林輝雄 王 琳 周悅喬 劉志強 林川杰

1.瓊海市人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科 (海南 瓊海， 571400) 2.海南省人民醫(yī)院(海南醫(yī)學院附屬海南醫(yī)院)腫瘤內(nèi)科

肝癌是一種全球范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤，具有較高的轉(zhuǎn)移率、復發(fā)率和死亡率，預后較差[1，2]。目前，肝切除術(shù)、肝移植、放化療、靶向治療等多種治療手段的綜合應用，使肝癌的5年生存率得到了一定提高，但其易復發(fā)和轉(zhuǎn)移，導致預后仍不太理想[3，4]。肝癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移涉及多種基因和信號通路的失調(diào)，因此深入探討腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的內(nèi)在分子機制，對探索新的肝癌治療靶點具有重要意義。

環(huán)狀RNA(circRNA)是一類呈封閉環(huán)狀結(jié)構(gòu)的非編碼RNA分子，近年來越來越多的證實表明，circRNA在癌癥中表達失調(diào)，參與癌細胞增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移等過程，與癌癥進展密切相關(guān)[5～7]。Hsa_circ_0003998是一個剪接序列長度為304 nt的circRNA，位于chr20:47570092-47580435，被證實在肝細胞癌中高表達，與腫瘤大小、分化程度、微血管侵犯和患者總生存期有關(guān)，提示circ_0003998可能參與肝癌的發(fā)生發(fā)展[8]。本研究在此基礎(chǔ)上，體外培養(yǎng)肝癌細胞，深入研究circ_0003998對肝癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；胎牛血清購自美國Gibco公司；青鏈霉素混合液購自北京索萊寶科技有限公司；Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑購自美國ThermoFisher公司；Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；CCK8試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；RIPA裂解液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；實驗用所有蛋白抗體購自上海艾博抗貿(mào)易有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng) 人肝上皮細胞THLE-2細胞和肝癌細胞Huh7、MHCC97、Hep3B、PLC/PRF/5均購自美國ATCC。所有細胞均培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素混合液的DMEM培養(yǎng)液，于37℃、5% CO2的無菌細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞轉(zhuǎn)染及分組 小干擾RNA(siRNA)陰性對照、circ_0003998 siRNA、miRNA inhibitor、miR-218-5p inhibitor由廣州銳博生物技術(shù)有限公司設計合成。使用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑，分別將siRNA 陰性對照和circ_0003998 siRNA轉(zhuǎn)染至Huh7細胞，并記為si-NC組和si- circ_0003998組；另將miRNA inhibitor、miR-218-5p inhibitor分別與circ_0003998 siRNA共轉(zhuǎn)染至Huh7細胞，記為si-circ_0003998+anti-NC組和si-circ_0003998+anti-miR-218-5p組。

1.3.2 qRT-PCR實驗 收集對數(shù)生長期的細胞，采用Trizol法提取細胞總RNA，紫外吸收法進行RNA濃度檢測和純度檢測，提取RNA溶液的A260/A280比值在1.8～2.1之間，純度符合實驗要求。取適量RNA樣品為模板，進行逆轉(zhuǎn)錄反應，合成cDNA。以cDNA為模板進行熒光定量PCR反應，結(jié)果分別以GAPDH和U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算circ_0003998和miR-218-5p的相對表達量。

1.3.3 CCK8實驗 收集對數(shù)生長期的細胞，調(diào)整細胞懸液濃度為5×104/ml，以每孔100 μl接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，置于37℃、5% CO2的無菌細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)24 h、48 h、72 h時，每孔加入10 μl CCK8溶液孵育4 h，使用酶標儀測定450 nm波長處的吸光度值(OD值)。

1.3.4 Transwell實驗 將Transwell小室放入培養(yǎng)板中，小室內(nèi)稱上室，培養(yǎng)板內(nèi)稱下室。取生長至對數(shù)期的細胞，消化、洗滌，用無血清培養(yǎng)液重懸，調(diào)整細胞濃度為2×105/ml。細胞遷移檢測：在下室加入800 μl含血清培養(yǎng)液，上室中加入150 μl細胞懸液，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；取出上室，吸除上室內(nèi)液體，將上室放入加有800 μl甲醇的培養(yǎng)孔中，室溫固定30 min；取出上室，吸干上室固定液，將上室放入加有800 μlGiemse染色液的培養(yǎng)孔中，室溫染色20 min；取出上室，沖洗，用濕棉棒輕輕擦去上室底部膜表面的細胞，晾干，移至載玻片上，封片，顯微鏡下計數(shù)5個隨機視野，統(tǒng)計細胞遷移數(shù)目。細胞侵襲檢測：用無血清培養(yǎng)液稀釋Matrigel基質(zhì)膠(5∶1)，在上室中加入100 μl Matrigel基質(zhì)膠，待膠凝固后，每孔加入100 μl細胞懸液，同時在下室中加入500 μl含血清培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱中孵育24 h，取出上室，沖洗后，用5%戊二醇固定，然后加入Giemsa染色10 min，沖洗，顯微鏡下觀察并計數(shù)細胞侵襲數(shù)目。

