL[23]。應(yīng)用MEGA5.1[24]構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.8 不同Na2SO3濃度下雨生紅球藻sir轉(zhuǎn)錄水平分析

為驗證sir基因的功能，本文研究了亞硫酸鹽濃度對sir基因表達的影響。設(shè)置4個亞硫酸鹽Na2SO3濃度梯度，分別為0、1、10、50 mmol/L。每組設(shè)置3個平行樣，培養(yǎng)10 d，每2天取樣進行sir基因轉(zhuǎn)錄水平的測定。

根據(jù)克隆得到的雨生紅球藻亞硫酸還原酶cDNA完整序列設(shè)計目的基因引物：qsir-1/qsir-2 , 并以核酮糖1,5 -二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)大亞基基因作為內(nèi)參基因，設(shè)計引物rbcL-1/rbcL-2 ，進行實時熒光定量PCR，根據(jù)RQ=2-△△Ct分析數(shù)據(jù)并作圖[25]。

1.9 培養(yǎng)基中不同硫濃度下雨生紅球藻生長和sir轉(zhuǎn)錄水平的分析

為優(yōu)化雨生紅球藻中的硫濃度，本文探究了sir對培養(yǎng)基中不同硫濃度的響應(yīng)，利用實時熒光定量PCR方法，分析了其在不同硫濃度下的轉(zhuǎn)錄情況。BG-11培養(yǎng)基中硫酸鹽MgSO4·7H2O的濃度為0.127 5 g/L，以此為基礎(chǔ)設(shè)計5個MgSO4·7H2O濃度梯度，分別為0、0.05、0.1、0.2和0.5 g/L。每組設(shè)置3個平行樣，培養(yǎng)10 d，每兩天取樣進行生物量的測定和sir基因轉(zhuǎn)錄水平的測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 雨生紅球藻sir序列分析

以雨生紅球藻的基因組DNA為模板，引物為sir-1/sir-2進行PCR擴增，獲得3 885 bp的擴增條帶。以雨生紅球藻RNA反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，引物為sir-3/sir-4進行PCR擴增，獲得2 079 bp的擴增條帶。

對來自H.pluvialis的sir基因預測分析表明，其由3 885個核苷酸組成，如圖1所示，通過將基因組DNA與cDNA序列進行blast比對確定其包含9個內(nèi)含子。內(nèi)含子位置分別位于391～458、756～886、1 085～1 207、1 322～1 559、1 664～1 848、1 979～2 150、2 342～2 580、2 804～3 066和3 130～3 513 bp。sir序列中的內(nèi)含子遵循GT-AG邊界規(guī)則。

(加粗斜體表示內(nèi)含子。方框內(nèi)為起始密碼子ATG和終止密碼子TGA。 The italics represent introns. The potential start codon ATG and stop codon TGA were marked with a character border.)

雨生紅球藻sir的cDNA ORF為2 079 bp，編碼692個氨基酸，MW為75.757 kDa，根據(jù)ProtParam工具預測的pI為9.12。

使用InterPro軟件分析預測雨生紅球藻sir編碼的蛋白質(zhì)家族、結(jié)構(gòu)域和保守序列，如圖2所示，雨生紅球藻SiR蛋白屬于NiR/SiR鐵氧還蛋白超家族，包含兩個結(jié)構(gòu)域：Nitrite/Sulfite reductase ferrdoxin-like結(jié)構(gòu)域和Nitrite/Sulfite reductase 4Fe-4S結(jié)構(gòu)域。Nitrite/Sulfite reductase ferrdoxin-like結(jié)構(gòu)域位于103～159位氨基酸殘基和398～462位氨基酸殘基的位置，Nitrite/Sulfite reductase 4Fe-4S結(jié)構(gòu)域位于199～378位氨基酸殘基和475～610位氨基酸殘基的位置。根據(jù)保守結(jié)構(gòu)域分析，推測獲得的雨生紅球藻sircDNA表達的蛋白質(zhì)可能具有亞硫酸還原酶的功能。

通過NPS@: GOR4預測分析得到SiR的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，包括α螺旋(42.42%)，延伸鏈(16.16%)和無規(guī)則卷曲(41.41%)區(qū)域。結(jié)果如圖3所示，N端有一段長的α螺旋，中間主要為延伸鏈和無規(guī)則卷曲。

