杜貞娜，晏子英，候忠余，李樹(shù)江，張曉勇，楊友聯(lián)

(六盤水師范學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，貴州 六盤水 553004)

【研究意義】獼猴桃(Actinidiaspp.)是一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值極高的水果，其中Vc含量非常豐富，每100 g果肉中含有Vc 100～420 mg，被譽(yù)為“水果之王”[1-5]。近年來(lái)，由于獼猴桃栽培面積不斷擴(kuò)大和獼猴桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，獼猴桃潰瘍病(Kiwifruitbacterialcanker)已成為影響獼猴桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展中最具毀滅性的病害[5-10]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】關(guān)于獼猴桃潰瘍病的病原菌存在較多爭(zhēng)議，Opgenorth等[11]將該病原菌定為丁香假單胞桿菌死李致病變種(Pseudomonassyringaepv.morsprunorum)；而日本、意大利等國(guó)家的學(xué)者根據(jù)病害在當(dāng)?shù)氐募闹鞣秶桶l(fā)病癥狀以及病原菌的物理和化學(xué)特性認(rèn)為，致病病原為丁香假單胞桿菌獼猴桃致病變種(Pseudomonassyringaepv.actinidiae，PSA)[12-13]，該結(jié)論得到學(xué)術(shù)界的普遍認(rèn)可[10，14-19]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，獼猴桃潰瘍病病原菌的鑒定和生防菌的篩選已有研究報(bào)道[10，17，19-28]，但是該病的生物防治仍處于起步階段?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】從獼猴桃感染潰瘍病的染病組織分離致病病原菌，從獼猴桃種植土壤和健康獼猴桃組織中分離細(xì)菌，采用抑菌圈法篩選獼猴桃潰瘍病拮抗菌株，在此基礎(chǔ)上采用形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)相結(jié)合進(jìn)行鑒定，以期探明獼猴桃潰瘍病的致病病原并為該病的生物防治提供有效的菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 獼猴桃 于2017年3月中旬獼猴桃潰瘍病高發(fā)期，在六盤水獼猴桃主產(chǎn)區(qū)米蘿百里獼猴桃產(chǎn)業(yè)帶采集具有典型獼猴桃潰瘍病的樹(shù)枝和主干韌皮部及分泌物，每株發(fā)病植株用解剖刀切取發(fā)病部位長(zhǎng)約10 cm，寬約3 cm的發(fā)病組織2塊，共20個(gè)樣品，裝于自封袋帶回實(shí)驗(yàn)室于4 ℃冰箱保存、備用；于2018年4月在六盤水獼猴桃主產(chǎn)區(qū)米蘿百里獼猴桃產(chǎn)業(yè)帶采集健康的獼猴桃根組織，每株采集3條健康的根，共4株植物12條約長(zhǎng)10 cm的根，將樣品帶回實(shí)驗(yàn)室于4 ℃冰箱保存、備用。

1.1.2 土壤 2018年4月采自六盤水獼猴桃主產(chǎn)區(qū)米蘿百里獼猴桃產(chǎn)業(yè)帶獼猴桃園。鏟棄5～10 cm表土層，挖取約300 g土樣裝于信封內(nèi)，帶回實(shí)驗(yàn)室于4 ℃冰箱保存、備用。