1.3.5 雙熒光素酶實驗 本研究通過circBank網(wǎng)站分析發(fā)現(xiàn)circ_0003998與miR-218-5p具有結(jié)合位點。將含有miR-218-5p結(jié)合位點的circ_0003998的序列構(gòu)建雙熒光素酶報告載體，記為circ_0003998 WT，將含有miR-218-5p結(jié)合位點的circ_0003998序列突變，構(gòu)建雙熒光素酶報告載體，記為circ_0003998 MUT，將circ_0003998 WT和circ_0003998 MUT分別與miRNA mimics(miR-NC)、miR-218-5p mimics(miR-218-5p)共轉(zhuǎn)染Huh7細胞，使用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測熒光素酶活性。

1.3.6 Western blot實驗 收集對數(shù)生長期的細胞，使用RIPA裂解液提取細胞總蛋白，使用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白樣品的蛋白濃度，將蛋白樣品在沸水中加入3～5 min，充分變性，然后進行SDS-PAGE電泳分離目的蛋白，轉(zhuǎn)膜，封膜。加入稀釋后的一抗β-catenin(1∶1 000)、N-cadherin(1∶1 000)、Vimentin(1∶500)、E-cadherin(1∶500)、GAPDH(1∶2 500)，4℃孵育過夜，洗膜，加入辣根過氧化酶標記的二抗稀釋液(1∶1 000)，室溫孵育1 h。洗膜，加入顯色液顯色，顯微鏡下曝光、拍照，使用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.4 統(tǒng)計學方法 本研究所有實驗均進行3次生物學重復，實驗數(shù)據(jù)應用統(tǒng)計學軟件SPSS19.0分析，以均數(shù)±標準差表示，兩組間比較采用LSD-t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析檢驗，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 肝癌細胞中circ_0003998、miR-218-5p的表達 qRT-PCR實驗結(jié)果，與人肝上皮細胞THLE-2細胞相比，肝癌細胞Huh7、MHCC97、Hep3B和PLC/PRF/5中circ_0003998相對表達量明顯升高(P<0.05)，miR-218-5p相對表達量明顯降低(P<0.05)，其中Huh7細胞中circ_0003998和miR-218-5p差異表達最明顯。見表1。

2.2 敲減circ_0003998抑制肝癌Huh7細胞增殖 見表2。

2.3 敲減circ_0003998抑制肝癌Huh7細胞遷移和侵襲 Transwell實驗結(jié)果，與si-NC組比較，si-circ0003998組細胞遷移數(shù)目和細胞侵襲數(shù)目均明顯減少(P<0.05)。見圖1和表3。說明敲減circ0003998能抑制Huh7細胞遷移和侵襲。

表1 circ_0003998、miR-218-5p在肝癌細胞中的表達

表2 細胞增殖檢測

組別細胞遷移數(shù)目細胞侵襲數(shù)目si-NC組97.63±11.2455.57±7.05si-circ0003998組36.58±4.74*18.69±2.14*

2.4 circ_0003998靶向miR-218-5p 本研究通過circBank網(wǎng)站分析發(fā)現(xiàn)circ_0003998與miR-218-5p具有結(jié)合位點(見表4)；雙熒光素酶實驗結(jié)果(見表5)，與circ_0003998 wt和miR-NC共轉(zhuǎn)染組比較， circ_0003998 wt和miR-218-5p共轉(zhuǎn)染組的細胞中熒光素酶活性明顯降低(P<0.05)；qRT-PCR實驗結(jié)果(見表6)，與si-NC組比較，si-circ0003998組細胞中miR-218-5p相對表達量明顯升高(P<0.05)。說明Huh7細胞中circ0003998靶向負調(diào)控miR-218-5p的表達，敲減circ0003998上調(diào)miR-218-5p的表達。