圖2 雨生紅球藻SiR InterPro預測結(jié)果

圖3 雨生紅球藻SiR二級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果

使用SWISS-MODEL分析軟件對雨生紅球藻SiR三級結(jié)構(gòu)進行預測分析，如圖4所示，α螺旋、延伸鏈和無規(guī)則卷曲進一步折疊形成雨生紅球藻SiR三級結(jié)構(gòu)。在5’端分布著一段長的α螺旋，這與圖3的二級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果相一致，無規(guī)則卷曲暴露在三級結(jié)構(gòu)的外面，與酶的活性位點區(qū)域相對應(yīng)。

圖4 雨生紅球藻SiR蛋白的三級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果

2.2 多序列比對分析

通過DNAMAN分析軟件將推導的雨生紅球藻SiR的氨基酸序列與來自其他物種的SiR進行多重序列比對，序列比對突出顯示75%的相似性，如圖5所示，結(jié)果表明SiR氨基酸序列的保守性較高。保守氨基酸序列包括QLMKFHGSYMQDDREKRSFG、LKTVFSTVIKNMGSTLAACGDVNRNVM、ADLLAPQSGAYYDVWLDGEKFVS、FLPRKFKVAVTVPGDNSVDLFTNDLG、VRMTGCPNGCARPYMAEMGFVGDGPNSYQ等。其中保守氨基酸序列ADLLAPQSGAYYDVWLDGEKFVS、FLPRKFKVAVTVPGDNSVDLFTNDLG和VRMTGCPNGCARPYMAEMGFVGDGPNSYQ位于Nitrite/Sulfite reductase 4Fe-4S結(jié)構(gòu)域內(nèi)。亞硫酸鹽還原酶在不同物種中序列相似性較高，而且在關(guān)鍵酶域的相似性更高，進一步表明獲得的雨生紅球藻SiR極有可能具有亞硫酸還原酶的功能。

(雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis h1)、團藻 (Volvox carteri f. nagariensis，GenPept No.：XP_002948803.1)、小球藻 (Chlorella variabilis，GenPept No.：XP_005846743.1)、盤藻 (Gonium pectorale，GenPept No.：KXZ50217.1)、膠球藻C-169 (Coccomyxa subellipsoidea C-169，GenPept No.：XP_005649394.1)、衣藻 (Chlamydomonas eustigma，GenPept No.：GAX82049.1))

2.3 分子進化分析

使用分析軟件MEGA5.1對雨生紅球藻SiR的氨基酸序列與其他物種的亞硫酸還原酶基因編碼的氨基酸序列進行分子進化樹分析。如圖6所示，雨生紅球藻(Haematococcuspluvialis)與萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)、團藻(Volvoxcarterif.nagariensis)、小球藻(Chlorellavariabilis)等聚為一支，擬南芥(Arabidopsisthaliana)作為陸地模式生物，與煙草(Nicotianatabacum)、番茄(Solanumlycopersicum)等聚為一支。雨生紅球藻與萊茵衣藻、團藻的親緣關(guān)系較近，與陸生植物和菌屬的親緣關(guān)系較遠。序列的相似性與物種間的親緣關(guān)系保持一致。

(萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)，擬南芥 (Arabidopsis thaliana)，煙草 (Pisum sativum)，團藻 (Volvox carteri f. nagariensis)，衣藻 (Chlamydomonas eustigma)，盤藻(Gonium pectorale)，小球藻 (Chlorella variabilis)，膠球藻屬(Coccomyxa subellipsoidea C-169)，氮化克氏菌屬 (Klebsormidium nitens)，黃連鏈球菌 (Ostreococcus lucimarinus CCE9901)，陶氏鏈球菌(Ostreococcus tauri)，番茄 (Solanum lycopersicum)。該進化樹自展值為1 000，分支前的數(shù)字表示該分支正確性的可靠程度，進化樹下的標尺表示氨基酸替代率，0.1代表每100個氨基酸有10個不同雨生紅球藻HOUC9和其他物種的亞硫酸還原酶氨基酸序列。Bootstrap=1 000. The number before the branch indicates the reliability of the correctness of the branch. The scale under the phylogenetic tree indicates the nucleotide/amino acid substitution rate, and 0.1 indicates that there are 10 differences per 100 amino acids. Molecular evolutionary tree based on sequences of sulfite reductase from H. pluvialis HOUC9 and other species.)