1.1.3 試劑 基因組 DNA 提取試劑盒，北京天根生化科技有限公司生產(chǎn)；16S rRNA 通用引物27f(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492r(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)；KN-F(5’-CACGA TACATGGGCTTATGC-3’)，KN-R(5’-CTTTTCATCCACACACTCCG-3’)，AvrDdpx-F(5’-TTTCGGTGGTAACGTTGGCA-3’)，AvrDdpx-R(5’-TTCCGCTAGGTGAAAAATGGG-3’)。引物均委托成都栢暉生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離與鑒定 ①分離純化。取病健交界處的病組織切成約4 mm×4 mm大小的方形小塊，于75 %乙醇溶液中浸泡1 min后用無(wú)菌水沖洗3次，再將其置于加有10 mL無(wú)菌水的培養(yǎng)皿中，用無(wú)菌剪刀將病組織充分剪碎后靜置1 h。吸取菌懸液150 μl涂布于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，于25 ℃恒溫倒置培養(yǎng)48 h。挑取單菌落在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上劃線培養(yǎng)，經(jīng)多次重復(fù)純化后轉(zhuǎn)至牛肉膏蛋白胨斜面4 ℃保存?zhèn)溆谩＂谛螒B(tài)學(xué)鑒定。將分離純化的病原菌涂布在牛肉膏蛋白胨平板，25 ℃恒溫培養(yǎng)18 h后，觀察菌落特征并進(jìn)行革蘭氏染色和鞭毛染色。③分子生物學(xué)鑒定。采用DNA提取試劑盒提取病原菌基因組DNA；利用細(xì)菌 16S rRNA 通用引物27f和1492r對(duì)各供試菌株DNA進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25 μl：12.5 μl 2×TaqPCR Mastermix，27f和1492r各1 μl，模板DNA 2 μl，加ddH2O補(bǔ)至25 μl。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min。擴(kuò)增完成后，將得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送至成都栢暉生物科技有限公司測(cè)序。④病原菌株雙重PCR特異性檢測(cè)。參照TU等[26]的方法，采用特異性雙重引物(KN-F、KN-R、AvrDdpx- F和AvrDdpx-R)對(duì)病原菌株進(jìn)行雙重PCR特異性檢測(cè)。雙重PCR擴(kuò)增體系為25 μl：12.5 μl 2×TaqPCR mastermix，AvrDdpx-F/AvrDdpx-R和KN-F/KN-R各1 μl，模板DNA 4 μl，加ddH2O補(bǔ)至25 μl。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸50 s，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。⑤序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建。將目標(biāo)菌株序列的測(cè)序結(jié)果在 GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中與已知序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，并查閱相偶聯(lián)的文獻(xiàn)后下載相關(guān)序列[29]，采用 Clustal X進(jìn)行比對(duì)[30]。為達(dá)到排序匹配的最優(yōu)化，用Bioedit 5.0.6手工校正。校對(duì)后的序列采用 PAUP 4.0 beta 10 以最大簡(jiǎn)約法(Maximum parsimony，MP)進(jìn)行分析，以啟發(fā)式搜索(Heuristic Search)獲取系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)各個(gè)分枝的支持強(qiáng)度通過(guò)1000次重復(fù)自展檢驗(yàn)數(shù)值進(jìn)行評(píng)估[31]。

1.2.2 病原菌的致病性檢測(cè) 將新鮮健康的獼猴桃的離體枝條(長(zhǎng)10 cm)插于清水中接種時(shí)，先用蒸餾水沖洗干凈，再用70 %酒精對(duì)枝條表面消毒1 min，然后用1號(hào)昆蟲(chóng)針蘸取細(xì)菌懸液(1×109cfu/mL)針刺接種。每個(gè)菌株接4根枝條，每根枝條接2個(gè)接種點(diǎn)，以無(wú)菌水作對(duì)照。接種后套袋保濕于與15 ℃下，逐日觀察發(fā)病情況。待發(fā)病后，從發(fā)病組織進(jìn)行病原菌再分離。

1.2.3 生防菌的分離、篩選及初步鑒定 ①分離純化。采用土壤稀釋分離法分離土壤樣品中的細(xì)菌。稱取5 g研細(xì)的土壤樣品，加入盛有45 mL無(wú)菌水三角瓶中充分搖勻，取1 mL上清液加入9 mL無(wú)菌水混勻。將其依次稀釋至10-3、10-4和10-5，各取0.1 mL稀釋液涂布牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)平板，3個(gè)重復(fù)，于28 ℃下培養(yǎng)24～72 h，挑選不同類型的單菌落純化后于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。獼猴桃內(nèi)生菌的分離采用常規(guī)組織分離法。將獼猴桃組織表面消毒、剪碎后接種到牛肉膏蛋白胨平板上，倒置于30 ℃恒溫培養(yǎng)24～48 h后，將不同形態(tài)的單菌落轉(zhuǎn)接到牛肉膏蛋白胨平板，純化后編號(hào)，于4 ℃環(huán)境中保存?zhèn)溆?。②生防菌的篩選。將純化保存的細(xì)菌活化后用多點(diǎn)接種法接種于牛肉膏蛋白胨平板上，于28 ℃培養(yǎng)6 h，將培養(yǎng)16 h的獼猴桃潰瘍病病原菌稀釋10-3倍后噴霧接種至該平板上，培養(yǎng)72 h后觀察有無(wú)抑菌圈及抑菌圈大小，篩選出有明顯抑制作用的拮抗菌株。③生防菌的初步鑒定。生防菌形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定同1.2.1。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌

2.1.1 病原菌的形態(tài)學(xué)特征 從采集到的獼猴桃潰瘍病典型病樣中共分離到9株病原菌菌株。從圖1可見(jiàn)，平板上菌落呈圓形，略微隆起，污白色，邊緣全緣，表面光滑，半透明；菌體桿狀，少數(shù)稍彎曲，大小為(1.2～2.1)μm×(0.4～0.6)μm，無(wú)芽孢，革蘭氏染色呈紅色；多數(shù)極生1根鞭毛，少數(shù)為2～3根。