表4 circ_0003998與miR-218-5p的結(jié)合位點

表5 熒光素酶活性檢測

表6 circ0003998負調(diào)控miR-218-5p的表達

2.5 抑制miR-218-5p逆轉(zhuǎn)circ_0003998的作用 見表7、表8。

表7 細胞增殖檢測

表8 細胞遷移和侵襲數(shù)目比較

2.6 circ_0003998/miR-218-5p對Wnt/β-catenin通路和EMT通路蛋白表達的影響 見表9、圖2。Western blot實驗結(jié)果，與si-NC組比較，si-circ0003998組細胞中β-catenin、N-cadherin和Vimentin蛋白相對表達明顯降低(P<0.05)，E-cadherin蛋白相對表達明顯升高(P<0.05)；與si-circ0003998+anti-NC組比較，si-circ0003998+anti-miR-218-5p組細胞中β-catenin、N-cadherin和Vimentin蛋白相對表達明顯升高(P<0.05)，E-cadherin蛋白相對表達明顯降低(P<0.05)。說明敲減circ_0003998抑制Huh7細胞中Wnt/β-catenin通路活性，抑制EMT，而抑制miR-218-5p能夠逆轉(zhuǎn)這種作用。

表9 蛋白相對表達量比較

圖2 Western blot檢測蛋白表達

3 討論

近年來研究發(fā)現(xiàn)，circRNA異常表達參與腫瘤發(fā)生和發(fā)展，可作為腫瘤潛在的生物標志物，也可能為腫瘤靶向治療提供新的靶點[9]。如circ_0001649在肝癌組織中低表達，與腫瘤大小和復發(fā)有關(guān)，分析癌組織和癌旁組織表達發(fā)現(xiàn)，circ_0001649對肝癌具有一定診斷價值[10]。circ_103809在肝癌中高表達，體外實驗證實敲除circ_103809抑制肝癌細胞增殖、周期進展和遷移，體內(nèi)實驗證實circ_103809的短發(fā)夾RNA發(fā)揮腫瘤抑制作用[11]。circ_0003998被報道是肝癌的獨立預后因子，且與乙型肝炎和健康者比較，其診斷肝癌的曲線下面積(AUC)為0.833，對肝癌具有較高的診斷價值[8]。此外，circ_0003998在非小細胞肺癌中高表達，可靶向miR-326促進癌細胞增殖、侵襲和化療耐藥[12，13]。

本研究結(jié)果，circ_0003998在肝癌細胞中高表達，體外構(gòu)建敲低circ_0003998表達的Huh7細胞，發(fā)現(xiàn)敲除circ_0003998后細胞增殖、遷移和侵襲能力受到抑制。功能實驗研究表明[14，15]，circRNA在細胞中主要是作為miRNA的海綿起作用。本研究通過生物信息學網(wǎng)站circBank發(fā)現(xiàn)，circ_0003998與miR-218-5p具有結(jié)合位點，雙熒光素報告基因?qū)嶒灪蛁RT-PCR實驗證實circ_0003998靶向負調(diào)控miR-218-5p的表達。進一步在Huh7細胞中抑制miR-218-5p進行回復實驗，發(fā)現(xiàn)抑制miR-218-5p逆轉(zhuǎn)了敲除circ_0003998對Huh7細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用。提示circ_0003998通過靶向miR-218-5p調(diào)控肝癌細胞增殖、遷移和侵襲。

Wnt/β-catenin通路是經(jīng)典的Wnt信號通路，Wnt活化后首先與細胞膜上的跨膜受體結(jié)合，將Wnt信號傳遞至胞質(zhì)蛋白，經(jīng)過一系列復雜反應使胞質(zhì)內(nèi)β-catenin水平增高，進而β-catenin發(fā)生核轉(zhuǎn)移，與核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合激活下游靶基因，其異常活化與惡性腫瘤發(fā)生密切相關(guān)[16-18]。EMT是由上皮細胞轉(zhuǎn)化成間質(zhì)細胞并獲得遷移和侵襲能力的過程，研究表明， Wnt/β-catenin通路活化可誘導EMT發(fā)生從而促進腫瘤細胞生長和轉(zhuǎn)移[19]。本研究分析Huh7細胞中β-catenin蛋白及EMT相關(guān)蛋白N-cadherin、Vimentin和E-cadherin的表達發(fā)現(xiàn)，敲減circ_0003998后Huh7細胞中β-catenin和N-cadherin、Vimentin蛋白表達減少，而E-cadherin表達增多，說明敲減circ_0003998抑制了細胞中Wnt/β-catenin通路活性和EMT發(fā)生，miR-218-5p的回復實驗證實，抑制miR-218-5p后逆轉(zhuǎn)了敲減circ_0003998對細胞中Wnt/β-catenin通路活性和EMT發(fā)生的作用。

綜上所述，circ_0003998在肝癌細胞中高表達，敲減circ_0003998可通過上調(diào)miR-218-5p，抑制肝癌細胞中Wnt/β-catenin通路活性和EMT，抑制肝癌細胞增殖、遷移和侵襲。本研究揭示了circ_0003998對肝癌細胞惡性生物學行為的影響，但其在體內(nèi)是否抑制腫瘤生長還有待進一步實驗研究。