2.4 不同亞硫酸鹽濃度對sir基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

為驗證雨生紅球藻中克隆得到的sir基因與硫代謝的相關(guān)性，本文研究了不同亞硫酸鹽Na2SO3濃度(0～50 mmol/L)對sir基因轉(zhuǎn)錄水平的影響。如圖7所示，前4天，各組基本呈下調(diào)表達。在第6天，添加10、50 mmol/L Na2SO3組顯著上調(diào)。在第8～10天，各組基本都上調(diào)，且sir基因轉(zhuǎn)錄水平隨Na2SO3添加量呈正相關(guān)，說明從雨生紅球藻中克隆的sir基因與亞硫酸鹽代謝途徑是直接相關(guān)的，確定其是雨生紅球藻的亞硫酸還原酶，并在硫代謝途徑中起著重要的作用。

圖7 不同Na2SO3濃度下雨生紅球藻SiR的轉(zhuǎn)錄水平

2.5 培養(yǎng)基中不同硫濃度對雨生紅球藻sir基因轉(zhuǎn)錄水平和生長的影響

為了優(yōu)化雨生紅球藻培養(yǎng)基中的硫濃度，作者研究了BG-11培養(yǎng)基中不同硫酸鹽濃度下的sir基因的轉(zhuǎn)錄情況。BG-11培養(yǎng)基中初始MgSO4·7H2O的濃度為0.127 5 g/L，以此為基礎(chǔ)設(shè)計5個MgSO4·7H2O濃度梯度，分別為0、0.05、0.1、0.2和0.5 g/L。不同硫濃度下雨生紅球藻亞硫酸還原酶的轉(zhuǎn)錄水平如圖8所示，從第2天開始，除0.5 g/L組上調(diào)外，其余各組都開始出現(xiàn)下調(diào)，在第4天出現(xiàn)回調(diào)，0.5 g/L組在第4天達到最高水平，顯著高于其他各組。在第6天五組全部下調(diào)，0.05 g/L組和0.2 g/L組下調(diào)最顯著，除0.1 g/L組外其余組下降到最低水平。在第8～10天，各組整體出現(xiàn)上調(diào)趨勢?？傮w看來，sir基因的轉(zhuǎn)錄水平會隨培養(yǎng)時間呈周期性變化。

圖8 不同硫濃度下雨生紅球藻SiR的轉(zhuǎn)錄水平

在硫?qū)τ晟t球藻的細胞生長影響的實驗中(見圖9)，第2天，0.5 g/L組就表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢，細胞密度顯著高于其他各組；低于0.5 g/L各組沒有明顯差異，也均能夠促進雨生紅球藻細胞的生長。隨后幾天，0.5 g/L組藻細胞密度繼續(xù)顯著增加，從第8～10天開始增長趨于緩慢，但生物量仍遠高于其他五組。這表明適宜的硫濃度對于雨生紅球藻細胞密度起到重要作用，低于0.5 g/L時，各組間的差異并不顯著。當MgSO4·7H2O濃度達到0.5 g/L，雨生紅球藻細胞密度顯著增加。

圖9 雨生紅球藻在不同硫濃度下細胞密度

3 討論

硫與碳、氮一樣，在植物新陳代謝和發(fā)育中起著關(guān)鍵作用。Cys作為硫酸鹽同化途徑產(chǎn)生的第一個還原硫產(chǎn)物，是蛋氨酸(Met)及其衍生物、谷胱甘肽、維生素(如生物素，硫胺素)、輔因子(如鐵-硫簇，血紅素，鉬中心，硫辛酸)和硫化合物的硫供體，它們在植物細胞的生長發(fā)育中起著重要作用[26]。在植物中，無機硫酸鹽還原成硫化物是合成各種含硫化合物(如氨基酸，硫脂和輔酶)的重要代謝過程。ATP硫酸化酶通過ATP激活硫酸鹽后形成腺苷5'-磷酸硫酸鹽(APS)，APS進一步被APS還原酶還原成亞硫酸鹽，亞硫酸還原酶進一步催化亞硫酸鹽到硫化物的六電子還原[27]。