2.1.2 病原菌的分子鑒定及序列分析 ①病原菌雙重 PCR 特異性檢測(cè)。從圖2可見(jiàn)，分離菌株LPSU-B201702、LPSU-B201707、LPSU-B2017012、LPSU-B201713、LPSU-B2017011、LPSU-B201710、LPSU-B201709、LPSU-B201705和LPSU-B201703在290 和492 bp 左右的位置均檢測(cè)到2條擴(kuò)增片段。②病原菌16S rRNA 序列分析及系統(tǒng)樹(shù)的構(gòu)建。將分離菌株的基因組 DNA 作為模板，應(yīng)用16S rRNA通用引物27f/1492r 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，9株菌均獲得片段長(zhǎng)度約1500 bp的目的條帶。將測(cè)序結(jié)果在GenBank上進(jìn)行同源性檢索，下載同源性、可信度高的菌株(表1)參與分析，以Bacillusamyloliquefaciens(菌株號(hào)：GZYCT-9)為外內(nèi)群構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)。

從圖3看出，分離菌株與丁香假單胞桿菌獼猴桃致病變種(Pseudomonassyringae pv.actinidiae)、榛色假單胞菌(P.avellanae)、丁香假單胞桿菌番茄致病變種(P. pv.tomato)、丁香假單胞桿菌茶致病變種(P. pv.theae)聚為1個(gè)大進(jìn)化支，支持率為89 %。其中，菌株LPSU-B2017013、LPSU-B201707、LPSU-B201709和LPSU-B201710與來(lái)自新西蘭的NZ-47、ICMP 18884及來(lái)自葡萄牙的CRAFRU 14.08菌株聚為1個(gè)獨(dú)立亞進(jìn)化分支，支持率為59 %，支內(nèi)無(wú)支長(zhǎng)差異；菌株LPSU-B201711、LPSU-B201705、LPSU-B201702、LPSU-B201712和LPSU-B201703與菌株IKB4、PSA835、tz5、BC7、FJ-21d、KIWI-GengYuhe、M227、IHL1及18YN-PSA-C2聚為另1個(gè)亞進(jìn)化支，支持率低于50 %。

2.1.3 分離菌株的致病性 分離菌株接種到獼猴桃枝條上 7 d 后開(kāi)始顯示癥狀，即在枝干接種點(diǎn)開(kāi)始出現(xiàn)乳白色菌膿溢出，隨后顏色變淺黃色，最后變成銹紅色；感病部位韌皮部細(xì)胞壞死，組織褐變。對(duì)照(無(wú)菌水)接種處理未見(jiàn)癥狀。

2.2 生防菌

2.2.1 分離及篩選 根據(jù)菌落的顏色、形態(tài)及邊緣等培養(yǎng)特征初步確定從土壤和獼猴桃根組織共分離得到35株細(xì)菌，其中，土壤20株，獼猴桃內(nèi)生菌15株。從圖4看出，采用抑菌圈法篩選出的LPSU20180610011、LPSU20180610010和LPSU20180610031菌株對(duì)獼猴桃潰瘍病病原菌具有一定的拮抗效果。其中，分離自獼猴桃根的菌株LPSU20180610011和LPSU20180610010的抑菌圈大小分別為17.5～25.0和15.0～23.5 mm，平均分別為20.8和20.9 mm；分離自土壤的菌株LPSU20180610031的抑菌圈為19.5～27.5 mm，平均為23.7 mm(表2)。

表1 參與構(gòu)建基因系統(tǒng)樹(shù)的菌株信息

2.2.2 病原菌的鑒定 革蘭氏染色和芽孢染色表明，3個(gè)菌株均為革蘭氏陽(yáng)性菌，具芽孢。其中，菌株LPSU20180610010大小為(2.31～3.86)μm×(0.71～1.27)μm，平均為(3.04±0.18)μm×(0.91±0.03)μm，n=20；菌株LPSU20180610011大小為(2.35～3.90)μm×(0.77～1.26)μm，平均為(3.35±0.21)μm×(0.95±0.02)μm，n=20；菌株LPSU20180610031大小為(1.12～2.23)μm×(0.53～0.81)μm，平均為(1.63±0.09)μm×(0.67±0.01)μm，n=20。將3株生防菌的16S rRNA序列在GenBank中比對(duì)的結(jié)果表明，LPSU20180610010和LPSU20180610011與Bacilluscereus、B.thuringiensis及B.oryzaecorticis的相似度達(dá)100 %；LPSU20180610031與B.safensis、B.aerius、B.altitudinis及B.pumilus的相似度達(dá)100 %。結(jié)合形態(tài)學(xué)及16S rRNA分析，篩選出的3株生防菌均屬芽孢桿菌屬(Bacillus)，其中，LPSU20180610010和 LPSU20180610011序列完全相同，可能為該屬同1個(gè)種。