本文從雨生紅球藻中首次克隆得到sir基因的全長，其由3 885個核苷酸組成，包含9個內(nèi)含子，cDNA序列全長2 079 bp，編碼692個氨基酸，MW為75.757 kDa。對雨生紅球藻亞硫酸還原酶氨基酸序列進行分析發(fā)現(xiàn)，SiR蛋白質(zhì)屬于NiR/SiR鐵氧還蛋白超家族。多序列比對顯示SiR的氨基酸與團藻(Volvoxcarterif.nagariensis)的SiR氨基酸具有78%的相似性，與萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)的相似性為72%，這說明亞硫酸還原酶的序列同源性較高。使用MEGA5.1軟件對雨生紅球藻SiR與其他物種SiR進行分子進化樹分析，結(jié)果同樣顯示雨生紅球藻與萊茵衣藻、團藻的親緣關(guān)系較近。表明亞硫酸還原酶氨基酸序列的分子進化關(guān)系與物種進化關(guān)系相一致。

據(jù)報道，硫在綠藻細胞生長中發(fā)揮著重要的作用，小球藻(Chlorella)中的一些含硫化合物在細胞分裂過程中具有調(diào)控作用，而且在細胞核分裂之前會顯著增加[28]。在眼蟲屬(Euglena)和四尾柵藻(Scenedesmusquadricauda)細胞周期中起著關(guān)鍵作用的硫醇和含硫代謝物在缺硫條件下減少，這導致細胞分裂間期的RNA、蛋白質(zhì)等生物大分子的合成以及DNA的復制難以進行，以致細胞核與細胞無法進行分裂，子細胞的產(chǎn)生減少[29-30]。維持谷胱甘肽穩(wěn)態(tài)對植物適應(yīng)干旱脅迫至關(guān)重要。干旱脅迫下，SO2可通過提高谷子葉片中的亞硫酸還原酶等酶的活性，誘導相關(guān)基因表達上調(diào)，從而使葉組織中的半胱氨酸和還原型谷胱甘肽含量增加[31]。有研究表明，SO2逆境脅迫下，玉米葉子的轉(zhuǎn)錄水平隨時間的延長顯著升高，根部也隨時間的延長而有所升高。在相同SO2逆境脅迫條件下，相對于根部而言玉米新葉的亞硫酸還原酶相對表達量最高，花絲(傳輸花粉和向正在發(fā)育的胚中運輸營養(yǎng)物質(zhì))次之。亞硫酸還原酶催化亞硫酸鹽還原成硫酸鹽，不僅能夠抵抗SO2對植株的傷害，還能促進營養(yǎng)物質(zhì)的合成，對植物的生長和發(fā)育具有一定影響[17]。在本研究中，作者分析了不同硫濃度下雨生紅球藻的生物量及亞硫酸還原酶的轉(zhuǎn)錄水平。在0.5 g/L MgSO4·7H2O濃度下，細胞生長明顯得到促進，表明適宜的硫濃度對雨生紅球藻的生長有顯著影響。亞硫酸還原酶的轉(zhuǎn)錄水平結(jié)果說明在不同硫濃度下其轉(zhuǎn)錄水平存在差異，且隨培養(yǎng)時間呈周期性變化。不同亞硫酸鹽濃度對sir基因轉(zhuǎn)錄水平的影響實驗結(jié)果表明，sir基因與亞硫酸鹽代謝途徑是直接相關(guān)的，表明SiR是雨生紅球藻亞硫酸鹽代謝途徑中的關(guān)鍵酶。

綜合以上分析說明硫濃度影響雨生紅球藻亞硫酸還原酶的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)合雨生紅球藻的生長情況，作者建議選擇0.5 g/L MgSO4·7H2O作為適宜雨生紅球藻綠色生長階段的硫濃度，為進一步提高蝦青素的產(chǎn)量提供實驗數(shù)據(jù)和指導依據(jù)。