3 討 論

獼猴桃潰瘍病是獼猴桃栽培區(qū)頻繁發(fā)生、危害嚴(yán)重的毀滅性植物病害，現(xiàn)已被列為中國(guó)森林植物檢疫對(duì)象[32]。國(guó)內(nèi)外對(duì)獼猴桃潰瘍病病原菌有很多研究報(bào)道，主要集中在病原菌特點(diǎn)、分類地位、病原菌分離和鑒定及發(fā)病傳播規(guī)律等方面[5-6，9-10，33-40]。該研究從六盤水市獼猴桃產(chǎn)區(qū)染病獼猴桃枝條中分離到的病原菌經(jīng)形態(tài)特征、染色反應(yīng)、雙重 PCR 特異性檢測(cè)和16S rRNA序列分析等方法鑒定表明，其與國(guó)內(nèi)外報(bào)道的丁香假單胞菌獼猴桃致病變種為同1個(gè)種。形態(tài)學(xué)、染色反應(yīng)及16S rRNA序列鑒定均不能準(zhǔn)確鑒定，在16S rRNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)樹(shù)中，分離菌株與丁香假單胞桿菌獼猴桃致病變種、榛色假單胞菌、丁香假單胞桿菌番茄致病變種和丁香假單胞桿菌茶致病變種聚為1個(gè)大進(jìn)化支，支內(nèi)亞分支支持率較低，與親緣關(guān)系較近的榛色假單胞菌等較難分開(kāi)。在雙重PCR檢測(cè)中出現(xiàn)2條特異性檢測(cè)條帶的均為獼猴桃潰瘍病病原菌，充分證實(shí)了雙重PCR檢測(cè)的準(zhǔn)確性[29]。為快速有效防治該病，建議可直接采用雙重PCR進(jìn)行檢測(cè)后采取防治措施，以減少損失。

表2 拮抗菌對(duì)獼猴桃潰瘍病病原菌的抑菌圈直徑

菌株LPSU-B201713、LPSU-B201707、LPSU-B201709和LPSU-B201710與來(lái)自新西蘭的NZ-47、ICMP 18884和來(lái)自葡萄牙的CRAFRU 14.08菌株16S rRNA序列完全相同；菌株LPSU-B201702、LPSU-B201705、LPSU-B201703、LPSU-B201711和LPSU-B201712和來(lái)自我國(guó)云南的18YN-PSA-C2、浙江的tz5、福建的FJ-21d、陜西的KIWI-Geng Yuhe和M227以及新疆的YL5-2菌株遺傳關(guān)系最近，其中LPSU-B201705、LPSU-B201711和LPSU-B201712菌株的16S rRNA序列與以上國(guó)內(nèi)6省分離菌株的完全相同，LPSU-B201702菌株與有1個(gè)堿基差異，表明菌株之間有一定的遺傳差異。

通過(guò)抑菌圈法篩選生防菌株表明，LPSU20180610011、LPSU20180610010和LPSU20180610031菌株有較好的抑菌效果。根據(jù)3株菌株均為桿狀，具有芽孢，結(jié)合16S rRNA序列分析，3株菌均為芽孢桿菌屬細(xì)菌(Bacillusspp.)；根據(jù)菌落特征、顯微形態(tài)及大小以及16S rRNA分析，LPSU20180610010和LPSU20180610011菌株為同1個(gè)種。盛存波等[25]從獼猴桃根際土壤中篩選出芽孢桿菌B56-3菌株對(duì)獼猴桃潰瘍病有較好的防治效果。郭睿文[41]從獼猴桃植株中分離篩選出6株對(duì)獼猴桃潰瘍病有較穩(wěn)定拮抗作用的細(xì)菌，并鑒定出6株菌株分別主要屬假單胞菌屬(Pseudomonassp.)和梭形芽孢桿菌屬(Lysinibacillussp.)。

該研究分離篩選的生防菌株生物學(xué)特性以及田間防效等有待于進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié) 論

該研究從六盤水市獼猴桃產(chǎn)區(qū)染病獼猴桃枝條中分離到9株病原菌，經(jīng)鑒定，其與國(guó)內(nèi)外報(bào)道的丁香假單胞桿菌獼猴桃致病變種為同1個(gè)種。從土壤和獼猴桃根組織分離得到3株細(xì)菌LPSU20180610011、LPSU20180610010和LPSU20180610031均對(duì)獼猴桃潰瘍病病原菌具有一定的拮抗效果，初步鑒定均為芽孢桿菌屬細(xì)菌。